KR101236871B1 - 알레르기 비염을 포함하는 각종 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 알레르기 비염을 유발하는 알레르기 면역반응을 유의하게 억제하며, 상기 질환과 관련이 있는 비만세포의 활성화로 인한 화학매개물질 및 염증물질 생성을 유의하게 억제하여 알레르기성 비염을 포함하는 각종 만성 염증성 알레르기 질환의 예방 및 치료제로서 유효하게 사용할 수 있다.

Description

알레르기 비염을 포함하는 각종 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF ALLERGY DISEASES INCLUDING ALLERGIC RHINITIS}

본 발명은 알레르기 비염을 포함하는 각종 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

2008년 국민건강보험공단의 2002 ~ 2007년 환경성 질환 진료환자 분석에 따르면, 알레르기 비염과 아토피 피부염, 천식 등 환경성 질환으로 치료받은 환자 수는 714만 명으로 2002년보다 무려 29.3% 증가하였다. 질환별로는 2007년 알레르기 비염 환자가 443만 명으로 가장 많아 5년 사이 50.7% 증가하였으며, 천식 환자는 239만 명으로 17.7% 증가하였고, 아토피 피부염은 112만 명으로 집계됐다. 이들 질환들은 해마다 증가하고 있는 추세이다.

알레르기성 비염이나 천식은 병의 원인이 아직 확실치 않아 환경요법, 약물요법, 면역요법 등이 시도되고 있으나, 만성적이고 재발성이어서 치료가 쉽지 않다. 즉 원인이 되는 물질이나 자극물질을 제거하거나 회피하는 회피요법, 기관지확장제와 항염증제제를 이용한 약물요법, 원인물질을 소량씩 주사하여 알레르기 체질을 개선하는 면역요법 등의 치료방법 등이다. 현재 치료제로는 메틸잔틴(Methylxatine)계, 티오필린(Theophylline), 베타 수용체 자극제, 항콜린성 제제 등의 기관지 확장제, 흡입성 비만세포 안정제나 스테로이드제, 트리암시놀론(Triamcinolone) 등의 천식 치료제 및 알레르기 염증을 치료하는 약제, 알레르기 반응을 중화하는 약제들이 사용되며, 이들 중 많은 약제들이 흡입제로 개발되어 있다. 그러나 기존 치료법으로는 치료는 되지만 완치될 수는 없으며, 아직 근본적인 치료법이 될 수 없다는 한계를 극복하지 못하고 있다.

본 발명자들은 이러한 기존의 알레르기성 질환 치료제의 문제를 해결하기위해 한약재를 대상으로 하여 알레르기성 질환에 효과적인 물질을 개발하고자 하였다.

한약재는 오래 전부터 전통적으로 인간의 질병을 치료하고 신체를 보호하는데 사용해 왔으며 현재 여러 질병의 예방 및 치료제로 사용되고 있다. 특히 한약재는 천연약물로써 효과가 복합적이고 장기사용에도 부작용이 적어 현재 양방학적 관점에서 개발되고 있는 많은 합성약품들의 화학적인 부작용으로 인해 관심이 증폭되고 있다.

본 발명자들은 이러한 장점을 가지고 있는 한약재들을 이용하여 부작용이 적고 알레르기성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 물질을 개발하고자, 수많은 한약재들을 비교 분석하여, 비만세포를 대상으로 한 연구 및 동물연구를 통해 알레르기성 질환에 효과적인 조합을 찾기 위하여 노력하였다.

알레르기성 질환에 대한 효과를 조사하기 위해 사용한 비만세포(mast cell)는 세포질 내 과립을 풍부하게 가진 면역세포로써 주로 결체조직과 점막에 존재하면서 외부 자극에 의해 알레르기 염증반응을 일으키는 매개체를 생산, 분비함으로써 알레르기성 염증질환을 유발한다. 또한 이러한 비만세포가 IgE와 알레르겐의 결합을 통해 활성화되면 히스타민과 같은 다양한 화학매개체를 분비하여 점막부종, 기관지 평활근 수축, 점액 분비 증가 등을 일으킴으로써 조기 알레르기 반응에 기여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 비만세포는 이러한 조기 반응에만 국한되어 작용하는 것이 아니라 후기 반응이나 만성 알레르기 반응에도 깊이 연관되며, 비만세포로부터 분비되는 TNF-α는 혈관내피세포의 유착분자의 발현을 증가시켜 호산구 및 T 림프구의 표적기관으로의 유입을 촉진시킨다고도 알려져 있다. 천식에서의 기관지과민성은 호산구 뿐 아니라 비만세포의 수에 비례해서 나타난다. 따라서 비만세포로부터 분비되는 염증물질의 조절이 중요하며, 비만세포와 염증세포의 활성 및 침윤을 억제하는 것이 알레르기성 비염과 천식의 조절 및 치료법 개발의 주요 표적이 될 수 있다.

이러한 비만세포의 활성을 억제하여 과민성 면역반응과 염증반응을 조절하는 것은 다양한 원인에 의해 발생한 알레르기 비염, 천식을 포함하는 각종 알레르기 질환의 진행을 막거나 치료할 수 있는 매우 유효한 방법이 될 수 있다.

이와 같은 비만세포 및 알레르기 반응을 유발시킨 동물모델을 대상으로 하여, 알레르기성 질환에 효과적인 한약재들의 조합을 찾기 위하여 노력한 결과, 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기를 혼합 추출하여 제조한 추출물이 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

< 참고문헌 >

1. 이도연, 최고야, 윤태숙, 전명숙, 김승주, 야스카와켄, 유소연, 김호경. 강활과 방풍의 항염증 상승작용에 관한 연구. 대한본초학회지 2008;23(4):39-44.

2. 全國韓醫科大學 共同敎材編纂委員會, 本草學. 서울: :永林社. 2007.

3. 許浚. 東醫寶鑑. 서울: 大城出版社. 1986: 721-722.

4. 한국약학대학협의회 약전분과회. 대한약전 제8개정 해설서. 서울: 신일상사. 2003: 141.

5. 全國中草藥匯編寫組. 全局中草藥匯編. 北京: 人民衛生出版社, 1983, p.301.

6. 中國醫學科學院 藥物硏究所. 中藥志(第2冊). 北京: 人民衛生出版社. 1975:397-401.

7. 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部). 北京: 化學工業出版社. 2000:144 -145.

8. 雷載權 張廷模. 中華臨床中藥學(上卷). 北京: 人民衛生出版社. 1998; 204-209.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 여러 가지 한약재로 구성되어 부작용이 적고 각종 알레르기성 질환의 예방 및 치료 효과가 뛰어난 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 한약재는 강활 1 ~ 7중량부, 방풍 1 ~ 7중량부, 백출 1 ~ 15중량부, 황금 1 ~ 7중량부, 황기 1 ~ 11중량부로 이루어지는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게는 강활 4중량부, 방풍 4중량부, 백출 8중량부, 황금 4중량부, 황기 6중량부로 이루어질 수 있다.

본 발명을 구성하는 한약재 중 하나인 강활(생약명: Osterici Radix, 학명: Ostericum koreanum Maximowicz)은 뿌리를 건조하여 사용하는 것이 좋고, 성미(性味)가 신고 온(辛苦 溫)하고, 귀경(歸經)은 방광(膀胱) 신경(腎經)이며, 효능은 산한(散寒), 거풍(祛風), 제습(除濕), 지통(止痛)으로 외감풍한(外感風寒)과 풍습(風濕)으로 인한 두신동통(頭身疼痛)과 풍한습사(風寒濕邪)로 인한 관절동통(關節疼痛)을 치료하므로 감모(感冒)나 관절질환에 상용되고 있는 한약재로 알려져 있다. 실제 임상에서는 감모(感冒)로 인한 해열(解熱) 뿐만 아니라 비색(鼻塞), 해수(咳嗽), 두통(頭痛), 전신동통(全身疼痛), 각종 비증(痺證)에 사용되고, 피부소양증에도 응용된다.

방풍(생약명: Saposhnikoviae Radix, 학명: Saposhnikovia divaricata Schischkin)은 뿌리를 건조하여 사용하는 것이 좋고, 성미(性味)가 신감 온(辛甘 溫)하고, 귀경(歸經)은 肝(간) 脾(비) 膀胱經(방광경)이며, 효능은 해표거풍(解表祛風), 승습지통(勝濕止痛), 지경(止痙)하는 작용이 있어 외감표증(外感表證)의 상용약(常用藥)으로 외감표증(外感表證)에 한열허실(寒熱虛實)을 막론하고 사용되어 오한발열(惡寒發熱), 두통신통(頭痛身痛) 등의 풍한증(風寒證)과 풍열(風熱)에 의한 목적인통(目赤咽痛) 등의 증을 치료하는 것으로 알려져 있다. 그리고 풍한(風寒)의 표증(表證)과 풍습(風濕)으로 인한 비통(痺痛)을 치료하는데 사용되어 풍한습비(風寒濕痺), 관절동통(關節疼痛), 사지구련(四肢拘攣) 등 증에 사용된다. 또한 거풍지양(祛風止痒)의 효능이 있어 풍창개선(風瘡疥癬) 혹은 피부소양(皮膚瘙痒) 등을 치료하고 간경(肝經)에 들어가 거풍(祛風), 해경(解痙)하는 효능이 있어 파상풍(破傷風), 각궁반장(角弓反張), 추축경련(抽축痙攣) 등 증에도 사용된다.

황금(생약명: Scutellariae Radix, 학명: Scutellaria baicalensis Georgi)은 주피를 제거한 뿌리를 건조하여 사용하는 것이 좋고, 성미(性味)는 고 한(苦 寒)하고, 귀경(歸經)은 폐(肺) 담(膽) 위(胃) 대장(大腸) 소장경(小腸經)이며, 효능은 청열조습(淸熱燥濕), 사화해독(瀉火解毒), 지혈(止血), 안태(安胎)하여 습온(濕溫), 서온흉민구오(暑溫胸悶嘔惡), 습열비만, 사리(瀉利), 황달(黃疸), 폐열해수(肺熱咳嗽), 고열번갈(高熱煩渴), 혈열토륙, 옹종창독, 태동불안(胎動不安), 붕루(崩漏), 열림(熱淋) 등의 증을 치료하는 것으로 알려져 있다.

황기(생약명: Astragali radix, 학명: Astragalus membranaceus Bunge)는 뿌리를 건조하여 사용하는 것이 좋고, 성미(性味)는 감 온(甘 溫)하고, 귀경(歸經)은 비(脾), 폐경(肺經)에 작용하여 보기고표(補氣固表)하는 효능이 있어 지한(止汗)하고 양기(陽氣)를 온운(溫運)케 하여 이수소종(利水消腫)하는 효능을 나타내며 아울러 정기(正氣)를 고무시켜 탁독생기(托毒生肌)시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 표허불고(表虛不固)로 인한 자한도한(自汗盜汗), 기허실운(氣虛失運)으로 인한 소변불리(小便不利)와 피부수종(皮膚水腫), 기혈부족(氣血不足)으로 인한 창옹내함(瘡癰內陷)과 농성불궤(膿成不潰) 혹은 궤구불렴(潰久不斂) 등에 사용하는 것으로 알려져 있다.

백출(白朮)(생약명: Atractylodis Rhizoma Alba, 학명: Atractylodes japonica Koidz. 또는 당백출 Atractylodes macrocephala Koidz.(=Atractylis ovata Thunb.))은 뿌리줄기를 건조하여 사용하는 것이 좋고, 성미(性味)는 고감 온(苦甘 溫)하고, 귀경(歸經)은 비(脾), 위경(胃經)에 작용하며, 효능은 건비익기(健脾益氣), 조습이수(燥濕利水), 지한안태(止汗安胎)하여 비허식소(脾虛食少), 복창설사(腹脹泄瀉), 담음현운(痰飮眩暈), 수종(水腫), 자한(自汗), 태동불안(胎動不安)의 증상을 치료하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에서, 상기 추출물은 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기로 이루어진 한약재의 열수 추출액을 동결 건조하여 제조하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

이때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복적인 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 직접적인 알레르기 비염의 증상 뿐만 아니라, 알레르기 면역반응의 발병으로 인해 발생하는 각종 알레르기 질환을 예방 및 치료할 수 있다.

특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 천연 한약재로부터 추출하여 장기간 복용해도 부작용이 없고, 알레르기 비염으로 인해 발생하는 비정상적인 알레르기 과민성 면역반응 및 비강(鼻腔) 내 염증반응을 제어하는 효과에 의하여 알레르기 비염을 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 비강 조직 손상을 방지하는 효과에 의하여 알레르기 비염이 오래 지속됨으로 인한 만성 염증을 예방하거나 치료할 수 있다.

이때, 본 발명에서 상기 혼합 한약재를 열수 추출하기 위해 사용되는 물은 보건부 기준하여 음용 기준에 적합한 물을 말하는 것으로, 일반적으로 여과기나 정수기 등으로 여과시킨 정제수, 멸균수, 음이온수 등의 물이나 수돗물, 생수 등을 사용할 수 있다. 하지만, 본 발명에서 혼합 한약재의 유효 성분을 추출하기 위해 사용하는 용매는 물에 한정되는 것은 아니며, 인체에 해롭지 않을 정도로 제거하는 장치를 사용한다면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸에테르 등의 유기 용매를 사용할 수 있다.

그리고 본 발명의 약제학적 조성물을 제조할 때에는 강활 1 ~ 7중량부, 방풍 1 ~ 7중량부, 백출 1 ~ 15중량부, 황금 1 ~ 7중량부, 황기 1 ~ 11중량부를 사용하는 것이 좋은데, 이는 각 한약재당 상술한 최대 사용량을 초과하여 사용하면 다른 필요 성분을 충분하게 사용하지 못하고, 최소 사용량 미만을 사용하면 각 한약재의 유효 효과가 저감되며, 상술한 각 한약재당 사용 범위가 알레르기 질환에 대한 최대의 효과를 나타내는데 바람직하기 때문이다. 이때, 구체적으로 더 바람직하게는 강활 4중량부, 방풍 4중량부, 백출 8중량부, 황금 4중량부, 황기 6중량부로 이루어지는 혼합 한약재에 물을 첨가하고 열수 추출하여 제조하는 것이 좋다.

하지만, 본 발명에서는 물 이외에도 알레르기 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 상기 한약재의 유효 성분을 충분히 추출하면서 인체에 전혀 무해하다면 유기 용매를 사용하여 추출한 다음, 유기 용매를 제거하는 공정을 거치게 할 수도 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 혼합 한약재의 추출물은 상술한 바와 같이 상호 효능 간의 적절한 조화로 인해 알레르기 질환과 관련한 전반적인 병증에 대하여 부작용은 최소화하면서 예방 또는 치료의 시너지 효과를 제공할 수 있게 되는 것이다.

본 발명 약제학적 조성물의 혼합 한약재 추출물은 건조된 상기의 혼합 한약재에 두 배 정도 중량의 정제수를 넣고, 5시간 정도 가열하여 열수 추출한 다음, 추출물을 여과하여 약 40℃에서 감압 농축한 후 동결 건조하여 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 상기 혼합 한약재 추출물을 응용한 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

이때, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.

상기 혼합 한약재 추출물은 그 자체를 사용하거나 약제학적 제제로의 제형화 기준에 허용이 가능한 부형제, 예를 들어 미결정셀룰로오즈, 콜로이드성 이산화규소, 옥수수전분 및 붕해제, 예를 들어 옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분 및 활택제, 예를 들어 글리세릴베헤네이트 및 제피제, 예를 들어 오파드라이 등과 함께 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 한약재 추출물 및 제형화 된 제제는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 복강을 통한 유효 성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 100㎎ 내지 200mg을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

본 발명에 의해 얻어진 혼합 한약재 추출물은 알레르기성 비염의 동물모델인 전신성 아낙필락시스(anaphylaxis) 반응 랫드 모델과 난알부민(ovalbumin) 감작에 의한 알레르기 비염 마우스 모델 및 알레르기 질환의 발병원인인 비만세포의 활성화에 의한 세포모델(in vitro system)을 만들어서, 추출물이 이러한 모델에서 알레르기 면역반응과 염증반응 및 이를 유발하는 비만세포의 활성화를 조절함으로 알레르기 질환의 예방 및 치료효과가 있음을 확인할 수 있다.

하기 실시예에서는 알레르기 면역반응과 염증반응에 대한 실험을 중심으로 하였으나, 이는 일례에 불과한 것으로, 본 발명은 알레르기성 비염과 천식에만 제한되는 것이 아니라 만성적이고 지속적인 알레르기 염증반응으로 인해 발병되는 각종 만성 알레르기 질환에 적용할 수 있는 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 알레르기 비염을 유발하는 알레르기 면역반응을 유의하게 억제하며, 상기 질환과 관련이 있는 비만세포의 활성화로 인한 화학매개물질 및 염증물질 생성을 유의하게 억제하여 알레르기성 비염을 포함하는 각종 만성 염증성 알레르기 질환의 예방 및 치료제로서 유효하게 사용할 수 있다.

도 1은 탈과립 유도제(C48/80)를 처리하여 탈과립 현상이 유도된 비만세포(HMC-1)에서 본 발명 조성물에 따른 효과를 현미경을 통해 촬영한 사진이다.
도 2는 탈과립 유도제(C48/80)를 처리하여 탈과립 현상이이 유도된 비만세포(HMC-1)에서 본 발명 조성물에 따른 히스타민 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 자극원(P/A; PA)을 처리하여 염증반응이 유도된 비만세포(HMC-1)에서 본 발명 조성물에 따른 염증사이토카인 mRNA의 발현 억제효과를 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진이다.
도 4는 자극원(P/A; PA)을 처리하여 염증반응이 유도된 비만세포(HMC-1)에서 본 발명 조성물에 따른 염증사이토카인인 TNF-α(A)와 IL-1β(B)의 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 자극원(P/A; PA)을 처리하여 염증반응이 유도된 비만세포(HMC-1)에서 본 발명 조성물에 따른 염증신호전달분자(MAPK)의 인산화 억제효과를 나타낸 웨스턴블롯(western blot) 사진이다.
도 6은 비만세포 탈과립 유도제(C48/80)를 처리하여 아나필락시 반응이 유도된 동물모델에서 본 발명 조성물에 따른 치사율 감소효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 비만세포 탈과립 유도제(C48/80)를 처리하여 아나필락시 반응이 유도된 동물모델에서 본 발명의 추출물에 따른 히스타민 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).
도 8은 난알부민(OVA) 감작 알레르기 비염 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 알레르기 비염 증상의 임상징후(clinical sign)에 대한 점수를 나타낸 그래프이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).
도 9는 난알부민(OVA) 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 히스타민 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).
도 10은 난알부민(OVA) 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 면역글로불린(IgE) 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).
도 11은 난알부민(OVA) 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 염증성 사이토카인(TNF-α) 분비의 억제효과를 나타낸 그래프이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).
도 12는 난알부민(OVA) 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 비강조직의 개선효과를 현미경을 통해 촬영한 사진이다(CG-50: cromoglygate 50㎎/㎏).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 본 발명의 조성물 제조

아래 표 1의 천연 한약재를 각 사용중량에 맞게 준비하여 2ℓ의 정제수에 넣고, 5시간 가열하여 열수 추출한 다음, 상기 추출물을 와트만 여과지(Whatman N0. 1)로 여과하여 고형분을 제거하였고, 40℃에서 감압 농축한 후 동결 건조함으로써 본 발명의 조성물을 제조하였다. 이때, 얻은 물 조성물의 수율은 36.31%이다.

이를 4℃에 보관하면서 효과 검증을 위한 약물로 사용하였다.

한약재	생약명 (학명)	사용중량(g)
황기	Astragali Radix(Astragalus membranaceus)	6
방풍	Saposhnikoviae Radix(Saposhnikovia divaricata)	4
강활	Osterici Radix(Ostericum koreanum)	4
황금	Scutellariae Radix(Scutellaria baicalensis)	4
백출	Atractylodis Rhizoma Alba(Atractylodes japonica Koidz.)	8
총중량(수율)		26g(36.31%)

실험예 1. 비만세포를 이용한 실험

1-1. 세포배양

본 실험예에서 사용한 사람의 비만세포(human mast cell)인 HMC-1 세포는 10% 비활성화 FBS(inactivated fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 I-MEM(Iscove's modified Dulbecco's medium) 배지를 배양액으로 하여 37℃ 및 5% CO₂의 조건으로 배양하였다.

또한, 랫드의 복강으로부터 비만세포(primary mast cell)를 분리하여 10% 비활성화 FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)(GibcoBRL)이 포함된 RPMI-1640 배지를 배양액으로 하여 위와 동일한 조건으로 배양하였다.

1-2. 탈과립화에 대한 효과 조사

활성화된 비만세포에서의 탈과립(degranulation) 현상에 대한 본 발명 조성물의 효과를 관찰하기 위해, 상기 1-1의 HMC-1 세포를 6-웰 배양판을 이용하여 하룻밤 배양하고, 다양한 농도로 상기 실시예 1의 조성물을 처리하여 30분간 배양한 다음 탈과립 유도제(compound 48/80)를 처리하여 15분간 배양하였다. 배양된 비만세포의 탈과립화 정도를 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.

도 1과 같이, 정상세포에서는 구형의 세포 형태를 유지하고 있으며, 탈과립 유도제를 처리하면 세포막의 손상과 함께 탈과립 세포가 많이 관찰되었다(도 1의 화살표). 한편 본 발병의 조성물은 탈과립 유도제에 의해 유도되는 비만세포의 탈과립화 현상을 억제함으로써 정상세포와 유사하게 비만세포를 안정화시켰다.

1-3. 히스타민(histamine) 생성에 대한 효과 조사

활성화된 비만세포로부터 알레르기 반응 유도물질인 히스타민의 생성 및 분비에 대한 본 발명 조성물의 효과를 조사하기 위하여 상기 1-2와 같이 탈과립을 유도한 다음 효소면역반응법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 이용하였다.

도 2와 같이, HMC-1 및 복강 내 비만세포에서 히스타민의 분비는 세포만 배양하였을 경우에는 거의 검출되지 않은 반면, 탈과립 유도제(compound 48/80) 처리 후 현저히 증가하였다. 또한 본 발병의 조성물을 각각 0.5㎎/㎖, 1㎎/㎖, 2㎎/㎖의 농도로 처리하였을 때, 처리 농도에 의존적이고 유의적으로 히스타민의 분비가 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 활성화된 비만세포로부터 탈과립에 의해 분비되는 알레르기 핵심 유발물질인 히스타민의 분비를 강력하게 억제시킴으로써 항알레르기 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

1-4. 염증사이토카인 유전자 발현에 대한 효과 조사

비만세포에서 발현되는 염증사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-1β 및 MCP-1의 유전자 발현에 대한 본 발명 조성물의 효과를 조사하기 위해 역전사효소 연쇄중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 수행하였다.

상기 1-1의 각 세포를 3㎝ 배양기를 이용하여 하룻밤 배양한 다음, 실시예 1의 조성물을 처리하고 30분간 배양하였다. 여기에 LPS(1㎍/㎖) 또는 PMA(50mM/㎖)/A23187(1μM)을 처리하여 6시간 배양하였다. 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수거한 후 TRIzol 시약(Invitrogen^TM)을 이용하여 토탈 RNA를 분리하였다. 분리된 mRNA와 올리고-(dT)-프라이머 및 Improm-II^TM 역전사 효소(reverse transcriptase)(Promega)를 이용하여 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 70℃에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 대한 PCR을 수행하기 위해 각 세포의 mRNA로부터 합성된 cDNA 1㎍에 각 염증사이토카인 유전자에 대한 특정 프라이머(target-specific primers)(10pmol) 1㎕ 및 10× 완충용액(buffer)(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 1U Tag 중합효소(polymerase) 등을 혼합한 후 변성(denaturation)을 위해 94℃에서 30초, 단련(annealing)을 위해 55 ~ 60℃에서 30초 및 신장(extension)을 위해 70℃에서 60초의 반응조건을 30 ~ 35회 반복(cycles) 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구(internal house keeping gene)로 GAPDHs를 사용하였다.

도 3과 같이, 본 발명의 조성물은 PMA/A23187에 의해 활성화된 비만세포로부터 유도되는 TNF-α, IL-1β의 유전자 발현을 억제함으로써 알레르기 염증반응의 조절 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

1-5. 염증사이토카인 분비에 대한 효과 조사

활성화된 비만세포로부터 염증사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 분비에 대한 본 발명 조성물의 효과를 조사하기 위하여 효소면역반응법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 이용하였다.

상기 1-1의 HMC-1 세포를 24-웰 배양판을 이용하여 하룻밤 배양하고, 다양한 농도의 본 발명 조성물을 처리하여 30분간 배양한 후, 자극원으로 PMA(50mmol/㎖)와 A23187(1μmol)을 처리하여 24시간 배양하였다. 세포 배양액을 수거한 다음, 배양액 내에 존재하는 TNF-α와 IL-1β의 양을 효소면역반응법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)을 이용하여 측정하였다.

도 4와 같이, 본 발명의 조성물은 PMA/A23187에 의해 활성화된 비만세포로부터 분비되는 TNF-α와 IL-1β의 생성을 유의적으로 감소시킴으로써 알레르기 염증반응 조절효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

1-6. 염증신호전달경로에 대한 효과 조사

활성화된 비만세포로부터 염증물질의 생성과 분비를 조절하는 주요 신호전달경로인 MAPK 활성에 대한 본 발명 조성물의 억제효과를 조사하기 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다.

상기 1-1의 비만세포를 30㎝ 배양기를 이용하여 하룻밤 배양한 다음 다양한 농도의 실시예 1의 조성물을 처리하고 30분간 배양하였다. PMA(50mM/㎖)/A23187(1μM)을 처리하여 MAPKs 분자들을 위해서는 15분, NF-κB와 I-κB를 위해서는 30분, COX-2 발현을 위해서는 24시간 동안 각각 배양하였다. 5,000rpm에서 5분간 원심분리하여 각 세포를 수거한 다음 HBSS 용액으로 2회 세척하고 용해 완충액(lysis buffer)(50mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 1% deoxycholate, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1㎍/㎖ aprotinin) 0.1㎖로 용해(lysis)시켜 얼음 위에서 30분간 유지시켰다. 분리된 단백질을 브래드포드 분석 용액(Bradford's assay solution)으로 정량한 다음, 20㎍의 단백질을 2× 샘플 완충액(sample buffer)(100mM Tris-HCl, pH6.8, 200mM dithithreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)과 섞어 100℃에서 3분간 끓인 후 10 ~ 15% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 하였다. 전기영동 후 겔(gel)의 단백질을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 4℃, 30V로 16시간 전이(transfer)시켰다. 전이된 막(membrane)을 10% 탈지유(skim milk)와 실온에서 1시간 반응시켜 블로킹(blocking) 과정을 수행하였으며, 표적단백질 및 β-actin에 대한 일차항체를 0.05% 트윈(Tween)이 함유된 TBS-T 용액으로 희석하여(1:500 ~ 1000) 실온에서 2시간 또는 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 막을 TBS-T로 3회 세척한 다음, 이차항체인 항-IgG 복합 HRP 항체(anti-IgG conjugated HRP antibody)(1 : 1,000)와 1시간 실온에서 반응시키고 ECL 키트(enhanced chemiluminescence kit)(Amersham)를 이용하여 X-선 필름에 감광시켰다.

도 5와 같이, ERK1/2의 경우 세포만 배양하였을 때는 ERK1/2의 인산화가 일어나지 않는 반면, PMA/A23187을 처리한 경우에는 인산화된 ERK1/2의 발현이 확실하게 관찰되었다. 이런 ERK1/2의 인산화 현상은 본 발명의 조성물을 처리하였을 때 강력하게 억제되는 것으로 나타났다.

한편, JNK와 p38 MAPK는 본 발명의 조성물에 의해 변화되지 않는 것으로 나타났다. 따라서 활성화된 비만세포에서 본 발명의 조성물에 의한 염증물질 분비의 억제효과는 주요 염증신호전달분자인 ERK1/2 MAPK의 선택적 차단을 통해 이루어짐을 알 수 있었다.

실험예 2. 동물모델을 이용한 실험

2-1. 아낙필락시스 반응 동물모델 제작

8주령의 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 랫드(rat)에 비만세포 탈과립 유도제(compound 48/80, 8㎎/㎏)를 단회 복강 투여하여 아나필락시 반응 동물모델을 제작하였다.

2-2. 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델 제작

8주령의 BALB/c 마우스(mouse)에 난알부민(ovalbumin, OVA)을 0, 7, 14, 21일에 한번 씩 복강 투여함으로써 전신 알레르기 면역반응을 유도하였고, 마지막 투여 후 7일째 비강으로 난알부민을 감작(nasal sensitization)시킴으로써 국소적 알레르기 비염을 유도하였다.

상기 2-1 및 2-2의 동물군 설정은 생리식염수를 투여한 정상군, 알레르기 비염을 유발한 대조군, 대조군에 본 발명의 조성물을 투여한 투여군으로 나누었으며, 난알부민 마지막 투여 후 7일째부터 비강 감작 전까지 하루에 한번 경구 투여하였다.

2-3. 아낙필락시스 반응 동물모델에서 치사율(mortality)에 대한 효과 조사

상기 2-1의 아낙필락시스 반응 동물에 본 발명의 조성물을 투여한 후 15분 간격으로 120분 동안 치사율(%)을 측정하였다. 치사율은 전체 동물에 대한 사망한 동물의 비율로 표시하였다.

도 6과 같이, 탈과립 유도제에 의해 전신성 아나필락시스 반응이 유발된 동물군에서는 30분에 모두 사망하여 치사율 100%를 나타내었으나, 본 발명의 조성물을 각각 100㎎/㎏와 200㎎/㎏의 용량으로 투여한 동물군에서는 120분까지도 생존하여 치사율이 약 30%로 감소된 것으로 나타났다.

2-4. 아낙필락시스 반응 동물모델에서 히스타민(histamine) 분비에 대한 효과 조사

상기 2-1의 아낙필락시스 반응 동물을 희생한 후 심장으로부터 혈액을 채집하고 혈청을 분리하였고, 효소면역반응법(ELISA)을 이용하여 혈청 히스타민의 양을 측정하였다.

도 7과 같이, 전신성 아나필락시스 반응이 유도된 동물군의 혈청에서 히스타민의 생성이 정상군에 비해 현저하게 증가된 반면, 본 발병의 조성물을 각각 100㎎/㎏와 200㎎/㎏의 용량으로 투여하였을 때에는 투여 용량에 의존적이고 유의적으로 히스타민의 생성이 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 전신성 아나필락시 반응으로부터 히스타민의 급격한 생성과 분비를 강력하게 억제시킴으로써 알레르기 반응의 조절효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2-5. 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델에서 알레르기 비염 증상에 대한 효과

상기 2-2의 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델에서 본 발명의 조성물에 따른 알레르기 비염 증상, 즉 콧물, 재채기, 코 문지르기 등의 임상징후(clinical sign)에 대한 점수를 알레르기 비염 유발 후 15분 동안 조사하였다.

도 8과 같이, 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물군에서는 위의 증상이 현저히 증가되어 점수가 높게 측정된 반면, 본 발병의 조성물을 각각 100㎎/㎏와 200㎎/㎏의 용량으로 투여하였을 때에는 투여 용량에 의존적이고 유의적으로 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 비염의 주요 증상을 감소시킴으로써 알레르기 증상 개선효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2-6. 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델에서 히스타민(histamine) 분비에 대한 효과 조사

상기 2-2의 난알부민 감작 알레르기 비염 동물을 희생한 후 심장으로부터 혈액을 채집하고 혈청을 분리하였고, 효소면역반응법(ELISA)을 이용하여 혈청 히스타민의 양을 측정하였다.

도 9와 같이, 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물군의 혈청에서 히스타민의 생성이 정상군에 비해 현저하게 증가된 반면, 본 발병의 조성물을 각각 100㎎/㎏와 200㎎/㎏의 용량으로 투여하였을 때에는 투여 용량에 의존적이고 유의적으로 히스타민의 생성이 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 비염에서 히스타민의 생성과 분비를 강력하게 억제시킴으로써 항알레르기 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2-7. 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델에서 면역글로불린 E(IgE) 분비에 대한 효과 조사

상기 2-2의 난알부민 유도 알레르기 비염 동물의 혈청으로부터 효소면역반응법(ELISA)을 이용하여 면역글로불린(immunoglobulin E, IgE)의 양을 측정하였다.

도 10과 같이, 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물군의 혈청에서 IgE의 생성이 정상군에 비해 현저하게 증가된 반면, 본 발병의 조성물을 200㎎/㎏의 용량으로 투여하였을 때에는 유의적으로 IgE의 생성이 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 비염에서 IgE의 분비를 억제시킴으로써 알레르기 반응 조절효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2-8. 난알부민 감작 알레르기 비염 동물모델에서 염증사이토카인(inflammatory cytokine) 분비에 대한 효과 조사

상기 2-2의 난알부민 유도 알레르기 비염 동물의 혈청으로부터 효소면역반응법(ELISA)을 이용하여 염증성 사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-β(interleukin-β)의 양을 측정하였다.

도 11과 같이, 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유발된 동물군의 혈청에서 TNF-α의 생성이 정상군에 비해 증가된 반면, 본 발병의 한약재 조성물을 200㎎/㎏의 용량으로 투여하였을 때에는 유의적으로 TNF-α의 생성이 감소되었다.

따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 비염에서 TNF-α의 생성과 분비를 억제시킴으로써 알레르기 염증반응 억제 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

2-9. 난알부민 유도 알레르기 비염 동물에서 비강조직 손상에 대한 효과

상기 2-2의 난알부민 감작으로 알레르기 비염이 유발 동물에서의 비강 조직의 손상에 대한 개선 정도를 비강조직 슬라이드 표본을 제작하여 H&E 염색을 수행한 후 점막표면 손상정도, 후각세포 및 호흡세포 상해정도, 호흡세포층에 있는 술잔세포의 증감정도, 선조직과 점막하 조직의 부종 등을 현미경으로 조사하였다.

도 12와 같이, 알레르기 비염이 유발된 동물의 비강 조직은 점막 표면이 손상되었고, 후각세포 및 호흡세포가 파괴되었으며, 술잔세포가 증가하여 비후되고 선조직과 점막하 부종이 관찰되었으나, 이러한 알레르기 비염 증상들은 본 발병의 조성물을 투여한 동물군에서 모두 개선됨으로써 후각 상피세포층이 잘 보존되었으며, 혈관확장이나 술잔세포의 발달이 감소하는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명의 조성물은 알레르기 비염에서 비강 조직 손상을 막고, 비강 조직을 보호함으로써 알레르기 비염 증상을 개선시킨다는 것을 알 수 있다.

2-10. 통계학적 검정

상기 모든 실험결과는 3회 반복실험에 대한 평균ㅁ표준오차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 통계학적 분석은 그래프패드 프로그램(GraphPad program)의 스튜던트 t-테스트(Student t-test)로 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.

Claims (3)

1. 유효성분으로서 강활, 방풍, 백출, 황금 및 황기로 이루어진 한약재의 혼합 추출물만을 함유하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 한약재는 강활 1 ~ 7중량부, 방풍 1 ~ 7중량부, 백출 1 ~ 15중량부, 황금 1 ~ 7중량부 및 황기 1 ~ 11중량부로 이루어진 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 한약재는 강활 4중량부, 방풍 4중량부, 백출 8중량부 황금 4중량부 및 황기 6중량부로 이루어진 것을 특징으로 하는 알레르기 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.

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