KR101537584B1

KR101537584B1 - 혈소판 응집저해 상승효과를 나타내는 제니핀 및 크로신을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR101537584B1
Application number: KR1020130119792A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 황성연
Original assignee: 안동대학교 산학협력단; 주식회사한국전통의학연구소; 황성연
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2015-07-21
Also published as: KR20150041698A

Abstract

본 발명은 강력한 인간 혈소판 응집저해활성을 나타내는 제니핀(genipin) 및 크로신(crocin)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)을 포함하는 혼합물은 인간 혈소판 응집을 강력히 저해하여 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있다.

Description

혈소판 응집저해 상승효과를 나타내는 제니핀 및 크로신을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING GENIPIN AND CROCIN AS EFFECTIVE COMPONENTS FOR PREVENTION OR TREATMENT OF DISEASES RELATED TO THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 강력한 인간 혈소판 응집저해활성을 나타내는 제니핀(genipin) 및 크로신(crocin)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다.

그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증(thrombosis)을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있으며, 이러한 원인들은 개별적 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전생성을 야기한다.

혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

KR

10-2008-0002770

A

Zhang, et al., 2013. Antutjrombotoc activities of aqueous extract from Gadenia jasminoides and its main constituents. Pharmacology Biology, 51: 221-225 Suzuki, et al., 2001. Antithrombotic effect of geniposide and genipin in the mouse thrombosis model. Plant Med. 67: 807-810 Thushara et al., 2013. Crocin, a dietary additive protects platelets from oxidative stress induced apoptosis and inhibit platelet aggregation. Mol. Cell Biochem 373: 73-83

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 단독으로는 미약한 인간혈소판 저해활성을 나타내는 제니핀과 크로신의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 강력한 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 제니핀(genipin) 및 하기 화학식 2로 표시되는 크로신(crocin)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 상업적으로 이용되고 있는 항혈전제인 아스피린(aspirin)을 더 포함할 수 있다.

상기 혈전성 질환은 혈소판 응집 과다로 인해 야기되는 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 제니핀(genipin) 및 크로신(crocin)을 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)을 포함하는 혼합물은 인간 혈소판 응집을 강력히 저해하여 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 제니핀(genipin), 크로신(crocin), 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)의 1:1 동량 혼합물의 인간 혈소판 응집 저해 활성을 나타낸 그래프이다. 상단 좌측으로부터 용매대조구로서 디엠에스오(DMSO), 아스피린(0.5mg/ml: 2800μM), 아스피린(0.25mg/ml: 1400μM)을 나타내고, 하단 좌측으로부터 genipin(25μg/ml), crocin(25μg/ml), genipin(25μg/ml)+crocin(25μg/ml)의 혈소판 응집능을 평가한 결과를 각각 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 제니핀(genipin, methyl (1S,2R,6S)-2-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-3-oxabicyclo[4,3,0]nona-4,8-diene-5-carboxylate) 및 하기 화학식 2로 표시되는 크로신(crocin, crocetin digentiobiose ester)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)은 각각의 경우 미약한 인간 혈소판 응집 저해활성을 나타내나, 이들 혼합물의 경우 매우 강력한 혈소판 응집 저해활성을 나타내어, 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 사용 가능하다.

상기 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)은 상업적인 방법으로 입수(Sigam, USA)하거나, 화학 합성 또는 치자 등과 같은 약용식물로부터 분리할 수 있다.

본 발명의 제니핀은 최근 혈소판 응집저해 기능이 밝혀진 물질로서 설치류를 이용한 동물실험 결과 20mg/kg 농도 투여시 67.6%의 혈전 생성 억제가 보고되었다(Zhang, et al., 2013. Pharmacology Biology, 51: 221-225).

또한, 본 발명의 크로신은 최근 혈소판 응집저해 기능이 밝혀진 물질로서 시험관 규모에서 콜라겐(collagen)으로 유도된 혈소판 응집을 효율적으로 저해할 수 있음이 보고되었다(Thushara et al., 2013. Mol. Cell Biochem 373: 73-83).

그러나, 현재까지 제니핀과 크로신의 항혈소판 작용 기능의 메커니즘이 정확히 알려진 바는 없으며, 특히 제니핀과 크로신의 혼합물이 혈소판 응집저해기능의 시너지 효과를 나타내는 것은 알려진 바 없다. 따라서, 상기의 제니핀과 크로신의 혼합물은 제니핀 또는 크로신 단독 사용시 나타내는 혈소판 응집저해 효과보다 매우 강력한 시너지 효과를 나타내므로 상기 혼합물은 혈전성 질환과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다.

특히, 제니핀을 200mg/kg으로 경구투여된 설치류(렛트) 실험에서 치사율이 78%로 보고된 최근 논문(Hou et al., 2008. Metabolism and Pharmacokinetics of genipin and geniposide in rats; Food and Chemical Toxicology, 46: 2764-2769)을 고려할 때, 최소량의 제니핀을 이용하는 것이 안전성 확보에 중요하므로, 치사와 같은 심각한 부작용이 없이, 혈전성 질환을 예방 치료하기 위해서는 제니핀과 크로신의 혼합물을 항혈전제로 사용하는 것이 시너지 효과에 의한 사용량 감소를 이룰 수 있다.

상기 제니핀과 크로신의 혼합 비율은 1:0.1~10의 범위에서 조절될 수 있으며, 바람직하게는 1:0.5~5, 가장 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 유효 성분으로서 제니핀과 크로신 이외에도 아스피린(aspirin, acetylsalicylic acid)을 더 포함할 수 있다.

상기 제니핀(genipin)과 크로신(crocin)은 혼합 사용될 경우 매우 강력한 혈소판 응집 저해활성을 나타내지만, 여기에 아스피린을 추가적으로 사용하는 경우에는 훨씬 우수한 시너지 효과를 나타낸다.

상기 제니핀, 크로신 및 아스피린의 혼합 비율은 1:0.1~10:10~100의 범위에서 조절될 수 있으며, 바람직하게는 1:0.5~5:5~50, 가장 바람직하게는 1:1:20의 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 혈전성 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 제니핀과 크로신의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 제니핀과 크로신을 포함하는 혼합물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 제니핀과 크로신의 혼합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 10mg(이 경우 제니핀 0.5 내지 5mg, 크로신 0.5 내지 5mg의 동량 혼합물) , 바람직하게는 2 내지 5mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 제니핀과 크로신의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 제니핀과 크로신의 혼합물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 제니핀과 크로신의 혼합물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 0.2중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.005 내지 0.5g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴 및 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 제니핀과 크로신의 혼합물은 100중량부 당 0.01 내지 약 5중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 제니핀 , 크로신 및 제니핀과 크로신의 혼합물의 혈액응고효소/혈액응고인자 저해 활성 평가

순도 99% 이상인 제니핀과 크로신(이상 Sigma, USA)을 구입하였다. 이들 각각 및 이들의 혼합물을 대상으로 혈액응고 저해 활성을 평가하였다.

혈액응고 효소저해는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임을 측정하였고, 내인성 혈전생성기작인 혈액응고인자 저해활성은 에이피티 타임으로 측정하였다(Sohn et al., 2004. Kor . J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928). 구체적인 측정 방법은 다음과 같다.

트롬빈 타임( Thrombin Time )

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 적당 농도의 제네핀, 크로신 또는 이들의 혼합물을 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA) 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었으며, 결과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time )

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 적당 농도의 제네핀, 크로신 또는 이들의 혼합물을 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA)이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었으며, 결과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.

aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )

혈장(control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA) 100μl 와 적당 농도의 제네핀, 크로신 또는 이들의 혼합물을 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM, USA) 를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었고, 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.

상기 측정법에 따라 제니핀, 크로신 및 제니핀과 크로신의 혼합물의 혈액응고 저해 활성을 0.5mg/ml, 1.5mg/ml, 및 2.5mg/ml 농도에서 평가한 결과, 유의미한 활성을 관찰할 수 없었으며, 이에 따라 제니핀, 크로신 및 이들의 동량 혼합물의 혈액응고 저해활성은 없는 것으로 결론지었다 (결과 미제시).

실시예 2: 제니핀 , 크로신 및 제니핀과 크로신의 혼합물의 혈소판 응집 저해 활성 평가

상기 실시예 1의 각각의 제니핀과 크로신 및 이들의 혼합물을 대상으로 혈소판 응집저해 활성을 다음의 방법에 준해 평가하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다.

혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )

혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 025% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

위와 같은 방법으로 혈소판 응집 저해활성을 평가한 결과, 제니핀은 25μg/ml농도에서 80.1%의 혈소판 응집능(19.9%의 혈소판 응집저해능)을 나타내었으며, 50μg/ml에서는 48.7%의 혈소판 응집능을 나타내어 양호한 혈소판 응집저해활성을 나타내었다. 한편, 크로신은 제니핀보다 미약한 혈소판 응집저해능을 나타낸 바, 25μg/ml농도에서 82.7%의 혈소판 응집능(17.3%의 혈소판 응집저해능)을 나타내었으며, 50μg/ml에서는 76.2%의 혈소판 응집능을 나타내는데 그쳤다. 또한, 제니핀과 크로신을 각각 12.5μg/ml의 농도로 처리한 경우에는 혈소판 응집은 각각 91% 및 101.6%로 혈소판 응집저해 활성을 거의 보여주지 못하였다(표 1, 도 1).

그러나, 제니핀과 크로신의 동량 혼합물은 각각의 물질보다 강력한 시너지의 혈소판 응집저해를 나타내었다. 먼저, 제니핀과 크로신을 각각 12.5μg/ml 농도씩 혼합한 경우 응집율은 76.3%로 저하되어 제니핀 25μg/ml 또는 크로신 25μg/ml을 처리한 경우보다 우수한 응집저해를 나타내었으며, 특히 제니핀과 크로신을 각각 25μg/ml 농도씩 혼합한 혼합물의 경우 단지 23.6%의 혈소판 응집(76.4%의 혈소판 응집저해능)을 나타내었다. 이는 제니핀 50μg/ml 농도에서 48.7%의 혈소판 응집능, 크로신 50μg/ml 처리시에 76.2%의 혈소판 응집능을 나타냄을 고려할 때 매우 강력한 혈소판 응집저해 시너지 효과를 나타냄을 알 수 있었다(표 1, 도 1). 실제 각각을 50μg/ml 농도로 혼합한 경우 혈소판 응집은 0.2% 정도로 거의 나타나지 않아 혈소판 응집저해율은 100%에 가깝게 나타났다. 이는 혈소판 응집 저해제로 임상에서 사용하고 있는 아스피린(상품명: 프로텍트, 바이엘)이 500μg/ml 농도에서 혈소판 응집이 37.5% 임을 고려하면, 제니핀과 크로신 혼합물의 혈소판 응집저해 효능을 짐작할 수 있다.

시료/대조구	강도 (Amplitude :ohm)	기울기 (Slope)	연장시간 (Lag time:초)	^*하강면적 (Area under)	응집율 (%)
디엠에스오(DMSO)	17	3	31	123.6	100.0
아스피린(500μg/mL, 2,800μM)	8	1	41	46.4	37.5
아스피린(250μg/mL, 1,400μM)	16	2	25	102.5	82.9
제니핀(50μg/mL)	8	1	40	60.2	48.7
제니핀(25μg/mL)	14	2	26	99.0	80.1
제니핀(12.5μg/mL)	17	3	32	112.5	91.0
크로신(50μg/mL)	14	2	26	94.2	76.2
크로신(25μg/mL)	14	2	28	102.2	82.7
크로신(12.5μg/mL)	17	3	28	125.7	101.6
제니핀(50μg/mL) + 크로신(50μg/mL)	0	0	58	0.3	0.2
제니핀(25μg/mL) + 크로신(25μg/mL)	4	1	58	29.2	23.6
제니핀(12.5μg/mL) + 크로신(12.5μg/mL)	13	2	32	94.4	76.3

* 하강면적이 작을수록 혈소판 응집이 나타나지 않음을 의미함

한편, 하기 화학식 3으로 표시되는 제니포사이드(geniposide, (1S,4αS,7αS)-1-(β-D-Glucopyranosyoxy)1,4a,5,7a-tetrahydro-7-(hydroxymethyl)cyclopenta [c]pyran-4-carboxylic acid methyl ester)는 제니핀에 포도당 1분자가 결합된 배당체로 이미 혈소판 응집저해능이 보고(Zhang, et al., 2013. Pharmacology Biology, 51: 221-225)되어 있으나, 그 자체로는 미약한 혈소판 응집저해효과가 나타나며, 제니핀에 비해서는 5배 이상의 용량에서 제니핀과 유사한 혈소판 저해활성이 나타남을 확인하였다(표 2). 또한, 제니포사이드와 크로신의 혼합물은 시너지 효과가 유의성 있게 나타나지 않아(표 2), 제니핀과 크로신의 혼합물 사용의 시너지 효과가 특이적임을 확인하였다.

[화학식 3]

시료/대조구	강도 (Amplitude :ohm)	기울기 (Slope)	연장시간 (Lag time:초)	^*하강면적 (Area under)	응집율 (%)
디엠에스오(DMSO)	19	3	23	134.6	100.0
아스피린(500μg/mL, 2,800μM)	5	1	10	37.6	27.9
아스피린(250μg/mL, 1,400μM)	12	2	16	68.0	50.5
제니포사이드(250μg/mL)	11	2	38	78.3	58.1
제니포사이드(25μg/mL)	21	3	20	143.9	106.9
제니포사이드(25μg/mL) + 크로신(25μg/mL)	14	2	22	104.5	77.6

실시예 3: 제니핀과 크로신의 혼합물의 혈소판 응집 저해활성에 있어 아스피린과의 시너지 효과 평가

제니핀과 크로신의 동량 혼합물에 아스피린(시판용 혈소판 응집저해 항혈전제)을 추가로 혼합하는 경우 시너지 효과가 나타나는지를 검토하였다.

먼저, 표 3에 나타낸 바와 같이, 제니핀 25μg/ml에 아스피린 250μg/ml을 혼합한 경우, 혈소판 응집률의 변화는 1% 이내로 나타나 80.1~81.1%의 응집율을 나타내었다. 또한, 크로신 25μg/ml에 아스피린 250μg/ml을 혼합한 경우, 역시 혈소판 응집률의 변화는 1.7% 이내로 나타나 81.0~82.7%를 나타내었다.

그러나, 제니핀과 크로신 혼합물(각각의 농도 12.5μg/ml: 총 25μg/ml)에 추가적으로 아스피린을 250μg/ml 농도로 첨가한 경우, 아스피린 첨가전 보다 응집율이 76.3%에서 29.7%로 낮아져, 매우 강력한 시너지 효과의 혈소판 응집저해를 나타내었다. 본 결과는 정확한 기작은 알 수 없으나, 제니핀과 크로신 혼합물은 기존 아스피린 사용 환자나 일반인에게 시너지 효과를 나타내어 더욱 더 제니핀과 크로신의 사용량을 감소시킬수 있음을 의미하며, 또한 위장장해, 위출혈 등의 부작용을 수반하는 아스피린 사용량을 감소시킬 수 있음을 제시한다. 따라서, 본 결과는 최종적으로 혈소판 응집 저해 기작에 있어 제니핀, 크로신, 아스피린은 모두 상호 다른 표적을 가지고 있음을 시사하고 있다.

시료/대조구	강도 (Amplitude :ohm)	기울기 (Slope)	연장시간 (Lag time:초)	^*하강면적 (Area under)	응집율 (%)
디엠에스오(DMSO)	17	3	31	123.6	100.0
아스피린(500μg/mL, 2,800μM)	8	1	41	46.4	37.5
아스피린(250μg/mL, 1,400μM)	16	2	25	102.5	82.9
제니핀(25μg/mL)	14	2	26	99.0	80.1
제니핀(25μg/mL) + 아스피린 (250μg/mL)	16	2	32	100.3	81.1
크로신 (25μg/mL)	14	2	28	102.2	82.7
크로신(25μg/mL) + 아스피린 (250μg/mL)	16	2	36	100.2	81.0
제니핀 (12.5μg/mL) + 크로신 (12.5μg/mL)	13	2	32	94.4	76.3
제니핀 (12.5μg/mL) + 크로신 (12.5μg/mL) + 아스피린 (250μg/mL)	5	1	33	36.8	29.7

실시예 4: 제니핀 , 크로신 및 제니핀과 크로신의 혼합물의 인간 적혈구 용혈 활성

상기 실시예 1의 제니핀 및 크로신 혼합물의 인간 적혈구 용혈활성을 측정한 결과, 제니핀 및 크로신 각각의 경우와 마찬가지로 인간 적혈구 용혈활성은 200μg/ml 농도까지는 나타나지 않았다(표 4). 따라서, 제니핀과 크로신의 혼합물 사용은 부가적인 급성 독성은 나타내지 않는 것으로 확인하였다.

시료	인간 적혈구 용혈활성 (%)
제니핀 (100μg/ml)	5.4±0.24
크로신(100μg/ml)	1.6±0.51
제니핀(100μg/ml) + 크로신(100μg/ml) 혼합물	5.0±0.79
트리톤 X-100 (triton X-100) 0.1%	100.0±1.20
엠포테리신 B (amphotericin B) 62μg/ml	97.0±3.55

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 제니핀(genipin) 및 하기 화학식 2로 표시되는 크로신(crocin)을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 과다로 인해 야기되는 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]
제 1항에 있어서, 상기 유효성분은 아스피린(aspirin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 기재된 제니핀(genipin) 및 크로신(crocin)을 함유하는 혈소판 응집 과다로 인해 야기되는 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.