CN102802636B

CN102802636B - 藏花素水解产物

Info

Publication number: CN102802636B
Application number: CN201080008377.1A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·爱丁伯格
Original assignee: EPC Beijing Plant Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: E.P.C. (BEIJING) PLANT PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2009-02-18
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2030-02-18
Also published as: US8569247B2; US20100210572A1; CN102802636A; WO2010094745A1; JP2010195779A

Abstract

本发明涉及一种来源于含有藏花素或其衍生物的植物水解产物的组合物。该组合物包括一显著数量的藏花酸单酯。本发明也提供了一种水解存在于植物提取物中的藏花素的方法，并进一步涉及其应用。

Description

藏花素水解产物

相关专利的引用

本申请要求了序号为61/153,357的美国专利申请的权利，其由托马斯-爱丁伯格于2009年2月18日递交，主题为“藏花素的水解产物”，其内容以引用的方式被完整地合并进入本申请。

技术领域

本发明涉及一种含有相对于天然存在数量而提高含量的藏花酸单酯的组合物，其通过含有藏花素或其衍生物的植物体水解得到。本发明也提供了一种对植物提取物中存在的藏花素进行水解的方法，并进一步涉及它的用途。

背景技术

作为鲜明的黄色色素，藏花素/藏花酸已经使用了一千多年。该色素通常由干燥的藏红花柱头，或由干燥的栀子果实提取得到。

藏红花的干燥柱头来源于Crocus sativus L.的花朵，其种植可能开始于古希腊时代。大约200个植物柱头提供1g色素。藏红花干燥柱头的基本组分是顺式-藏花素和反式-藏花素，这是一类水溶性类胡萝卜素，其提供了强烈的黄-红色色素。

虽然在世界上的一些地区，不同的藏红花属植物的球茎被当地农民食用，但藏红花(Crocus sativus)不是蔬菜。藏红花是地球上最昂贵的香料之一，其具有一种令人愉快的辛辣、刺鼻、苦的味道，和一种顽固的气味。幸运的是，少量的藏红花对调味大有用处。除了被用于泡茶，藏红花还用于很多食品的调味，诸如花卷、饼干、米饭和鱼。藏红花纤细的干花的植物柱头构成了商业用途中真实的藏红花。虽然市场中其批发价和零售价非常昂贵，但藏红花作为一种淡黄橙色天然着色剂，一直很受欢迎。

栀子(Gardenia jasminoides)是另一种被用于黄色着色剂的主要植物。在日本和中国，栀子也被做为草药由于它们的消炎、利尿、退热、止血和利胆作用，并可用于治疗挫伤。其植物体与面粉和酒的糊状物用作扭曲、扭伤、拉紧、挫伤和脓肿的膏药；在伤害中对腱、韧带、关节和肌肉非常有效。而且，在传统的亚洲人医疗处方中，它是一种重要的药材，其具备止痛、退热、利尿、利胆和抗炎作用。栀子黄作为原料药已经列入日本药典。中医认为栀子具备抗炎、退热、收敛和止血功能，并用于乳腺炎的治疗。其也被用于疼痛、疮、眼睛肿胀和脓肿。

栀子黄是一种淡黄色食品着色剂，类胡萝卜素家族的一员。它的主要色素是藏花素/藏花酸衍生物。栀子黄是用栀子的果实通过水或乙醇提取得到。栀子黄的主要成分是藏花素，其现在广泛用作天然黄色素。与其它类胡萝卜素相比，藏花素极易溶于水。栀子黄在日本被列入现有的食品添加剂目录。例如，栀子黄色素已经作为食品着色剂用于日本传统食品，诸如ohan(用栀子果实着色的黄米饭)和kuri-kanroni(用栀子果实着色的黄色栗子并浸在糖浆中)。

藏花酸是一种天然的类胡萝卜素二羧酸(8，8’-Diapo-ψ，ψ-carotenedioicacid)，其为一种砖红色晶体，具有285℃熔点。化学上，藏花酸是一种多烯二羧酸(8，8′-diapocarotene-8，8′-diolic acid)，其中心单位存在七个共轭双键和四个甲基。当藏花酸的端基(羧基)中的一个或者两个与葡萄糖或者龙胆二糖发生酯化，产生藏花酸二酯，其具备两个相同的不同的端基。

一方面，藏花素为二(6-O-β-D-吡喃葡萄糖-β-D-吡喃葡萄糖)酯，α-藏花素，或藏花酸的二龙胆二糖酯，具有如下化学结构：

广义上，减花素也包括天然类胡萝卜素，其糖的部分不局限于龙胆二糖，并可定义为一种二酯，作为二羧酸藏花酸和任何糖形成的缩合产物。如下所示：

其中，R是任何一种糖基，并且每个R不受约束地可以是相同的或不同的。

藏花酸的化学结构显示如下：

其是藏花素的中央核心，也是提供藏红花颜色的化合物。商业上的藏花酸通过水解藏花素除去藏花素的龙胆二糖得到。

藏花素已经被证明是一种有效的抗氧化剂，并被用于抗抑郁、预防癌症、增强心理机能、降低高胆固醇和/或预防炎症。藏花素、藏花酸及其衍生物也被证明能显著地促进胆汁分泌，被用于改善很多疾病状况。在中国，藏红花多糖药片已被批准作为一种治疗冠心病和心绞痛的新的口服药物。这种药品由一系列从藏红花提取的组分构成，其中的藏花素被确定为主要有效成分和标准对照。

藏花素是一种独特的水溶性类胡萝卜素，其吸引了许多关于其广泛药理学作用的研究。当前研究证明藏花素具有一个不适合活体内吸收的大分子结构。也发现藏花素在动物和健康志愿者口服之后不被吸收(Phytomedicine 14(2007)633-36)。

藏花酸被认为是藏花素在体内的活性代谢物的一种，但在重复口服之后，藏花酸没有显著提高，这表明藏花酸在身体内没有累积，被迅速排泄。可能的理由之一是藏花酸不溶于水。水中的低溶解度限制了其在食品、饮料、药物或营养食品上的很多应用，其也导致活体内减小的生物利用度。

通过活体实验或者动物实验，得到了藏花素/藏花酸的生物学和药理学活性的研究，仅有少数研究考虑了藏花素/藏花酸及其衍生物的生物利用度。

因此，需要一种适合的藏花素/藏花酸衍生物，其相对于藏花素或藏花酸具有高的生物利用度。

简要说明

一方面，本发明意外地提供了源自含有藏花素或其衍生物的植物物质水解产物的组合物。该水解产物包括提高含量的藏花酸单酯，在藏花素物质中，包括其提取物，缺少天然存在的藏花酸单酯。例如，藏花酸单酯是藏花酸单葡糖酯，藏花酸单龙胆二糖酯或其混合物。

一般而言，相对于含有藏花素的植物物质中天然存在的单酯数量，该组合物具有超过1％重量计的提高含量的藏花酸单酯。因为藏花酸单酯在自然状态下不存在，所以本发明水解产物中存在提高含量的单酯。

一方面，本发明所述的水解产物组合物包括藏花素、藏花酸或其它藏花酸单酯，其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(0-25)∶(1-80)∶(1-60)重量比，或藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(5-15)∶(10-60)∶(5-50)重量比，或藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(10-15)(30-50)∶(30-40)重量比，以至其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为10∶40∶40重量比。

一般而言，含有藏花素的植物是栀子或藏红花。

本发明也提供了一种所述水解产物组合物的制备方法，其中的水解产物来自于酸性或碱性条件下的水解过程。例如，酸性水解应用盐酸、磷酸或草酸。

本发明所述的水解产物可被用于化妆品、药品、营养食品或作为营养增补剂。

本发明所述的水解产物能被用于处理、预防或改善抑郁、癌症、妇科炎症、动脉硬化症、心血管疾病、阿尔茨海默症、老年性黄斑病变、肝炎、肝硬化、肝癌、降低高胆固醇、调节胆汁分泌或促进大脑健康。

附图说明

图1是本发明所述一个实施例的水解产物的HPLC色谱图。

图2是本发明所述另一个实施例的水解产物的HPLC色谱图。

图3是本发明所述另一个实施例的水解产物的HPLC色谱图。

图4是本发明所述另一个实施例的水解产物的HPLC色谱图。

图5是本发明所述另一个实施例的水解产物的HPLC色谱图。

图6是本发明水解产物AChE抑制的图示[所有测试组分的浓度：0.5mg(总活性物质)/mL]。

详细说明

在说明书和权利要求书中，术语″包括″和″包含″是开放式术语并应解释为″包括，但不限于...″。这些术语包含进一步限制性的术语″实质上由...组成″和″由...组成″。

必须注意的是，除非上下文以另外方式明确规定，如在这里和附加的权利要求书中使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数内涵。术语″a″(″an″)、″一个或多个″和″至少一个″在这里也可以互换使用。也要注意的是术语″包含″、″包括″、″以...为特征″和″具有″可以互换使用。

除非以另外方式限定，在这里使用的所有技术和学术术语，与本发明所属领域的普通技术人员的普遍理解一样，具有相同的含义。在这里明确提到的所有出版物和专利，通过引证的方式，处于全部目的，被合并为一个整体；这些目的包括描述和披露在可能与本发明有联系的出版物上被报道的化学制品、仪器、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都将被用作指示所述领域的技术水平。在这里没有任何内容被推论为承认本发明没有资格预料由于在先发明公开的所述内容。

本发明被指向一种包含藏花酸单酯的组合物，其来源于含有藏花素或其衍生物的植物水解产物。

本发明也提供了一种通过水解含有藏花素或藏花素衍生物的植物物质来制备所述组合物的方法。

含有藏花素或其衍生物的植物物质选自藏红花和栀子，并包括市售的藏红花。

所述的水解可在酸性或碱性条件下实现。一方面，该水解在酸性水溶液中进行。在酸性水溶液条件下，藏花素或其衍生物经过水解成为或部分成为藏花酸单酯，或者进一步水解产生藏花酸。

藏花酸单酯如下所示：

基团R表示龙胆二糖基、葡糖基或其它可能的糖基。

当R是龙胆二糖基时，藏花酸单酯是藏花酸单龙胆二糖酯，包括反式和顺式异构体。

当R是葡糖基时，藏花酸单酯是藏花酸单葡萄糖酯，包括反式和顺式异构体。

因此，本发明提供了一种富含藏花酸单酯的组合物。所述的单酯以大于1％重量比的分离形态存在，优选大约10％重量比，更优选大约40％重量比。

本发明所述的水解产物可以通过现有技术中一种或多种方法进一步纯化，诸如色谱分离法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、结晶、亲和色谱法、分配色谱法、蒸馏等等。特定酯的鉴定(例如，藏花酸单酯)可以同时使用为本领域技术人员所知的方法，包括1H核磁共振、化学降解、色谱分离法和光谱法，特别是用同核和异核二维核磁共振技术来表征分离后的水解产物。

术语“纯化的”或者“分离的”被用于提及来自如上所述藏花酸单酯及其组合物的纯化和/或分离。再次应用本领域已知的常规方法，该藏花酸单酯及其组合物可被分离成为纯化的物质。本发明的一个实施例中，通过本领域已知技术，该水解产物的藏花酸单酯被充分地纯化和分离。该纯化的化合物的纯度按重量计算，通常是至少大约90％，优选至少大约95％，最优选至少大约99％，并且甚至更加优选至少大约99.9％(例如，大约100％)。

由于糖基的多样性，上述藏花酸单酯具有不同的分子结构。藏花酸-单-龙胆二糖酯(反式或顺式)是水解产物的主体。该单酯在各种用途中扮演主要角色。同时，藏花酸-单-葡萄糖酯(反式或顺式)也是有用的，虽然它不是主要组分。基于本发明所提供的信息，有理由相信，所述的藏花酸单酯提高了藏花素活性组分的生物利用度。以下实例表明了这个意料之外的结果。

通过选择适宜的水解条件，藏花酸-单-龙胆二糖酯(反式或顺式)和/或藏花酸-单-葡萄糖酯(反式或顺式)的比例是可以被控制的。

在一实施例中，最终的水解产物可以包含藏花酸和/或藏花素。在水解过程中，在一定程度上产生藏花酸和/或藏花素经常是不可避免的。如果需要，可以通过上述记录的净化方法除去藏花酸和/或藏花素。

已经发现含有藏花素、藏花酸和/或藏花酸单酯的组合物适合用于治疗本发明所述不同病症。其物质的治疗活性可能与藏花素、藏花酸和/或藏花酸单酯中存在的七个共轭双键的高不饱和度有关系。

在一个实施例中，藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(1-25)∶(1-80)∶(1-60)重量比。

在另一个实施例中，藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(5-15)∶(10-60)∶(5-50)重量比。

在另一个实施例中，藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为(10-15)∶(30-50)∶(30-40)重量比。

在另一个实施例中，藏花素∶单酯∶藏花酸的比例大约为10∶40∶40重量比。

应被理解的是，本发明所述的组合物中的单酯可以是藏花酸-单-龙胆二糖酯(反式或顺式)和/或藏花酸-单-葡糖酯(反式或顺式)。特别地，该单酯是藏花酸-单-龙胆二糖酯(反式或顺式)。

本发明意外地发现该藏花酸单酯具有良好的水溶性。这对活性组分的传递和代谢是有利的。

而且，该单酯比藏花素、藏花酸或其混合物具有提高的生物利用度。

藏花酸不溶于水。它可溶于碱性水溶液，这限制了藏花酸潜在应用，诸如食品着色剂。由于水溶性不理想，藏花酸在生物体内不易被代谢掉。

藏花素具有很好的水溶性，被认为是一种独特的水溶性类胡萝卜素。然而在水相环境中良好的溶解度并不提供藏花素生理学上的优势。由于其糖基(两个龙胆二糖)的分子量，导致藏花素分子量为976.70道尔顿。因此，这种大分子通过生物体内的生物膜是困难的，其进而导致藏花素极低的生物利用度。

作为活性组分，藏花素和藏花酸两个都可用于治疗学的医治，但可溶性差和生物利用度低是它们的两个缺点。出人意料的是，本发明通过受控的部分水解，避免了藏花素的完全水解，提供了具有高含量藏花酸单酯的一种组合物，其提供了在生物体内提高的生物利用度。

有利的是，藏花酸单酯仅仅具有一个糖基，其有助于保持水溶性。例如，藏花素的一个龙胆二糖基被一个羧基替代，产生的化学结构变化带来了最终产品的理想的分子量。因此通过强化水溶性和降低分子量，克服了藏花素/藏花酸的结构上的缺点。

本发明所述的水解产物组合物提供了有益的藏花酸单酯，其对治疗学的好处是有用的。基于来自藏红花或者栀子的一当量重量的藏花素，本发明提供的产品，对治疗抑郁、防癌、降低高胆固醇、治疗炎症，以及本发明描述的其它潜在的药用和保健应用方面，具有增强的治疗和预防特性。

本发明提供了受控的水解可以产生一定需要数量的藏花酸单酯。该过程通过酸的选择、酸的浓度的选择、水解使用的温度范围的选择和水解的持续时间的选择得以实现。

一方面，在酸性条件之下的水解可以实现。适合的酸包括，例如，无机酸，诸如盐酸、磷酸、硫酸、硝酸等等，以及有机酸，诸如草酸、醋酸、等等。

水解反应温度可以从室温至大约100℃变化，或者从大约30℃至大约90℃变化，或者从40℃至75℃。

水解时间(反应时间)可以根据其它的反应条件变化。例如，在70℃下加热1至5小时，是适合于获得单酯的水解。

本发明所述的水解产物组合物相对于藏花素或者藏花酸，具有提高的生物利用度。藏花素水解产物在生物体内改善的吸收提高了藏红花/栀子植物提取物的活性。等量的本发明的水解产物的摄入数量，与藏红花/栀子的传统产品对比，产生了增强的作用。因此，本发明所述的组合物对化妆品、医药制品、保健食品以及饮食产业的应用是有用的，尤其是如下所述：

抗抑郁症药

藏红花已经作为抗抑郁药在民间医药中使用。单酯的提高的吸收使本发明产品对抑郁的治疗很重要。

降低高胆固醇

Biological&Pharmaceutical Bulletin 28(11)2106-2110(2005)公开了藏花素和藏花酸不含单酯的衍生物显著地降低了甘油三酸脂和总胆固醇。根据这个研究，本发明所述的富集藏花酸单酯的组合物更适宜降低人体高胆固醇。

调节胆汁分泌：

胆汁是一种含水、电解液、包括胆汁酸、胆固醇、磷脂和胆红素的一系列有机分子的混合流体，其流过胆道进入小肠。在所有物种中，胆汁具有两个基本重要功能：

1.胆汁含有胆汁酸，其是脂肪和脂溶性维生素在小肠中消化和吸收的关健。

2.很多的废物，包括胆红素，是通过胆汁分泌和粪便排泄从人体排出的。

成年人每日产生400至800毫升胆汁，其它动物产生成适当比例相似数量的胆汁。胆汁分泌是排除胆固醇的主要途径。游离胆固醇在水溶液中实质上不能溶解，但在胆汁中，脂肪，如卵磷脂，通过胆汁酸可以溶解。胆石，其中大多数是主要由胆固醇组成，其产生的过程允许胆固醇由胆汁溶液中沉淀出来。

胆汁酸是肝细胞中合成的胆固醇衍生物。胆汁酸包含疏水性(脂溶性)和极性(亲水性的)晶面。因此胆汁酸具有两个重要功能；一是脂质集合体的乳化；乳化本身不是消化，但其具有重要性，因为它显著增加了脂肪的表面积，使其能够通过脂肪酶消化，脂肪酶不能进入脂类小滴内部。另一个是在水相环境中对脂肪的增溶作用和转运作用；胆汁酸是脂质载体，能溶解很多的脂肪。胆汁酸对脂溶性维生素的转运和吸收也很关键。

藏红花/栀子提取物可以显著地调节胆汁分泌，在亚洲国家作为传统中药的利胆药物广泛使用。因此本发明所述的富集藏花酸单酯的组合物对消化障碍引起的疾病是有效的。

另外，本发明所述的水解产物可用于治疗或者预防肝病。可以相信，通过调节胆汁分泌，本发明水解产物可以治疗或者预防不同的肝脏疾病，包括肝炎、肝硬化，以及肝癌等。

妇科炎症：

中国的传统医学中，藏红花作为一种具有代表性的草药，总是被用于女性妇科炎症。依靠提高的生物利用度，本发明提供了对妇科炎症的有效疗法。

动脉粥样硬化

动脉硬化症是一种慢性、渐进性疾病，其导致诸如主动脉和冠状动脉的大血管介质的硬化和变窄。导致动脉硬化症的部分危险因素包括超重或者肥胖、高胆固醇、高血压和抽烟。该疾病的特定病因仍然是未知的。治疗包括改变生活方式、药物疗法、特定医疗过程、或它们的综合。动脉硬化症的预防始于认识到该症状独特的危险因素，诸如高胆固醇、高血压、或者糖尿病，然后医治和监视这些症状。一个重要的部分是采取健康的生活方式，包括健康的日常饮食、保持健康的体重、适当运动、以及停止(或不开始)抽烟。另外，动脉硬化症的预防包括吃药。因此，基于本发明的水解产物的提高的生物利用度，胆固醇是可以降低的，进而动脉硬化症是可以治疗的。

脑保健

大脑健康，也称为认知能力的健康，是古往今来不断关注问题。父母不断学习营养对它们的孩子处于婴儿期、儿童期和青春期的重要性。少年和成年人需要敏锐的心智，并且专注于学习和工作。年长者由于他们年龄，面对诸如阿尔茨海默氏病和认知衰退的病症。抑制乙酰胆碱脂酶活性的物质被选择用于认知健康。因此，随着藏红花/栀子水解产物组合物的提高的乙酰胆碱脂酶抑制能力，本发明所述的水解产物组合物或者单酯作为一种保健食品或者药物被用于脑保健。

心血管疾病：

心血管疾病涉及包括心或者血管(动脉和静脉)疾病的分类，技术上指的是影响心血管系统的任何一种疾病。大多数的国家面临心血管疾病的高增长率。因此存在提高通过减轻危险因素预防心血管疾病的重要性，诸如健康进食、运动并避免抽烟。相对于传统的藏红花/栀子提取物，本发明水解产物组合物或单酯具有提高的生物利用度，有助于降低高胆固醇，在治疗或者改善心血管疾病中扮演重要角色。

老年黄斑病变的治疗：

本发明的水解产物可用于治疗或者预防老年黄斑病变(AMD)。老年黄斑病变(AMD)是一种与衰老有关疾病，其逐渐破坏敏锐的中央视觉。中央视觉负责明确地观察目标，并且承担通常的日常任务，诸如阅读和驾驶。AMD影响黄斑，眼的该部分允许人查看细微的细节。AMD已经是美国60岁及以上老年人视力损失的主要原因。

一方面，由于本发明的单酯具有提高的生物利用度(相对于天然存在的产品)，本发明的水解产物具有治疗、预防或者至少降低人体中AMD发展的能力。

治疗癌症：

本发明的水解产物组合物或者单酯可以帮助降低或者预防癌症的扩散。

本发明组合物可以传统方式配制，应用一种或多种生理学上的可接受的载体、稀释剂、赋形剂或者辅助剂，使该组合物方便进入所述的配制品。

本发明组合物可采取实质上适于服用的任何一种方式的剂型，包括，例如，口服、口腔吸收、内吸收、注射、透皮给药、直肠给药、阴道给药等剂型，或者是适合吸入或吹入的剂型。

内吸收制剂包括那些设计通过注射来用药的剂型，例如，皮下注射、静脉注射、肌肉注射、鞘内或腹腔内注射，以及那些为透皮吸收、经粘膜吸收设计的口服或肺部吸收剂型。

有用的可注射配制品包括在不同的载体中该水解组合物的无菌的悬浮液、溶液或者乳剂。该组合物还可以包含复配助剂，诸如悬浮剂、促稳定剂和/或分散剂。用于注射的制剂可以单位剂型存在，例如，安瓿或者多剂量包装，并可以添加防腐剂。

换句话说，所述的注射剂配方可以粉末形式供应，使用前用适合的媒介物恢复原状，包括但不限于无菌无热原的水、缓冲液、葡萄糖溶液等等。针对于此，本发明的水解产物可通过所属领域已知的任何一种技术干燥，诸如冻干法，并在使用之前恢复原状。

用于经粘膜吸收的给药，配方可使用适宜透过渗透屏障的渗透剂。在公知技术中这种渗透剂是已知的。

对于口服，本发明的组合物可以采取锭剂，片剂或胶囊的形式，例如，通过传统方法和药学上可接受的赋形剂进行制备，所述的赋形剂诸如粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；装填物(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石或硅石)；分解质(例如，马铃薯淀粉或羟基淀粉乙酸钠)；或者润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。所述片剂可以通过所属领域众所周知的方法，例如，用糖，薄膜或肠溶衣包覆。

用于口服的液体药剂可以采取例如酏剂，溶液，糖浆或悬浮液的形式，或者它们可以作为一种干燥的产品存在，在使用前与水或其它适合的媒介物还原配制。这样的液体药剂可以通过传统方法与药学上可接受的添加剂制备得到，所述的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水媒介物(例如，杏仁油，油酯，乙醇，或精馏植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基p-羟基安息香酸盐或山梨酸)。所述的配制品也可以酌情包含缓冲盐，防腐剂，调味品，着色剂和甜味剂。

用于口服的配制品可以按照众所周知的方式，适当地配制，以实现番石榴提取组合物的受控释放。

对于口腔用药，所述的组合物可以采取片剂或锭剂的形式，以传统方法配制而成。

对于直肠和阴道途径的用药，番石榴提取组合物可被配制为溶液(用于保留灌肠法)，栓剂或膏剂，其含有传统的栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯。

对于鼻部给药或者通过吸入或吹入的给药，所述的番石榴提取组合物可以借助于适合的抛射剂，例如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，碳氟化合物，二氧化碳或其它适合的气体，从密封容器或喷雾器中以气溶胶喷射的形式，被方便地传递。就加压气雾剂而言，所述的剂量单位，可以通过提供一个阀来决定所释放的计量数量。供吸入器或吹药器(例如由凝胶组成的胶囊和药盒)用的胶囊和药盒可以复配含有粉末混合物，该粉末混合物由所述化合物和适合的粉末基料组成，诸如乳糖或淀粉。

为了持续传递，所述的番石榴提取组合物可以作为用于植入给药或肌肉注射给药的储存制品被配制。所述的组合物可以与适合的聚合材料或者疏水材料(例如，在可接受的油中作为乳剂)或离子交换树脂，或者作为微溶的衍生物，例如，作为一种微溶的盐，进行配制。另外，作为一种吸盘或膜片制造的透过皮肤起作用的输送系统能被使用，其缓慢释放所述组合物用于经皮吸收。至此，渗透增强剂可用于促进所述组合物的皮肤渗透。公知技术中捕述了适合的皮肤膜片。

另外，可以采用其它的传递系统。脂质体和乳剂是被熟知的传递载体，其可用于传递番石榴提取组合物。确定的有机溶剂，诸如二甲亚砜(DMSO)，也可以被采用，虽然通常以较大的毒性为代价。

所述的组合物，如果需要，可以存在于一种包装或者分配器装置中，其可以包含一种或多种含有所述番石榴提取组合物的单位剂量型式。所述的包装可以，例如，含有金属或者塑料薄片，诸如泡罩包装。所述的包装或分配器装置可以附有药的服用说明。

软凝胶或软胶胶囊可以被制备，例如，不受限制地，通过在适当的媒介物(例如，米糠油和/或蜂蜡)中分散所述成分，以形成一种高粘度混合物。然后这些混合物与凝胶一同，基于软凝胶工业技术人员所知的薄膜应用技术和机械设备，被做成胶囊。所述胶囊成型后被干燥至恒重。

所述软胶胶囊的充填料是液体(主要是载体，诸如米糠油或者小麦胚油和/或蜂蜡，如果需要的话)并可以包含除所述组合物以外的亲水性的基质。所述亲水性基质，如果存在的话，是具有大约200-1000平均分子量的聚乙二醇。进一步的组分可选择的是增稠剂和/或乳化剂。

以下从(1)到(14)连续列举的段落规定了本发明的各个方面。在一实施例中，在第一段落(1)中，本发明提供了一种组合物，来源于含有藏花素或其衍生物的植物的水解产物，相对于藏花素提取物中发现的天然存在的藏花酸单酯，含有提高数量的藏花酸单酯。

2、根据段落1所述的组合物，其中藏花酸单酯是藏花酸单葡萄糖酯、藏花酸单龙胆二糖酯或其混合物。

3、根据段落1或2所述的组合物，相对于天然存在的单酯的数量，其中藏花酸单酯的提高的含量为1％以上重量比。

4、根据段落3所述的组合物，进一步含有藏花素、藏花酸、或其它藏花酸单酯。

5、根据段落4所述的组合物，其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例为大约(0-25)∶(1-80)∶(1-60)重量计。

6、根据段落5所述的组合物，其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例为大约(5-15)∶(10-60)∶(5-50)重量计。

7、根据段落6所述的组合物，其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例为大约(10-15)∶(30-50)∶(30-40)重量计。

8、根据段落6所述的组合物，其中藏花素∶单酯∶藏花酸的比例为大约10∶40∶40重量计。

9、根据前面任意一段所述的组合物，其中含有藏花素的植物是栀子或藏红花。

10、一种根据段落5所述的组合物的制备方法，其中的水解产物来自酸性或碱性条件下的水解。

11、根据段落10所述的制备方法，其中的酸性水解应用盐酸、磷酸或草酸。

12、段落1-9中任意一个所述的组合物在化妆品、药品、保健品或食品中的应用。

13、段落1-9中任意一个所述的组合物在治疗、预防或改善抑郁、癌症、妇科炎症、动脉硬化症、心血管疾病、阿尔茨海默氏病、老年黄斑病变、肝炎、肝硬化、肝癌、降低高胆固醇、调节胆汁分泌或增强大脑健康方面的应用。

14、段落1-13中任意一个所述的组合物、方法或应用，其所述的水解产物是经分离和/或纯化的。

本发明将以下列非限制性实例为基准，做进一步描述。对所属技术领域人员而言，实施例中描述的很多改变是显而易见的，没有背离本发明的范围。因此本发明的范围不应该限于本申请所描述的实施例，而是通过所述的实施例、权利要求的措辞和那些实施例的等同概念来限定。除非另外指出，所有百分比按重量计算。

具体实施方式

实施例1

10克栀子黄溶解在20克水和8克盐酸(35％体积比)。混合物加热至50℃，在搅拌和氮气保护下，反应2.5小时。暗红色固体经200mL水冲洗后，被溶解在200mL甲醇中。过滤溶液，并蒸去甲醇，得到3.1克暗红色固体。

HPLC测定

HPLC分析由装备C-18色谱柱(75mm×4.6mm)的Agilent1100系统完成。AUV-Vis检测器在440nm波长下监测洗脱分布。流动相由80％甲醇和20％水组成，并包含0.2％醋酸。

下表1和图1具体描述了暗红色固体的组成：

表1

峰	时间	面积	高	宽	面积％	对称性
							藏花素	1.444	967.6	83.9	0.152	7.386	1.092
藏花酸单酯	1.866	4348.7	544.2	0.1165	33.192	0.599
							藏花酸	4.783	2505.8	220.3	0.1691	19.125	0.655
其它	8.323	1535.3	99.4	0.2355	11.718	0.854

实施例2

藏花酸单酯的制备(实验编号：C-0118PA)：

600克栀子黄(商品，UV％＝20％，422nm)同1800克磷酸和1200克水混合。该混合物在75℃下搅拌两小时。混合物用1200mL水冲洗。在水洗之后，最终产品600克，为一暗红色固体。图1和表2描述了组分和组分的相对含量。

HPLC分析法：

仪器：Waters HPLC

柱：RP 18，3.9mm×150mm×5μm

流动相：甲醇/水＝80/20

流速：0.5mL/分钟

检测：440nm

表2

峰号	峰	保留时间	面积	％面积	高
						1	藏花素	2.457	2652457	12.33	71659
2	藏花酸单酯	4.449	9385695	43.63	290442
						3	其它	7.600	283910	1.32	3921
4	其它	8.867	29041	0.14	1867
						5	藏花酸1<sup>*</sup>	16.036	7741568	35.99	183094
6	藏花酸2<sup>*</sup>	17.901	1418810	6.60	30594

^*异构化合物

以下为峰对应的百分比：

藏花素：12.33％

单酯：43.63％

藏花酸：41.59％

实施例3

藏花酸单酯的制备(实验编号：C-0117)：

1克栀子黄(商品，UV％＝20％，422nm)与20克磷酸水溶液(5％重量计)混合。该混合物在50℃搅拌40分钟，然后向反应体系逐滴加入4克浓盐酸和1克水，直至完成。在真空过滤之后，过滤物在乙醇中溶解至形成饱和溶液。逐滴加水直至出现沉淀。上层清液通过HPLC分析。参照实施例2进行分析。分析结果在图3和下表3中描述。

表3

峰号	峰	保留时间	面积	％面积	高
						1	藏花素	2.416	1567184	13.11	43748
2	藏花酸单酯	4.332	5402877	45.20	179077
						3	藏花酸1<sup>*</sup>	15.213	3932041	32.89	102103
4	藏花酸2<sup>*</sup>	16.951	1051476	8.80	21909

^*异构化合物

以下为峰对应的百分比：

藏花素：13.11％

单酯：45.20％

藏花酸：41.69％。

实施例4

藏花酸单酯的制备(实验编号：C-1030)

5克栀子黄(商品，UV％＝20％，422nm)与15克HCl水溶液(浓盐酸；33％重量比)混合。混合物在10分钟内由4℃加热至50℃，然后在50℃搅拌下保持30分钟。图4和下表4表明了HPLC分析结果：藏花素25.76％，藏花酸单酯39.76，藏花酸17.51％。

表4

峰号	峰	保留时间/min.	面积/mAU	高	面积/％
						1	藏花素	1.398	3474.07642	370.17142	25.7611
2	藏花酸单酯	1.900	5362.00537	702.10504	39.7605
						3	\	2.285	559.32758	54.73783	4.1475
4	\	2.637	368.39673	29.34089	2.7317
						5	\	2.914	76.27254	6.23904	0.5656
6	\	3.360	732.10663	61.28264	5.4287
						7	\	3.714	57.55760	5.38762	0.4268
8	\	3.951	73.40577	5.64571	0.5443
						9	\	4.430	57.58480	3.71721	0.4270
10	\	4.776	37.58595	2.23643	0.2787
						11	藏花酸	5.299	2361.50269	215.51270	17.5111
12	\	9.568	325.93753	18.75234	2.4169

过滤之后，收集固体并将其添加进入甲醇以形成饱和溶液。添加等体积的水至溶液并过滤。HPLC分析上层清液。分析条件与实施例1相同，结果显示在表5和图5中。

表5

峰号	峰	保留时间/min.	面积/mAU	高	面积/％
						1	\	1.554	706.77954	66.80975	2.9696
2	\	1.820	327.97046	74.31164	1.3780
						3	藏花酸单酯	1.972	1.40835e4	1863.98206	59.1736
4	\	2.364	1042.99097	94.24978	4.3823
						5	\	2.676	318.79172	32.89029	1.3394
6	\	3.027	266.48245	22.55992	1.1197
						7	\	3.453	2769.08813	224.98495	11.6347
8	\	3.855	235.35849	24.58457	0.9889
						9	\	4.07	401.77420	26.55097	1.6881
10	\	4.604	315.48105	11.24618	1.3255
						11	藏花酸	5.495	1130.45105	87.56268	4.7497
12	\	6.031	134.95776	6.12393	0.5670
						13	\	6.774	35.64629	2.08088	0.1498
14	\	7.476	34.00674	1.84287	0.1429
						15	\	9.969	1997.00537	111.09497	8.3907

藏花素：0

单酯：59.17％

藏花酸：4.75％

本实施例在水解和纯化后提供了提高含量的藏花酸单酯。

实施例5

本实施例关注的是藏花素、藏花酸单酯和藏花酸对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制。

胆碱酯酶分析：

抑制剂溶液：10毫克对应的样品被分别溶解在1mL甲醇中。

色蛋白溶液：0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝8，NaOH)用溶液A以30∶1比例混合。

溶液A：39.6毫克5，5′-二硫-二[2-硝基苯甲酸]和15.0毫克NaHCO₃经称重后放入一个10mL烧瓶，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH＝7，NaOH)添加至刻度。

酶溶液：制备70IU酶活性/mL水的人乙酰胆碱酯酶溶液。

酶底物溶液：115.7毫克乙酰硫代碘化胆碱装入10mL烧瓶并用水添至刻度。

10μL抑制剂溶液与185μL色蛋白溶液和10μL酶溶液混合。该溶液在室温下伴随振荡培养10分钟。添加5μL酶底物溶液记录412nm处的吸收的增加，直至观察到不再提高(3-5分钟)。表6记录了结果。

表6

样品	mg/ml	AChE活性％	AChE活性的抑制％
				消极控制	/	100.0	0.0
Galanthamin.HBr<sup>*</sup>	0.50	2.6	97.4
				单酯<sup>*</sup>	0.50	10.8	89.2
藏花素	0.50	52.7	47.3
				藏花酸	0.50	92.5	7.5

^*Galanthamin.HBr是Sigma产品目录中产品编号No.G1660，一种胆碱酯酶抑制剂。

^*单酯是实施例1中的藏花酸单酯。

图6表示了不同杆品对AChE活性的抑制。

实施例6

CaCo-2细胞中藏花素和藏花酸的细胞吸收

CaCo-2细胞用10毫克栀子提取物和10毫克藏花酸/100mL培养基进行培养。测试化合物在甲醇中溶解，然后用培养基稀释。培养在37℃下执行30、60和120分钟。在每个时点，通过培养基的收集和细胞内吸收的藏花酸相关酯和藏花酸的提取，对3个样品点板进行处理分析。

测定用于培养测试的样品中藏花酸相关酯和藏花酸的含量。表7汇总了分析结果。

表7提供了在培养之前测试溶液的含量。

^*...缩写：

DGTC...龙胆二糖基-(反)藏花酸二酯；

NGTC...那不勒斯糖基-葡糖基-(反)藏花酸二酯；

DGCC...龙胆二糖基-(顺)藏花酸二酯；

GTC...龙胆二糖基-(反)藏花酸单酯

表8描述了120分钟后得到的测试溶液的对应数据。

该比较显示该受试化合物在测试分析条件下是稳定的，而且在培养120分钟后的含量不同于在培养之前分析的样品。

表9汇总了细胞内容物的分析，显示了被吸收的部分。

表9列表显示了细胞中藏花酸和藏花酸相关化合物的浓度：

时间(min)	藏花酸(HPLC)<sup>*</sup>	UV/VIS消光量	HPLC峰<sup>**</sup>
				0	BLD	＜0.03	未检测到
30	BLD	＜0.03	未检测到
				60	BLD	＜0.03	未检测到
120	BLD	＜0.03	未检测到

^*...BLD＝＜0.01mg/100ml

^**...针对DGTC、NGTC、DGCC和GTC

实施例7

采用本发明的栀子提取物的试验扩展

使用方法类似于实施例6，不同在于本实验采用栀子水解产物，而且样品浓度被加倍至20毫克/100毫升。

该测试平行操作，结果以基于HPLC/UV测量的峰面积的吸收％来表示。

表10显示了得到的测试结果：

样品	栀子提取物	实施例1中的栀子水解产物	纯藏花酸
				％藏花酸相关化合物的总吸收	0.48	0.76	0.53
％藏花酸的吸收<sup>*</sup>	0.44	0.47	0.53
				％藏花酸二酯的吸收<sup>*</sup>	0.01	0.01	-
％藏花酸单酯的吸收<sup>*</sup>	0.02	0.28	-

^*...总吸收比例

如上说述，实施例1中栀子水解产物的总吸收比栀子提取物或纯藏花酸要高。该结果显示了藏花酸单酯比藏花酸二酯具有更高的生物利用度。

方法

CaCo-2细胞的培养

CaCo-2细胞在37℃含有5％二氧化碳和95％空气的环境中，于Dulbeccos′sModified Eagle培养基中培养，该培养基含有20％胎儿牛血清，1.2％非必需氨基酸，0.83mM的L-谷酰胺，1.2％青霉素-链霉素和0.1％巯基乙醇。

细胞生长在75cm²培养瓶(T75)中，一周后再次培养(每隔一天用PBS缓冲液冲洗，用胰蛋白酶去除并转移至一个新的培养瓶中)。

CaCo-2实验

为了实验，在37℃并含有5％二氧化碳和95％空气的环境中，以3×10⁵个细胞每孔的细胞密度，在6个点板中种入细胞，生长7到8天，直至融合。细胞用PBS缓冲液冲洗，并在含有样品悬浮液的4毫升培养基中培养30、60或120分钟。

在相应的培养时间之后，细胞用PBS缓冲液/甲醇＝70/30冲洗，并用1mL的甲醇去除。细胞超声处理3次，每次30秒，离心10分钟并丢弃颗粒。上层清液用作HPLC和UV/VIS分析的样品。

藏花酸和藏花酸相关酯的分析

泵：Merck Quaternary Gradient pump 6200，Merck AS 2000，

HP-MVD 1050，column oven Tech Lab

柱：Waters Sperisorb OD2，250×4.6mm

流动相：(a)含有0.1％蚁酸的甲醇

(b)0.1％蚁酸

梯度：5分钟内30％(a)，20分钟内增加至60％(b)

流速：1mL/min

温度：环境温度

注射量：20μl

检测：423nm

标准品制备(藏花酸)

适当数量的标准品被移入一个10mL烧瓶，并加入3mL甲醇溶解，添加水至刻度线。稀释液在流动相中制备。

数据评估

在线性回归分析之后，通过外部标准化执行定量评价。

虽然已经参照最优方案描述了本发明，本领域技术人员将认识到，形式上和细节的改变并不背离本发明的主旨和范围。遍及说明书的所有引用，包括背景技术，在本发明中被完整地合并。通过应用常规试验，本领域技术人员将认识到或能发现很多与本发明特定描述的具体实施例等同的方案。这种等同被确定为包含在下列权利要求的范围内。

Claims

1.一种组合物，含有藏花素、藏花酸和藏花酸单酯，来源于含有藏花素的植物提取物的水解产物，相对于藏花素提取物中发现的天然存在的藏花酸单酯，含有提高数量的藏花酸单酯，其中藏花酸单酯的提高的含量以重量计为1％以上；其中藏花酸单酯是藏花酸单葡萄糖酯、藏花酸单龙胆二糖酯或其混合物；其中藏花素：藏花酸单酯：藏花酸的比例为(5-15)：(30-50)：(5-40)重量计。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中藏花素：藏花酸单酯：藏花酸的比例为(10-15)：(30-50)：(30-40)重量计。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中藏花素：藏花酸单酯：藏花酸的比例为10：40：40重量计。

4.根据前述任一权利要求所述的组合物，其中含有藏花素的植物是栀子或藏红花。

5.一种含有权利要求1-4任一项所述组合物和载体的化妆品、药品、保健品或营养增补剂。

6.一种权利要求1-4任一项所述的组合物在制备治疗或改善抑郁、癌症、妇科炎症、心血管疾病、阿尔茨海默氏病、或老年黄斑病变药物中的用途，包含向需要的个体服用有效量的权利要求1-4任一项所述的组合物及可选择的载体的步骤，籍此，抑郁、癌症、妇科炎症、心血管疾病、阿尔茨海默氏病、或老年黄斑病变得以治疗或改善。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述心血管疾病为动脉硬化症，所述癌症为肝癌。

8.一种权利要求1-4任一项所述的组合物在制备降低高胆固醇、调节胆汁分泌或改善大脑健康的药物中的用途，包含向需要的个体服用有效量的权利要求1-4任一项所述的组合物及可选择的载体的步骤，籍此，得以降低高胆固醇、调节胆汁分泌或改善大脑健康。

9.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其所述的水解产物是经分离和／或纯化的。

10.根据权利要求5所述的化妆品、药品、保健品或营养增补剂，其所述的水解产物是经分离和／或纯化的。

11.权利要求1-4中任一项所述的组合物在制备乙酰胆碱酯酶活性抑制剂方面的用途。