JP2010195779A

JP2010195779A - クロシンの加水分解物

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Publication number: JP2010195779A
Application number: JP2010031290A
Authority: JP
Inventors: Thomas Eidenberger; アイデンバーガー，トーマス
Original assignee: Omnica GmbH
Current assignee: Omnica GmbH
Priority date: 2009-02-18
Filing date: 2010-02-16
Publication date: 2010-09-09
Also published as: US8569247B2; US20100210572A1; CN102802636A; CN102802636B; WO2010094745A1

Abstract

【課題】クロシンまたはその誘導体を含有する植物の加水分解物から誘導される組成物の提供。
【解決手段】組成物は、相当量のクロセチンモノエステルを含有する。また、植物抽出物中に存在するクロシンを加水分解する方法、さらにその使用。具体的には、クロシンを含有する植物がクチナシまたはサフランであること、また前記クロシンの酸性加水分解はHCl、リン酸またはシュウ酸を使用して行われることであり、化粧品、薬品または栄養補助または規定食として用いられ、鬱、癌、婦人科の炎症、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性、肝炎、肝硬変、肝臓癌の治療、予防または改善、高コレステロールの低下、胆汁分泌調節または脳の健康の向上における効能を有する組成物。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、クロシンまたはその誘導体を含有する植物材料の加水分解物から誘導される、天然に存在する量に対して増加した量のクロセチンモノエステルを含む組成物に関する。本発明はまた、植物抽出物中に存在するクロシンを加水分解する方法を提供し、さらにその使用に関する。

発明の背景
クロシン/クロセチンは明るい黄色として千年以上にわたって使用されてきた。通常、着色剤は乾燥サフラン柱頭(雌しべ頂端)またはクチナシの乾燥果実から抽出される。

サフランは、有史以前のギリシャ時代からおそらくその栽培が始まったCrocus sativus L.(クロッカス・サティバスL)の柱頭を乾燥させることによって得られる。着色剤１gを得るには約200個の柱頭が必要である。その強い黄色-赤色の原因であるサフランの基本的構成要素は、水溶性カロテノイド類の族のシス-及びトランス-クロシンである。

サフラン(クロッカス・サティバス)は野菜ではないが、世界の地域によっては種々のクロッカス種の球茎が田舎の小作農により食されている。サフランは地球上で最も高価な香辛料の一つであり、心地よい香辛料のきいた、刺激的な辛味と長持ちする香りがある。幸運なことにサフランは少量でも香味に関しては長持ちする。お茶に浸すだけでなく、ファンシーロール、ビスケット、米及び魚などの多くの食品の味付けに使用される。サフランの細い乾燥花柱頭が、真のサフラン商品を構成する。卸価格と小売価格は市場で高額であるが、サフランは黄色がかった橙色の天然染料として常に人気がある。

クチナシ(ガーデニア・ジャスミノイド：Gardenia jasminoides)は黄色染料に使用されているもう一つの一般的な植物である。またクチナシは日本及び中国で、消炎、利尿、解熱、止血及び胆汁排出促進作用の薬草として使用され、打撲傷の処置に使用できる。花とワインと一緒にした薬草ペーストは、捻挫(twist、sprain)、筋違い、挫傷及び膿瘍に湿布として使用され；腱、靱帯、関節及び筋肉の損傷に非常に有効である。さらにこれは、鎮静、解熱、利尿、胆汁分泌促進及び抗炎症効果をもつ伝統的なアジアの薬品処方で重要な生薬である。クチナシ黄色は、生薬として日本薬局方に列記されている。中国の薬では、抗炎症、解熱、収斂及び止血機能をもつと考えられ、並びに乳腺炎の治療に使用されている。炎症、痛みがあり腫れた目及び膿瘍にも使用される。

クチナシ黄色は黄色の食品着色剤で、カロテノイド族の一員である。その主顔料はクロシン/クロセチン誘導体である。クチナシ黄色は、クチナシの実から水またはエタノールで抽出して得られる。クチナシ黄色の主成分はクロシンであり、現在では天然黄色顔料として一般的に使用されている。これは他のカロテノイド類と比較して非常によく水に溶ける。クチナシ黄色は、日本では既存の食品着色剤のリストに列記されている。たとえばクチナシ黄色顔料は、黄飯(クチナシ果実で着色した黄色い飯)及び栗甘露煮(クチナシ果実で着色しシロップに漬けた黄色い栗)などの日本の伝統食で食品着色剤として使用されてきた。

クロセチンは、天然のカロテノイドジカルボン酸(8,8’-ジアポ-ψ,ψ-カロテン二酸)であり、これは285℃の融点をもつ煉瓦状の赤い結晶である。化学的にはクロセチンはポリエンジ-カルボン酸(8,8’-ジアポカロテン-8,8’-ジオリック酸)であり、その中心単位は７個の共役二重結合と４個の鎖メチル基からなる。クロセチンの末端基(カルボキシル基)の一方または両方がグルコースまたはゲンチオビオースでエステル化されると、二つの等しいか、または異なる末端基を持ち得るクロセチンのジエステルが生成する。

一側面において、クロシンは、以下に示される化学構造：
をもつビス(6-O-β-D-グルコピラノシル-β-D-グルコピラノシル)エステル、α-クロシン、またはクロセチンのジ-ゲンチオビオースエステルである。

より広い意味では、クロシンは天然カロテノイドも包含するが、糖部分はジゲンチオビオースに限定されておらず、任意の糖類とジカルボン酸クロセチンとの縮合生成物として形成されたジエステルと定義することができる。これは以下に示される：
｛式中、Rは任意の糖残基であり、Rはそれぞれ独立して同一でも異なっていてもよい｝。

クロセチンの化学構造を以下に示す：
これはクロシンの中心核であり、サフランの色のもととなる化合物でもある。クロセチンは商業的にはクロシンを加水分解してクロシンのジゲンチオビオースを除去することにより得られる。

クロシンは、強力な酸化防止剤、並びに抗鬱剤、癌の予防、精神機能の向上、高コレステロールの低下、及び／または炎症予防に有用であることが判明している。クロシン、クロセチン及びその誘導体は、胆汁分泌を大きく刺激し得ることも判明しており、多くの症状の改善に有用である。中国では、サフラン多配糖体(multi-glycoside)錠剤は、環状動脈性心疾患及びアンギナの治療用の新規経口薬として承認されている。この薬物製品はサフランから抽出された一連の成分からなり、中でもクロシンは主な有効成分及び標準的コントロールとして確立されている。

クロシンは特徴的な水溶性カロテノイドであり、その強い薬理学的作用で研究上の注目を集めている。最新の研究では、クロシンはインビボ吸収に不適切な大きな分子構造をもつことが示されている。クロシンは動物及び健常被験者に経口投与後に吸収されなかったことも知見された(Phytomedicine 14、2007、633-36)(非特許文献１)。

クロセチンは体内におけるクロシンの活性代謝産物の一つであると認識されているが、繰り返し経口投与した後でもクロセチン増加は顕著ではなく、このことはクロセチンが体内で蓄積せずに迅速に排除されたことを示している。考えられる一つの理由は、クロセチンが水に不溶性ではないかということである。低水溶性であると、食品、飲料、薬剤または栄養補助食品中での多くの実用化が制限され、インビボでの生物学的利用性も低下する。

クロシン/クロセチンの生物学的及び薬理学的活性における研究は、インビトロでの実験または動物から得られたものであるが、クロシン/クロセチン及びその誘導体の生物学的利用性について考慮した研究は殆どない。

従って、クロシンまたはクロセチンに対し増大した生物学的利用性をもつ好適なクロシン/クロセチン誘導体が必要とされている。

Phytomedicine 14, 2007, 633-36

一側面において、本発明は、意外にもクロシンまたはその誘導体を含有する植物材料加水分解物から誘導される組成物を提供する。この加水分解物は、抽出物などのクロシン材料に見いだされる天然由来のクロセチンモノエステルの欠如に対して増加量のクロセチンモノエステルを含む。たとえば、クロセチンモノエステルは、クロセチンモノグルコシルエステル、クロセチンモノゲンチオシルエステルまたはその混合物である。

通常、本組成物は、クロシンを含有する植物材料に自然に存在するモノエステル量に対して１重量％を超える増加含有量のクロセチンモノエステルを含む。クロセチンモノエステルは自然状態では存在しないので、この加水分解物には増加した量のモノエステルがある。

一側面において、本発明の加水分解組成物は、クロシン、クロセチンまたは他のクロセチンモノエステル類を含むことができ、クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比は、約(０〜25)：(１〜80)：(１〜60)であるか、クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比は約(５〜15)：(10〜60)：(５〜50)であるか、クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比は約(10〜15)：(30〜50)：(30〜40)であるか、またはクロシン：モノエステル：クロセチンの重量比は約10対約40対約40である。

通常、クロシンを含む植物はクチナシまたはサフランである。

本発明は、本明細書に記載の加水分解組成物を製造する方法も提供し、加水分解物は酸性または塩基性条件下の加水分解により得られる。たとえば酸性加水分解ではHCl、リン酸またはシュウ酸を使用する。

本明細書に記載の加水分解物は、化粧品、医薬品、栄養補助食品中で、または食品サプリメントとして使用することができる。

本明細書に記載の加水分解物は、鬱、癌、婦人科の炎症、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性、肝炎、肝硬変、肝臓癌の治療、予防または改善、高コレステロールの低下、胆汁分泌調節または脳の健康の向上で使用することができる。

図１は、本発明の一態様の加水分解物のHPLCクロマトグラムである。図２は、本発明の別の態様の加水分解物のHPLCクロマトグラムである。図３は、本発明の別の態様の加水分解物のHPLCクロマトグラムである。図４は、本発明の別の態様の加水分解物のHPLCクロマトグラムである。図５は本発明の別の態様の加水分解物のHPLCクロマトグラムである。図６は、本発明の加水分解物によるAChE阻害のグラフ表示である。

本明細書及び請求の範囲において、「〜を包含する」及び「〜を含む」なる用語は制限がない用語であり、「〜を包含するが、これに限定されない」を意味するものと解釈すべきである。これらの用語は、より制限的な用語「〜から本質的になる」及び「〜からなる」を包含する。

本明細書中及び付記の請求の範囲で使用するように、「ひとつの(a、an)」及び「その(the)」なる単数形は、他で明確に記載しないかぎり複数も言及することに留意すべきである。同様に「ひとつの(a、an)」、「一つ以上の」及び「少なくとも一つ」なる用語は、本明細書中で交換可能に使用できる。「〜を含んでいる」、「〜を包含している」、「〜を特徴とする」及び「〜をもつ」なる用語も交換可能に使用できると留意すべきである。

他で定義しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書中に特記した全ての刊行物及び特許は、本発明に関連して使用されるかもしれない刊行物に報告されている化学薬品、装置、統計分析及び方法論の記載及び開示を含めて、全ての目的に関してその全体が参照として含まれる。本明細書に引用された全ての文献は、当業者のレベルを示すものとして解すべきである。本明細書の記載はすべて、本願発明がそのような開示に先行しないと認めるものと解釈すべきではない。

本発明は、クロシン及びその誘導体を含有する植物の加水分解物から誘導される、クロセチンのモノエステルを含む組成物に関する。

また本発明は、クロシンまたはクロシンの誘導体を含有する植物材料を加水分解することにより、本明細書に記載の組成物を製造する方法を提供する。

クロシンまたはその誘導体を含有する植物材料は、サフラン及びクチナシの群から選択され、市販のサフランも含まれる。

材料の加水分解は酸性または塩基性条件下で実施することができる。一側面において、加水分解は酸性水溶液で実施する。酸性水溶液下では、クロシンまたはその誘導体は加水分解を受け、クロセチンのモノエステルになるか部分的にモノエステルになり、その後さらなる加水分解によりクロセチンを生成する。

クロセチンのモノエステルは以下の通りである：
基「R」は、ゲンチオビオシル、グルコシルまたは他の可能なグリコシルを表す。

Rがゲンチオビオシルであるとき、クロセチンのモノエステルは、クロセチン-モノ-ゲンチオビオシドエステルであり、たとえばトランス型及びシス型異性体が挙げられる。

Rがグリコシルであるとき、クロセチンのモノエステルは、クロセチン-モノ-グリコシドエステルであり、たとえばトランス型及びシス型異性体が挙げられる。

かくして本発明は、クロセチンモノエステルに富んだ組成物を提供する。(単数または複数種類の)モノエステルは、１重量％を超え、特に約10重量％を超え、さらに約40重量％を超えて単離体中に存在する。

本発明の加水分解物は、クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、結晶化、アフィニティクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、蒸留などの当業界で知られる一種以上の方法によりさらに精製することができる。特定のエステル(たとえばクロセチンモノエステル)の同定は、当業者に知られる方法により実施でき、たとえば¹H NMR、化学分解、クロマトグラフィー及び分光法、特に単離した加水分解物の特徴付けには等核または異核二次元NMR法が挙げられる。

「精製した」または「単離した」なる用語は、上記のアントシアニン抽出物から一種以上のアントシアニンの精製及び／または単離を参照する際に使用する。当業者に知られる慣用法を使用して、アントシアニン抽出物の種々の成分を精製材料に分離することができる。本発明の一側面において、抽出物の(単数または複数種類の)アントシアニンは当業界で知られる方法により実質的に精製且つ単離される。精製化合物の純度は通常、少なくとも約90重量％、好ましくは少なくとも約95重量％、最も好ましくは少なくとも約99重量％、さらにより好ましくは少なくとも約99.9重量％(たとえば約100重量％)である。

種々の糖部分により、クロセチンの上記モノエステルには種々の態様がある。クロセチン-モノ-ゲンチオビオシドエステル(トランス-またはシス-)は得られる加水分解物の本体である。このモノエステルは種々の用途で主導的な役割を担う。同時にクロセチン-モノ-グリコシドエステル(トランス-またはシス-)も有用であるが、これは主成分ではない。本明細書に記載の情報に基づいて、クロセチンのモノエステルはクロシンの(単数または複数種類の)活性成分の増大した生物利用能を提供すると考えられる。この意外な結果は以下の実施例で言及する。

加水分解条件を適当に選択することによって、クロセチン-モノ-ゲンチオビオシドエステル(トランス-またはシス-)及び／またはクロセチン-モノ-グリコシドエステル(トランス-またはシス-)の比を制御することができる。

一態様において、最終加水分解物はクロセチン及び／またはクロシンを含んでいてもよい。加水分解の間、クロセチン及び／またはクロシンが生成するのは避けられないことが多く、ある程度の量は残存する場合がある。クロセチン及び／またはクロシンの除去は、除去が望ましい場合、上記の精製法により実施することができる。

クロシン、クロセチン及び／または(単数または複数種類の)クロセチンモノエステルを含有する組成物は、本明細書に記載の種々の症状を治療するのに適していることが見いだされた。この材料の治療活性の一つは、七つの共役二重結合が存在する場合、クロシン、クロセチン及び／または(単数または複数種類の)クロセチンモノエステルに見いだされる高度な不飽和に関連しているのかもしれない。

一態様において、クロシン：モノエステル：クロセチンの比は重量ベースで約(１〜25)：(１〜80)：(１〜60)である。

別の態様において、クロシン：モノエステル：クロセチン比は重量ベースで約(５〜15)：(10〜60)：(５〜50)である。

さらに別の態様において、クロシン：モノエステル：クロセチン比は重量ベースで約(10〜15)：(30〜50)：(30〜40)である。

さらに別の態様では、クロシン：モノエステル：クロセチンの比は重量ベースで約10対約40対約40である。

本明細書に記載の組成物において、（単数または複数種類の）モノエステルは、クロセチン-モノ-ゲンチオビオシドエステル(トランス-またはシス-)及び／またはクロセチン-モノ-グリコシドエステル(トランス-またはシス-)であり得る。特にモノエステルは、クロセチン-モノ-ゲンチオビオシドエステル(トランス-またはシス-)である。

意外にもクロセチンのモノエステルは水に優れた溶解性をもつことが見いだされた。これは活性成分の送達及び代謝に有利である。

さらにこのモノエステルは、クロシンまたはクロセチンまたはその混合物よりも高い生物利用能をもつ。

クロセチンは水不溶性である。クロセチンはアルカリ性水溶液に溶解性であるが、このため食品着色剤などのクロセチンの潜在的利用性が狭められている。低い水溶性のため、クロセチンはインビボでは容易に代謝されない。

クロシンは非常に優れた水溶性をもち、特徴的な水溶性カロテノイドと呼ばれる。しかしながら水性環境中での優れた溶解性はクロシンに対して生理学的利点を提供しない。糖部分(二つのゲンチオビオース基)の分子量のため、クロシンは976.70ダルトンの分子量をもつ。結果として、そのような大きな分子がインビボで生体膜を通過することは困難であり、このためクロシンの生物利用能は非常に低い。

活性成分としてクロシン及びクロセチンは治療処置にいずれも有用であるが、低い溶解性及び低い生物利用能がこれらのもつ欠点のうちの二つである。意外にも、クロシンの完全な加水分解を避ける、制御された部分的な加水分解により、本発明は、クロセチンの(単数または複数種類の)モノエステルの含有量が高い組成物を提供し、これはインビボで増大した生物利用能を提供する。

好都合なことに、クロセチンモノエステルは一つの糖部分しか持たないので、水溶性を維持し易い。たとえばクロセチンの一つのゲンチオビオース基をカルボキシル基で置き換えると、化学構造が変化して、最終生成物に所望の分子量を与える。従って、水溶性を高め且つ分子量を低下させることによって、クロシン/クロセチンの構造的な不都合は回避される。

本発明の加水分解組成物は、好都合なことに、治療的利益に有用なクロセチンモノエステルを提供する。サフランまたはクチナシ材料から誘導されたクロシンの等重量ベースでは、本発明は鬱、癌の予防、高コレステロールの低下、炎症の治療的及び予防的処置、並びに本明細書で記載の他の潜在的な薬学及び栄養補助用途に強化された特性をもつ製品を提供する。

本発明は、所望量のクロセチンのモノエステルを製造し得る制御された加水分解を提供する。これは、酸の選択、酸の濃度、使用する温度範囲及び加水分解の長さにより達成することができる。

一側面において、酸性条件下での加水分解を実施できる。好適な酸としては、塩酸、リン酸、硫酸、硝酸などの鉱酸、並びにシュウ酸、酢酸などの有機酸が挙げられる。

加水分解温度は、室温〜約100℃、約30℃〜約90℃または40〜75℃の間で変動し得る。

加水分解時間(反応時間)は、他の反応条件に従って変動し得る。たとえば、70℃より下の温度で１〜約５時間加熱することは、(単数または複数種類の)モノエステルに加水分解するのに適している。

本発明の加水分解組成物は、クロシンまたはクロセチンに対して増大した生物利用能をもつ。インビボでのクロシン加水分解物の改善された吸収により、サフラン/クチナシ植物抽出物の活性を高める。サフラン/クチナシの従来製品と比較して、本発明の加水分解物は等しい摂取量で改善効果が生み出される。従って本発明の組成物は、特に以下に記載するような化粧品、薬品、栄養補助食品及び食品業界での用途において有用である。

抗鬱剤
サフランは民間療法で抗鬱剤として使用されていた。(単数または複数種類の)モノエステルの増大された吸収により本発明の製品は鬱の治療に有益となる。

高コレステロールの低下
Biological & Pharmaceutical Bulletin 28(11) 2106〜2110（2005）は、(単数または複数種類の)モノエステルを含まないクロシン及びクロセチン誘導体がトリグリセリド及び総コレステロールを顕著に低下させたことを開示した。この研究に基づいて、本発明のクロセチンモノエステルに富んだ組成物は、身体の高コレステロールを低下させるのにより優れているだろう。

胆汁分泌の調節
胆汁は、水、電解質並びにシュウ酸、コレステロール、リン脂質及び胆管を通って小腸に流れるビリルビンなどの一連の有機分子を含む複合流体である。全ての種において二つの基本的に重要な機能がある。
１．胆汁は、小腸において脂肪及び脂溶性ビタミンの消化及び吸収に重要な胆汁酸を含む。
２．ビリルビンなどの多くの老廃物は胆汁への分泌及び排泄物への除去により体内から除去される。

ヒト成人は1日に400〜800mlの胆汁を産生し、他の動物は比例して同様の量を産生する。胆汁への分泌はコレステロール除去の主な経路である。遊離コレステロールは水溶液中には実質的に不溶性であるが、胆汁中では胆汁酸及びレシチンのような脂質によって溶解性になる。その殆どが主にコレステロールから構成される胆石は、胆汁中の溶液からコレステロールを沈殿させるプロセスに起因する。

胆汁酸は肝細胞で合成されたコレステロールの誘導体である。胆汁酸は疎水性(脂溶性)及び極性(親水性)の両面を含む。かくして胆汁酸は二つの重要な機能をもつ。一つは脂質凝集体の乳化である；乳化はそれ自体消化ではないが、脂肪の表面積を大きく増加させ、脂質液滴内部には接近できないリパーゼによる消化を可能にするので重要である。もう一つは、水性環境中における脂質の可溶化及び輸送である；胆汁酸は脂質キャリヤであり、多くの脂質を可溶化できる。胆汁酸は、脂溶性ビタミンの輸送及び吸収にも重要である。

サフラン/クチナシ抽出物は胆汁分泌を顕著に調節できるので、中国の伝統的な胆汁排出促進薬としてアジア各国で広く使用されている。かくして、本発明のクロセチンのモノエステルに富んだ組成物は、消化の乱れにより生じた不快感に有効である。

さらに、本発明の加水分解物は肝臓疾患の治療または予防に使用することができる。胆汁分泌を調節することにより、本発明の加水分解物は肝炎、肝硬変並びに肝臓癌などの種々の肝臓疾患を治療または予防することができる。

婦人科の炎症
中国の伝統医療では、サフランは典型的な漢方薬として婦人科の炎症に関連する炎症に常に使用されている。増大された生物利用能に依存して、本発明は婦人科の炎症の重要な治療薬を提供する。

アテローム性動脈硬化症
アテローム性動脈硬化症は、大動脈及び環状動脈などの中程度から大きな血管を硬化及び狭窄させる、緩徐進行性疾患である。アテローム性動脈硬化症の危険因子の幾つかとしては、過体重または肥満、高コレステロールであること、高血圧及び喫煙が挙げられる。この疾患の特異的原因は不明である。治療としては、生活様式を変えること、薬物治療、特定の医療処置またはこれらの組み合わせを含み得る。アテローム性動脈硬化症の予防は、高コレステロール、高血圧または糖尿病などの症状に関する個人の危険因子を認識することから始まり、次いでこれらの症状を治療及び追跡する。重要な要素は、健康的な生活様式を身につけることであり、たとえば健康的な食事をとること、健康的な体重を維持すること、運動すること、及び喫煙を辞める(または喫煙を始めない)ことが挙げられる。さらにアテローム性動脈硬化症の予防としては薬物治療が挙げられるかもしれない。従って、本発明の加水分解物の増大された生物利用能に基づいて、コレステロールを下げることができ、そしてアテローム性動脈硬化症を治療することができる。

脳の健康
脳の健康、または認識の健康は全ての年代の人々にとって関心が高まっている。親達は自分たちの赤ん坊、幼児及び青年の栄養の重要性に関して学んでいる。十代及び成人は、頭を働かせたり、学校や仕事に集中しなければならない。年長者は加齢と共にアルツハイマー病及び認識低下などの症状に直面する。AChE活性を阻害する物質は、認識健康の候補である。従って、本発明の加水分解組成物または(単数または複数種類の)エステルは、サフラン/クチナシ組成物に対して増大されたAChE阻害をもち、栄養補助食品または薬剤として脳の健康にとって有用である。

循環器疾患
循環器疾患は、心臓または血管(動脈及び静脈)を包含する疾患の種類を指し、理論的には心臓血管系に作用する全ての疾患を指す。殆どの国々は循環器疾患の割合が高くかつ増加し続けることに直面している。従って、健康的な食事をとること、運動すること、及び喫煙を回避することなどの危険因子を改善することによって循環器疾患を予防することが非常に重視されている。伝統的なサフラン/クチナシ組成物に対して本発明の加水分解組成物または(単数または複数種類の)モノエステルの増大された生物利用能は、高コレステロールを低下させるのに役立ち、循環器疾患の治療または改善に重要な役割を果たす。

加齢性黄斑変性の治療
本発明の加水分解物は、加齢性黄斑変性(AMD)の治療または予防に使用することができる。加齢性黄斑変性は、鮮明な中心視野を徐々に破壊する加齢に伴う疾患である。中心視野は物体をはっきりと見るために及び読書や運転などの一般的な日常の仕事に必要である。AMDは個人が細部を見られる目の部分である黄斑に影響を与える。AMDは、既に60歳以上のアメリカ人で失明する主原因である。

一側面において、(天然の(単数または複数種類の)製品に対して)本発明のモノエステルの増大された生物利用能により、本発明の加水分解物は、個人においてAMDを治療、予防または少なくともその進行を減速させる能力を提供する。

癌の治療
本発明の加水分解組成物またはモノエステルは、癌の転移を軽減または予防することができる。

本発明の組成物は、組成物を有用な製剤に加工し易くする一種以上の生理的活性な許容可能なキャリヤ、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して慣用法で配合することができる。

本発明の組成物は、経口、頬内、全身、注射、経皮、直腸、膣内などを含む実質的に任意の投与様式に好適な形態、または吸入若しくは吸送により投与するのに好適な形態をとることができる。

全身性配合物としては、注射、たとえば皮下、静脈内、筋肉内、鞘内または腹膜内により投与用に設計されたもの、並びに経皮、経粘膜、経口若しくは肺投与用に設計されたものが挙げられる。

有用な注射可能な製剤としては、種々のビヒクル中の加水分解組成物の滅菌懸濁液、溶液またはエマルションが挙げられる。組成物は配合剤、たとえば懸濁剤、安定剤及び／または分散剤なども含むことができる。注射用製剤は、アンプル中の単位剤形であってもよく、複数回投与用容器中にあってもよく、さらに防腐剤を加えてもよい。

あるいは注射可能な製剤は、これらに限定されないが、使用前に滅菌の発熱性物質を含まない水、緩衝液、デキストロース溶液などの好適なビヒクルで再構成するための粉末形で提供することができる。この目的のために、本発明の加水分解物は、任意の当業界で知られる方法、たとえ凍結乾燥により乾燥し、使用前に再構成することができる。

経粘膜投与用には、浸透すべきバリヤに対して好適な浸透剤を製剤中に使用する。そのような浸透剤は当業界で知られている。

経口投与用には、本発明の組成物は、結合剤(たとえば予めゼラチン化させたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン若しくはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；フィラー(たとえばラクトース、微結晶質セルロース若しくはリン酸水素カルシウム)；滑剤(たとえばステアリン酸マグネシウム、タルク若しくはシリカ)；崩壊剤(たとえばジャガイモスターチ若しくはナトリウムスターチグリコレート)；または湿潤化剤(たとえばラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容可能な賦形剤と共に慣用法により製造した、たとえばロゼンジ、錠剤またはカプセルの形状をとり得る。錠剤は、たとえば糖、フィルムまたは腸溶コーティングなどで当業界で知られる方法によりコーティングすることができる。

経口投与用の液体製剤は、エリキシル、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形状をとってもよく、またはこれらは水若しくは他の好適なビヒクルを用いて使用前に構成するための乾燥製品とすることができる。そのような液体製剤は、懸濁化剤(たとえばソルビトールシロップ、セルロース誘導体若しくは水素化食用油)；乳化剤(たとえばレシチン若しくはアカシア)；非水性ビヒクル(たとえばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコール若しくは分画植物油)；及び防腐剤(たとえばメチル若しくはプロピルヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの薬学的に許容可能な添加剤と共に慣用法にて製造することができる。製剤は、必要に応じて緩衝塩、防腐剤、香味料、着色剤及び甘味料も含むことができる。

経口投与用製剤は、よく知られるようにクロセチンモノエステルの制御放出を与えるように好適に配合することができる。

頬内投与用には、組成物は慣用法で配合した錠剤またはロゼンジの形状をとることができる。

直腸及び膣投与経路用には、クロセチンモノエステルは、ココアバターまたは他のグリセリドなどの慣用の座剤ベースを含有する溶液(停留かん腸用)座剤または軟膏として配合することができる。

鼻腔投与または吸入または吸送により投与するためには、本発明のクロセチンモノエステルは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フルオロカーボン、二酸化炭素または他の好適な気体などの好適な噴射剤を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエーロゾルスプレーの形状で好都合に送達することができる。加圧エーロゾルの場合には、単位剤形は、計量分を送達するためのバルブを提供することによって決定することができる。吸入器または吸送器で使用するためのカプセル及びカートリッジ(たとえばゼラチンから構成されたカプセル及びカートリッジ)は、ラクトースまたはスターチなどの好適な粉末ベースと化合物との粉末混合物を含んで配合することができる。

長期にわたって送達する場合、本発明の製品は、移植または筋肉内注射によって投与するためのデポー製剤として配合することができる。組成物は、好適なポリマー若しくは疎水性材料(たとえば許容可能な油中のエマルション)またはイオン交換樹脂と一緒に、または難溶性誘導体として、たとえば難溶性塩として配合することができる。あるいは、経皮吸収するための組成物をゆっくりと放出する、粘着性ディスクまたはパッチとして製造した経皮送達系を使用することができる。この目的のために、透過促進剤を使用して、安定化したアントシアニン組成物を経皮透過し易くすることができる。好適な経皮パッチは当業界で記載されている。

あるいは、他の送達系を使用することができる。リポソーム及びエマルションは本発明の組成物を送達するのに使用し得る送達ビヒクルの公知の例である。ジメチルスルホキシド(DMSO)などの特定の有機溶媒も使用し得るが、通常は毒性がより高くなる。

所望により組成物は、組成物を含有する一種以上の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提供することができる。たとえばパックは、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、服薬説明書を添付することができる。

ソフトゲルまたはソフトゼラチンカプセルは、好適なビヒクル(たとえばぬか油及び／または蜜蝋)中に配合物を分散させて高粘度混合物を形成することにより製造できるが、これらに限定されない。次いでこの混合物をソフトゲル業界で知られる方法及び機器を使用してゼラチンベースフィルムでカプセルに包む。次いで、このようにして形成したカプセルを一定重量になるまで乾燥する。

ソフトゼラチンカプセルの充填物は液体(主として、所望によりぬか油または小麦胚種油及び／または蜜蝋などのキャリヤ)であり、組成物とは別に親水性マトリックスを含み得る。存在する場合には、親水性マトリックスは約200〜1000の平均分子量をもつポリエチレングリコールである。任意に追加してもよい成分は、増粘剤及び／または(単数または複数種類の)乳化剤である。

以下の段落では、本発明の種々の態様に関して(１)から(14)まで順に列記する。一態様において、第一段落(１)では、本発明は、クロシン抽出物に見いだされる天然のクロセチンモノエステルと比較して増加した量のクロセチンモノエステルを含む、クロシンまたはその誘導体を含有する植物の加水分解物から誘導される組成物を提供する。

２．クロセチンモノエステルがクロセチンモノグリコシルエステル、クロセチンモノゲンチオビオシルエステルまたはその混合物である、段落１に従った組成物。

３．クロセチンモノエステルの増加した含有量は、天然に存在するモノエステル量に対して１重量％を超える、段落１または２に記載の組成物。

４．クロシン、クロセチン、または他のクロセチンモノエステル類をさらに含む、段落３に記載の組成物。

５．クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(０〜25)：(１〜80)：(１〜60)である、段落４に記載の組成物。

６．クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(５〜15)：(10〜60)：(５〜50)である、段落５に記載の組成物。

７．クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(10〜15)：(30〜50)：(30〜40)である、段落６に記載の組成物。

８．クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約10対約40対約40である、段落６に記載の組成物。

９．クロシンを含有する植物がクチナシまたはサフランである、先の段落のいずれかに記載の組成物。

10．前記加水分解物が酸性または塩基性条件下での加水分解に由来する、段落５に記載の組成物の製造法。

11．前記酸性加水分解はHCl、リン酸またはシュウ酸を使用して行われる、段落１０に記載の方法。

12．化粧品、薬品または栄養補助または規定食における段落１〜９のいずれかに記載の組成物の使用。

13．鬱、癌、婦人科の炎症、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性、肝炎、肝硬変、肝臓癌の治療、予防または改善、高コレステロールの低下、胆汁分泌調節または脳の健康の向上における、段落１〜９のいずれかに記載の組成物の使用。

14．前記加水分解物が単離及び／または精製されたものである、段落１〜１３のいずれかに記載の組成物、方法または使用。

本発明を以下の非限定的な実施例を参照して詳細に記載する。当業者には、本発明の範囲から逸脱することなく記載の態様で多くの変更が可能であることは明らかであろう。かくして、本発明の範囲は本出願に記載の態様に限定すべきでなく、請求の範囲の文言によって記載された態様及びこれらの態様の等価物によってのみ限定される。他に記載しない限り、全ての百分率は重量である。

実施例１
クチナシ黄色10gを水20gと塩酸８g(35容積％)に溶解した。この混合物を50℃に加熱し、窒素雰囲気下、攪拌しながら2.5時間反応させた。暗赤色固体を水200mLで洗浄し、次いでメタノール200mLに溶解した。この溶液を濾過し、蒸留すると、暗赤色固体3.1gが得られた。
HPLC測定
HPLC分析は、C-18クロマトグラフィーカラム(75mm×4.6mm)を装備したAgilent 1100システムで実施した。UV-Vis検出器で波長440nmで溶離プロフィールをモニターした。移動相はメタノール80％と酢酸0.2％を含んだ水20％とからなる溶液であった。
赤色固体の成分を以下の表１及び図１に示す。

実施例２
クロセチンのモノエステル製造(試験SN：C-0118PA)：
クチナシ黄色600g(市販品、UV％＝20％、422nm)をリン酸1800gと水1200gと混合した。混合物を75℃で２時間攪拌した。得られた材料を水1200mLで洗浄した。洗浄後、最終生成物を秤量すると600gであり、暗赤色固体であった。図１及び表２は成分とその相対量である。
HPLC分析法：
装置：Waters HPLC
カラム：RP18、3.9mm×150mm×５μｍ
移動相：メタノール/水＝80/20
流速：0.5mL/分
検出：440nm。

ピーク百分率は下記のとおりである：
クロシン：12.33％；
モノエステル：43.63％；
クロセチン：41.59％。

実施例３
クロセチンのモノエステルの製造(テストSN：C-0117)
クチナシ黄色１g(市販品、UV％＝20％、422nm)をリン酸水溶液20g(５重量％)と混合した。混合物を50℃で40分間攪拌し、次いで濃HCl４gと水１gを反応系に一滴ずつすべて添加した。真空濾過後、得られた材料をエタノールに溶解して飽和溶液とした。沈殿が起きるまで水を滴加した。上部透明液体をHPLCで分析した。分析は実施例２と同様に行った。以下の図３及び表３に結果を示す。

ピークの百分率は以下のとおりである：
クロシン：13.11％；
モノエステル：45.20％；
クロセチン41.69％。

実施例４
クロセチンのモノエステルの製造(テストSN：C-1030)
クチナシ黄色５g(市販品、UV％＝20％、422nm)をHCl水溶液(濃HCl；33重量％)15gと混合した。混合物を４℃〜50℃で10分以内で加熱し、次いで50℃で攪拌しながら30分間保持した。HPLC分析を以下の図４及び表４に示す。

クロシンは25.76％であり、クロセチンのモノエステルは39.76％であり、クロセチンは17.51％である。

濾過後、固体を集め、メタノールに添加して飽和溶液を形成した。等容積の水をこの溶液に添加して、濾過した。上部透明液体をHPLCで分析した。分析条件は実施例１と同様であり、結果を表５及び図５に示す。

クロシン：０；
モノエステル：59.17％；
クロセチン4.75％。

この実施例は、加水分解及び精製後にクロセチンモノエステルの増加した含有量を提供する。

実施例５
この実施例は、クロシン、クロセチンのモノエステル及びクロセチンのアセチルコリンエステラーゼ(AChE)の阻害に注目する。
コリンエステラーゼアッセイ：
阻害溶液：対応するサンプル10mgをそれぞれメタノール１mlに溶解した。
クロマゲン溶液：0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=8、NaOH)を30：１で溶液Aと混合した。
溶液A：5,5’-ジチオ-ビス[2-ニトロ安息香酸]39.6mg及びNaHCO₃15.0mgを10mlフラスコに秤量し、印まで0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH=7、NaOH)で満たした。
酵素溶液：70IU酵素活性/ml H₂Oを含むヒトアセチルコリンエステラーゼ溶液を調製した。
基質溶液：アセチルコリン-ヨウ化物115.7mgを10mlフラスコに秤量し、印までH₂Oで満たした。

阻害剤溶液10μlをクロマゲン溶液185μlと酵素溶液10μlと混合した。この溶液を震蘯しながら室温で10分間インキュベートした。基質溶液５μlを添加して、412nmにおける吸収増加を、増加が観察されなくなるまで(３〜５分)観察した。結果を表６に示す。

図６は、種々のサンプルによるAChE活性の阻害を示す。

実施例６
CaCo-2細胞におけるクロシン及びクロセチンの細胞取り込み
CaCo-2細胞をクチナシ抽出物10mgとクロセチン10mg/培地100mLとともにインキュベートした。試験化合物はメタノールに溶解し、次いでインキュベーション培地で希釈した。インキュベーションは37℃で30、60及び120分間実施した。それぞれの時間点で３つのウエルからインキュベーション培地を集め、細胞に吸収されたクロシン関連エステルまたはクロセチンを抽出し分析用に処理した。

インキュベーション試験で使用したサンプル中のクロセチン関連エステル及びクロセチン含有量を測定した。表７は分析結果の一覧である。

表７はインキュベーション前の試験溶液の内容物を提供する。

表８は、120分後に得られた試験溶液の対応するデータである。

この比較から、試験した化合物は試験アッセイ条件下で安定であること、及びインキュべーション120分後の含有量はインキュベーション前に分析したサンプルと違わないことが示された。

表９は、細胞含有量の分析の一覧であり、吸収された部分が示されている。
表９は、細胞中のクロセチン及びクロセチン関連化合物の濃度を表にして示す。

実施例７
本発明のクチナシ抽出物を導入する拡張試験
適用した方法は実施例６と同様であったが、ただし、クチナシ加水分解物を実験で用い、サンプル濃度を倍の20mg/100mlにした。
試験は繰り返し実施し、結果はHPLC/UVで測定したピーク面積をベースとして％取込として表した。
表１０は得られた試験結果を示す。

上記のごとく、実施例１のクチナシ加水分解物の総吸収は、クチナシ抽出物や純粋なクロセチンよりも高い。この結果は、モノエステルがクロセチンのジエステルよりもより生物利用性が高いことを示している。

方法
CaCo-2細胞の培養
CaCo-2細胞を20％ウシ胎児血清、1.2％非必須アミノ酸、0.83mM L-グルタミン、1.2％ペニシリン-ストレプトマイシン及び0.1％メルカプトエタノールを含有するダルベッコ変性イーグル培地中、５％CO₂及び95％空気雰囲気中、37℃で培養した。
細胞を75cm²培地-フラスコ(T75)中で成長させ、１週間後に継代培養した(1日おきにPBS緩衝液で洗浄し、トリプシンで除去し、新しい培養フラスコに移した)。

CaCo-2試験
実験に関しては、細胞を６ウエルプレートに3x10⁵細胞/ウエルの密度で播種し、コンフルーエンスになるまで５％CO₂及び95％空気雰囲気中、37℃で７〜８日間成長させた。細胞をPBS緩衝液で洗浄し、懸濁させたサンプルを含む４ml培地で30、60または120分間培養した。

対応する培養時間後、細胞をPBS緩衝液/MeOH＝70/30で洗浄し、MeOH１mlを使用して除去した。細胞を30秒間、３回超音波処理し、10分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清をHPLC及びUV/VIS-分析用サンプルとして使用した。

クロセチン及びクロセチン関連エステルの分析
ポンプ：メルク四成分グラジエントポンプ(Merck Quaternary Gradient pump)6200、Merck AS2000、HP-MVD1050、カラムオーブンTech Lab.
カラム；Waters Sperisorb OD2、250×4.6mm
移動相：
(a)MeOH、0.1％蟻酸
(b)0.1％蟻酸
勾配液：30％(a)５分間、20分で60％(b)に増加
流速：１mL/分
温度：周囲温度
注入容積：20μl
検出：423nm

標準調製物(クロセチン)
好適量の標準物質を10mLフラスコに移し、メタノール３mLに溶解し、印まで水を充填した。希釈物は移動相で調製した。

データの評価
線形回帰分析後、外部標準化により定量化を実施した。

本発明は好ましい態様を参照して記載してきたが、当業者は本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく形状及び詳細に変更を加え得ることは理解するだろう。背景におけるものを含む本明細書中に引用した全ての参照文献は、本明細書中、参照として含まれる。当業者は、日常の実験と同じ程度を使用して、本明細書に具体的に記載された本発明の具体的な態様と多くの等価物を理解または確認することができるだろう。そのような等価物は、以下の請求の範囲内に包含されるものとする。

Claims

クロシン抽出物中に見いだされる天然クロセチンモノエステルと比較して増加した量のクロセチンモノエステルを含む、クロシンまたはその誘導体を含有する植物の加水分解物から誘導される組成物。
前記クロセチンモノエステルがクロセチンモノグルコシルエステル、クロセチンモノゲンチオビオシルエステル、またはその混合物である、請求項１に記載の組成物。
クロセチンモノエステルの増加した含有量は、天然に存在するモノエステル量に対して１重量％を超える、請求項１または２に記載の組成物。
クロシン、クロセチン、または他のクロセチンモノエステル類をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(０〜25)：(１〜80)：(１〜60)である、請求項４に記載の組成物。
クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(５〜15)：(10〜60)：(５〜50)である、請求項５に記載の組成物。
クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約(10〜15)：(30〜50)：(30〜40)である、請求項６に記載の組成物。
クロシン：モノエステル：クロセチンの重量比が約10対約40対約40である、請求項６に記載の組成物。
クロシンを含有する植物がクチナシまたはサフランである、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
前記加水分解物が酸性または塩基性条件下での加水分解に由来する、請求項５に記載の組成物の製造法。
前記酸性加水分解はHCl、リン酸またはシュウ酸を使用して行われる、請求項１０に記載の方法。
化粧品、薬品または栄養補助または規定食における請求項１〜９のいずれかに記載の組成物の使用。
鬱、癌、婦人科の炎症、アテローム性動脈硬化症、循環器疾患、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性、肝炎、肝硬変、肝臓癌の治療、予防または改善、高コレステロールの低下、胆汁分泌調節または脳の健康の向上における、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物の使用。
前記加水分解物が単離及び／または精製されたものである、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物、方法または使用。