TWI507202B - 醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病之藥物上之用途,其中該醫藥組成物包含山梔子(Gardenia jasminoides
)萃取物,可降低活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)含量,以達到減少多麩醯胺聚集的功效。
小腦萎縮症(spinocerebellar atrophy),又稱脊髓小腦萎縮症或脊髓小腦共濟失調症(spinocerebellar ataxia,簡寫為SCA),是一種複雜的異質性體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病(heterogeneous autosomal dominant neurodegenerative disorder),起因於致病基因中CAG三核苷酸重複擴增,轉譯出的突變蛋白包含增長的多麩醯胺鏈,聚集在神經細胞之細胞核和細胞質中。小腦萎縮症臨床症狀包括小腦功能退化及來自神經系統其他部份障礙的症狀。
目前市面上並無可治療或減緩多麩醯胺小腦
萎縮症病程的藥物,而其症狀是不能逆轉的:患者會由不能妥善地控制動作開始;隨著病情惡化,逐漸變得無法行走和提筆,最終進展至無法言語與吞嚥,最惡劣的情況下患者更會以死亡告終。然而,即使小腦、腦幹、脊髓萎縮,大腦正常的機能以及智力通常不受影響,使患者能清楚認知到身體逐漸變得不能活動的事實。
況且,目前西醫療法所使用之外科手術、放射線治療、化學療法、賀爾蒙療法、生物製劑療法等,常常對於患者身體產生強烈副作用,導致患者日趨虛弱。現今,以中藥療法進行治療係屬於比較溫和之治療方法,民眾普遍認同且具有相當高之市場接受度。
有鑒於全球罹患小腦萎縮症之人口逐漸上升,若能找出一種能夠減少多麩醯胺聚集之化合物,勢必能應用於製造不正常多麩醯胺聚集類疾病之醫藥組成物,協助治療如小腦萎縮症之神經退化性疾病,進而有效延緩疾病惡化及使病患獲得較佳的生活品質。
本發明之主要目的係在提供一種醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途,俾能協助治療如小腦萎縮症之神經退化性疾病。
本發明之另一目的係在提供一種醫藥組成物於製備降低活性氧化物含量之藥物上之用途,俾能達到減少多麩醯胺聚集之目的。
為達成上述目的,本發明提供一種醫藥組成物
於製備不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病之藥物上之用途,該醫藥組成物包括:一種或多種選自由:山梔子(Gardenia jasminoides
)萃取物、京尼平苷(geniposide)和藏花素(crocin)所組成之群組。其中,京尼平苷和藏花素分別為萃取自山梔子之活性成分,但亦可由其他中藥萃取而來。並且,山梔子萃取物、京尼平苷和藏花素皆可於市面上購得。
此外,上述醫藥組成物具有降低活性氧化物(ROS)含量之功能。在不正常多麩醯胺聚集類疾病中,變異之多麩醯胺會導致活性氧化物增加,並造成不正常摺疊之蛋白進而堆積;藉此,該醫藥組成物經由降低活性氧化物含量以降低多麩醯胺蛋白的聚集情形。該醫藥組成物可能透過增加NFE2L2(Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2)蛋白表現,進而增加下游蛋白NQO1(NAD(P)H dehydrogenase(quinone 1))、GCLC(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit)、及GSTP1(Glutathione S-transferase P)蛋白表現,以達到降低活性氧化物含量之用途。
其中,該不正常多麩醯胺聚集類疾病不受限,已知有漢丁頓疾病、脊髓延髓肌肉萎縮症、小腦萎縮症、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症等;較佳為小腦萎縮症。在小腦萎縮症中,已知有八種是多麩醯胺(polyQ)之(CAG)n重複擴增所導致,包括SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA17及DRPLA(dentatorubropallidoluy-sianatrophy)。這類與多麩醯胺擴增有關的SCA顯示對小腦、腦幹與脊髓有選
擇性漸進退化的情形,且在退化的神經中,細胞核或細胞質內有顯著地多麩醯胺蛋白聚集沉積,進而導致特定神經之功能不全及退化現象。
上述山梔子萃取物之使用濃度並無特別限制,可依實際使用狀況(如疾病嚴重程度或併用藥物等)而加以調整;於本發明之實施例中,上述山梔子萃取物之使用濃度較佳於1μg/mL至100μg/mL之範圍內,更佳於1μg/mL至50μg/mL之範圍內,最佳為1μg/mL至10μg/mL。其中,該京尼平苷和藏花素之濃度可分別介於50nM至5μM之範圍內;較佳為100nM至1μM。在本發明之實施例中,京尼平苷的濃度最佳為約500nM,藏花素的濃度最佳為約100nM。
在山梔子萃取物中,活性成分京尼平苷於動物體內經一腸道細菌(Eubacterium sp.A-44;參考文獻:Akao,T.,Kobashi,K.,Aburada,M.,1994.Enzymic studies on the animal and intestinal bacterial metabolism of geniposide.Biol.Pharm.Bull.17,1573-1576.)作用可轉換成京尼平,該腸道細菌種類可為本技術領域中具有通常知識者所知悉。據此,本發明並未限制山梔子萃取物及活性成分京尼平苷和藏花素於生物體內之作用、轉換,僅在目前已知的範疇中,由下述實驗推知京尼平能夠減少不正常多麩醯胺聚集並降低活性氧化物含量。
換言之,包含於醫藥組成物中之山梔子萃取物、京尼平苷和藏花素的有效劑量可能會根據投藥路徑、使用賦形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而變化,
本領域具有通常知識者可調整能夠對於目標物產生預期療效所需的劑量。
據此,本發明另提供一種減少多麩醯胺聚集或降低活性氧化物含量之方法,包括:提供一目標物;以及給予該目標物一醫藥組成物,該醫藥組成物包含:一山梔子(Gardenia jasminoides
)萃取物;其中,該山梔子萃取物包括至少一種活性成份,其係選自由:京尼平苷(geniposide)和藏花素(crocin)所組成之群組。
本文所使用的「降低」或「減少」名詞,係指將包含本發明之醫藥組成物,投予患有不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病(例如小腦萎縮症)、具有疾病症狀、或具有朝疾病發展傾向的目標物,以期達到治療、減輕、減緩、醫治、改善、或改進此病症、症狀之傾向。
為實行本發明所述之用途,上述化合物所製備之醫藥組成物,取決於待治療的疾病以及該疾病的嚴重程度,可經由口服、非口服、噴霧吸入、局部、經直腸、經鼻、舌下、陰道、或經由植入型藥盒(implanted reservoir)等方式投予。於此使用之「非口服」(parenteral)係指皮下注射、皮內注射、靜脈內注射、肌肉內注射、關節腔內注射、動脈內注射、關節液內注射、胸腔內注射、脊髓內注射、疾病部位內注射、及顱內注射或注入技術。
本發明之山梔子萃取物可以在市面上購買而得,或可為以水加熱萃取後,濾除藥渣所得之萃取物;然本發明並非受限於此。簡言之,將100g乾燥山梔子與1500
mL水混合,在100℃下持續30分鐘,利用100目篩網過篩;接著,將該萃取物濃縮至100mL,再使用200目篩網過篩;將該萃取物以真空濃縮儀(speed vacuum concentration)乾燥後,儲存在-20℃備用。因此,上述山梔子(Gardenia jasminoides
)萃取物所製備之醫藥組成物可透過任何習知製藥程序,例如,可經過乾燥製程,如噴霧乾燥法、冷凍乾燥法、科學中藥造粒法等,形成一乾燥形式的萃取物,進而製成預防與治療小腦萎縮症之保健食品與臨床治療用藥。例如,依據使用需求,上述化合物所製備之醫藥組成物可包括:至少一種本技術領域中之醫藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑,例如將化合物包埋在脂質體(liposome)中以利於運送、吸收;以水懸浮液、分散液或溶液稀釋以利注射;或製成膠囊、錠片形式以方便存放及攜帶。
詳述之,本發明之化合物可調配成固體或液體形式。固體製劑形式可包括,但不限於:粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑以及栓劑。固體調配物可包括,但不限於:賦形劑、調味劑、黏合劑、防腐劑、崩解劑、助流劑以及填料。液體製劑形式可包括,但不限於:水、溶液(如:丙二醇溶液)、懸浮液、以及乳劑,且該液體製劑形式可與適合的著色劑、調味劑、穩定劑以及增稠劑混合而製備。
舉例而言,粉末製劑的製備係將本發明之化合物與適合之藥學上可接受的賦形劑(如:蔗糖、澱粉以及微晶纖維素)簡單地混合。顆粒製劑的製備則是將本發明之化合物、適合之藥學上可接受的賦形劑、適合之藥學上可接
受的黏結劑(如:聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、以及羥丙基纖維素),然後透過利用溶劑(如:水、酒精及異丙醇)之濕式製粒方法製造;或是透過利用壓縮力的乾式製粒方法製造。此外,片劑製劑的製備可將顆粒製劑與適合的藥學上可接受之助流劑(如:硬脂酸鎂)混合,接著使用壓片機將其壓成片劑製劑。據此,可根據需求而選用藥物形式。
圖1A係本發明一較佳實施例之山梔子萃取物之高性能液相層析儀(HPLC)於240nm之分析圖譜。
圖1B係本發明一較佳實施例之山梔子萃取物之高性能液相層析儀(HPLC)於440nm之分析圖譜。
圖2A係本發明一較佳實施例之京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物、及組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA)對HEK-293細胞之細胞毒殺性結果。
圖2B係本發明一較佳實施例之京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物、及組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA)對SH-SY5Y細胞之細胞毒殺性結果。
圖3A係本發明一較佳實施例之經多西環素誘導之ATXN3/Q14-75
-GFP蛋白表現之西方墨點法分析結果。
圖3B係本發明一較佳實施例之經多西環素誘導之ATXN3/Q14-75
-GFP細胞表現NFE2L2蛋白之西方墨點法分析結果。
圖3C係圖3B之NFE2L2蛋白定量分析結果。
圖4係本發明一較佳實施例之經京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物、及組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA)處理之ATXN3/Q75
-GFP細胞之聚集分析結果。
圖5係本發明一較佳實施例之經京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物處理之ATXN3/Q75
-GFP 293細胞之NFE2L2、NQO1、GCLC、GSTP1蛋白西方墨點法分析結果。
圖6A係本發明一較佳實施例之經京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物處理之293細胞ATXN3/Q75
-GFP之誘導表現量分析結果。
圖6B係本發明一較佳實施例之經京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物處理之293 ATXN3/Q75
細胞之活性氧化物(ROS)分析結果。
圖7係本發明一較佳實施例之山奈酚、藏花素及山梔子萃取物之DPPH清除自由基活性分析結果。
圖8係本發明一較佳實施例之轉染ATNX3/Q75
、NFE2L2之HEK-293T細胞之聚集分析結果。
圖9A、9B、9C分別係本發明一較佳實施例之經視黃酸處理7天之SH-SY5Y ATXN3/Q75
出現聚集的與無聚集的細胞之神經突觸生長量(outgrowth)、突觸數(processes)與分枝數(branches)。
圖9D係本發明一較佳實施例之經京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物處理之SH-SY5Y ATXN3/Q75
細
胞之聚集分析結果。
[製備山梔子萃取物及HPLC分析]
以下實驗中所使用的山梔子萃取物係由台灣順天堂藥廠股份有限公司提供(Sun-Ten Pharmaceutical Company)。使用由光電二極體方陣(photo diode array detector)組成之LaChrom Elite HPLC系統(Hitachi)進行高性能液相層析(HPLC):使用Hypersil ODS(C18)管柱(250×4.6mm,5μm)對50μL(1mg/mL)之山梔子萃取物進行層析分離,並用0.1%水(A)、乙腈(B)或甲醇(C)析出;A:B:C(v/v/v)之線性梯度洗脫程序係設定為在1mL/min流速下,以80:5:15(0至8min)、70:0:30(8至30min)、15:0:85(30至50min)、80:5:15(50至60min)進行。之後,在190至600nm掃描光電二極體方陣,並在240、440nm偵測吸光值。其中0.01至1μL(50μL)之京尼平苷、藏花素係作為山梔子萃取物之參考。
[細胞培養及細胞增生試驗]
人類胚胎腎細胞HEK-293(ATCC No.CRL-1573)係使用添加10%胎牛血清DMEM培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養,人類神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(ATCC No.CRL-2266)係使用添加10%胎牛血清DMEM F12培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium F12)培養;細胞於37℃、5% CO2
條件之培養箱培養,培養20小時後,以不同濃度之山梔子萃取物(5-30mg/mL)或京尼平、京尼平苷、
藏花素(100nM~1mM)處理1天後,在每孔加入20μL MTT(tetrazolium salt,3,[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide,取5mg/mL溶於PBS中;購自Sigma)。作用2小時後,利用Bio-Tek μ Quant全波長微盤分光光度計(Universal Microplate Spectrophotometer)檢測紫色甲臢(formazan)結晶於570nm之吸光值。
[建立ATXN3之cDNA]
利用SuperScriptTM
III反轉錄酶(購自Invitrogen),將200ng之自神經母細胞瘤SK-N-SH細胞分離出之聚腺苷酸化(polyadenylated)RNA反轉錄;用於擴增ATXN3/Q14
cDNA(+826至+1152,NM_004993)之正向及反向引子分別為SEQ ID NO:1之5'-ATTCAGCTAAGTATG
CAAGGTAGTTCCA(畫線處為Met257密碼子)及SEQ ID NO:2之5'-CATGCCATGG
CATGTTTTTTTCCTTCTGTT(畫線處為Nco
I酵素位置)。接著,將擴增之含3' polyQ之cDNA片段(轉譯出胺基酸257至361)轉殖入pGEM-T Easy(購自Promega)並定序;使用Eco
RI和Nco
I切割ATXN3/Q14
cDNA後再轉殖入pEGFP-N1(購自Clontech)。然後,使用Hin
dIII-Not
I切割含ATXN3/Q14
-EGFP之DNA片段後再轉殖入pcDNA5/FRT/TO。另外,製作ATXN3/Q75
cDNA係將88bp之ATXN3/Q14 Bsm
BI-Bsm
FI片段置換成自SCA3患者cDNA株之271bp ATXN3/Q75
片段。
[等量基因的(isogenic)293與SH-SY5Y細胞株]
人類293衍生之Flp-InTM
-293細胞係如上述培養。使用轉殖之pcDNA5/FRT/TO-ATXN3/Q14
及Q75
質體,經標的插入(targeting insertion)Flp-InTM
-293細胞以形成等量基因的ATXN3/Q14-75
細胞株;細胞株皆培養於含5μg/mL殺稻瘟素(blasticidin)及100μg/mL潮黴素(hygromycin)(購自InvivoGen)的培養液中。另外,建立人類SH-SY5Y衍生之Flp-In宿主細胞株,並使用上述方法形成等量基因的ATXN3/Q14-75
細胞株,培養方式亦同。
[ATXN3/Q
75
聚集試驗]
將293 ATXN3/Q75
-GFP細胞種入96孔盤中,每孔種2×104
個細胞,培養24小時後,處理不同濃度之1至100μg/mL之山梔子萃取物、或50nM至5μM之組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA,購自Cayman Chemical)、京尼平、京尼平苷(購自ChromaDex)、藏花素(購自Sigma)。處理8小時後,每孔添加10μg/mL之多西環素(doxycycline,購自BD),作用6天以誘導ATXN3/Q75
-GFP表現。接著,使用0.1μg/mL之Hochest 33342(Sigma)染細胞,且利用高通量分析系統測定聚集量百分比。
將SH-SY5Y ATXN3/Q75
-GFP細胞種入6孔盤中,每孔種2×105
個細胞,同時在每孔添加10μM反式視黃酸(trans retinoic acid,購自Sigma)。隔天,以京尼平、京尼平苷(500nM)、藏花素(100nM)、或山梔子萃取物(10μg/mL)處理8小時,再添加5μg/mL四環黴素(doxycycline)誘導
ATXN3/Q75
-GFP表現。之後,細胞係於含10μM反式視黃酸、四環黴素及京尼平/京尼平苷/藏花素/山梔子萃取物培養一周。之後,使用0.1μg/mL之Hochest 33342染細胞,並如上述測定聚集百分比。
[西方墨點法(Western Blot)試驗]
使用含50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1% SDS及0.5%去氧膽酸鈉、1% Triton X-100、蛋白分解酶抑制劑混合物(購自Sigma)之裂解緩衝溶液打破細胞,以得到總蛋白。取25μg總蛋白於10% SDS-聚丙烯醯胺膠體進行電泳,並轉漬至硝化纖維膜。硝化纖維膜表面經阻塞(blocking)後,加入NFE2L2(以1:500稀釋,購自Santa Cruz)、NQO1(以1:1000稀釋,購自Sigma)、GCLC(以1:100稀釋,購自Abcam)、GSTP1(以1:1000稀釋,購自Abcam)、或β-肌動蛋白(以1:5000稀釋,購自Millipore),置放於4℃一晚。接著,使用以1:5000稀釋之結合辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)之山羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch)或山羊抗兔子(Rochland)之IgG抗體(GeneTex)及化學發光基質(Millipore)偵測反應複合物。
[活性氧化物(ROS)分析]
將293 ATXN3/Q75
-GFP細胞種入6孔盤中,每孔種105
個細胞,培養24小時後,處理10μg/mL之山梔子萃取物(10μg/mL)、或京尼平、京尼平苷(500nM)、藏花素(100nM)。處理8小時後,每孔添加10μg/mL之多西環素及5μM益樂鉑(Oxaliplatin,購自Sigma),以誘導
ATXN3/Q75
-GFP表現並透過抑制細胞分裂來累積聚集量。6天後加入5μM螢光試劑(CellROXTM
Deep Red Reagent,購自Molecular Probes),置於37℃。半小時後以PBS清洗細胞,用流氏細胞儀(購自Becton-Dickinson),在488/507nm波長之激發/發散下測細胞(5×104
顆)內的綠螢光(ATXN3/Q75
-GFP表現量),及在640/665nm波長之激發/發散下測細胞內的紅螢光(活性氧化物含量)。
[DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)試驗]
混合100μM DPPH自由基溶液(購自Sigma)及10至200μM京尼平、京尼平苷、藏花素或0.2至4mg/mL山梔子萃取物,震盪15秒後於室溫下靜置30分鐘。然後,利用微量分光光度計(Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer)測量在517nm波長下之吸收及下降情形,藉由方程式:1-(樣品吸光值/控制組吸光值)×100%計算自由基清除活性。抗氧化活性係以EC50
表示,其定義為抑制50% DPPH自由基形成所需之化合物濃度。
[NFE2L2 cDNA轉染]
取pOTB7的NFE2L2 cDNA(BC011558,購自食品工業發展研究所:生物資源保存及研究中心(BCRC)),使用Bam
HI和Xho
I切割後再轉殖入pcDNA3(購自Invitrogen)。在12孔盤中每孔種入5×105
個人類胚胎腎細胞(HEK-293),培養20小時後,先轉染表現ATXN3/Q75
-GFP之pcDNA5/FRT/TO-ATXN3/Q75
(1.5μg),隔天再轉染pcDNA3-NFE2L2或pcDNA3 vector(1.5μg)。
[統計分析]
數據皆以平均值±標準差(SD)來表示,各實驗皆分別執行3次獨立實驗,且利用學生t試驗(Student’s t-test)分析比較未分類之變異量,所有P值皆為雙尾(two-tailed)且P<0.05表示具有顯著差異。
[實驗結果]
[山梔子之組成及其細胞毒殺性]
本實驗利用HPLC全光譜分析、定量山梔子萃取物之化學性質,由圖1A之圖譜顯示在240nm時的峰和京尼平苷之對應滯留時間相符;而由圖1B之圖譜顯示在440nm時的峰和藏花素之對應滯留時間相符。在1g/mL山梔子萃取物中,京尼平苷、藏花素的重量百分比分別是2.33%、及1.03%,相當於60.04mM、及10.57mM。
而在MTT試驗中,處理24小時之京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物、及組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA)對HEK-293細胞及SH-SY5Y細胞之細胞毒殺性結果分別如圖2A、2B所示;其中,SAHA為已知減少polyQ聚集之對照組。據此,SAHA和京尼平對HEK-293細胞之IC50
分別為0.38mM及0.58mM;及對SH-SY5Y細胞之IC50
分別為0.02mM及0.10mM。而山梔子萃取物、京尼平苷、及藏花素之細胞毒殺性IC50
皆高於或接近最高測試濃度(山梔子萃取物>30mg/mL、京尼平苷>1mM、及藏花素:對HEK-293細胞>1mM而對SH-SY5Y細胞為0.97mM),表示其細胞毒殺性低,不會傷害細胞。
[293 ATXN3/Q
75
細胞降低NFE2L2表現]
本實驗建立了包含C端標誌有GFP之ATXN3 Q14-75
之片段,以形成誘導模式之表現ATXN3/Q14-75
-GFP之Flp-In 293細胞;其中,ATXN3/Q14
為正常蛋白表現之控制組。如圖3A所示,在多西環素(Dox)誘導之ATXN3細胞中,GFP抗體偵測到40kDa之ATXN3/Q14
-GFP及57kDa之ATXN3/Q75
-GFP蛋白。而在螢光顯微鏡下觀察其影像,ATXN3/Q14
-GFP表現情形主要為擴散分佈,而ATXN3/Q75
-GFP表現出聚集的現象(未示於圖中)。
變異之多麩醯胺會導致活性氧化物(ROS)含量增加,且NFE2L2在細胞氧還狀態中扮演了重要角色,請參照圖3B、3C,其為經多西環素誘導之ATXN3/Q14-75
-GFP細胞表現NFE2L2蛋白之西方墨點法分析結果及定量結果。ATXN3/Q75
-GFP細胞中的NFE2L2蛋白表現顯著低於ATXN3/Q14
-GFP細胞(52% vs.78%,P=0.001)
[山梔子萃取物及其活性成分在293細胞模式中降低ATXN3/Q
75
聚集]
在此實驗中,利用ATXN3/Q75
-GFP細胞檢測京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物、及組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA)對ATXN3/Q75
之影響,如圖4所示,相對未處理組,作為正對照組之SAHA(100nM)降低ATXN3/Q75
聚集量為85.9%(P=0.002),而京尼平、京尼平苷、藏花素、山梔子萃取物皆表現出比SAHA優異之抑制聚集現象(於50nM至500nM,京尼平:83.64至66.01%(P=0.004
至0.009);於1至10μg/mL,山梔子萃取物:82.8至77.3%(P=0.004至0.008);於500nM,京尼平苷:82.3%(P=0.028);及於100nM,藏花素:81.5%(P=0.007))。此外,計算出SAHA、京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物的IC50
細胞毒殺性/有效劑量(減少ATXN3/Q75
聚集現象至86%以下)比率分別為3800、11600、>2000、>10000、及>30000。由於10μg/mL山梔子萃取物含有600nM京尼平苷及106nM藏花素,實驗結果顯示500nM京尼平苷及100nM藏花素具有抑制聚集功能,表示其兩者皆為山梔子萃取物於抑制多麩醯胺聚集上之主要活性成分。並且,可看出山梔子萃取物及京尼平的有效範圍較廣(山梔子萃取物:1μg/mL至10μg/mL;京尼平:50nM至500nM),較佳適合作為醫藥組成物之成分。
[山梔子萃取物及其活性成分表現NFE2L2、NQO1、GCLC及GSTP1]
在添加山梔子萃取物及其活性成分及/或多西環素下,比較NFE2L2、NQO1、GCLC及GSTP1表現情形,以檢測是否山梔子萃取物及其活性成分可正調控NFE2L2及下游NQO1、GCLC及GSTP1蛋白表現。將ATXN3/Q75
細胞先以京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物處理8小時,再以多西環素誘導6天。圖5為利用西方墨點法分析之NFE2L2、NQO1、GCLC及GSTP1之相對表現量,其中ACTB為控制組。結果顯示:在使用多西環素誘導6天後,NFE2L2(40%,P=0.000)、NQO1(58%,P=0.024)、GCLC(88%,
P=0.027)及GSTP1(78%,P=0.012)表現量顯著下降,而此下降情形可利用添加京尼平(500nM)、京尼平苷(500nM)、藏花素(100nM)、或山梔子萃取物(10μg/mL)來回復,具有顯著上升情形(NFE2L2(78%~86% vs.40%,P=0.003~0.000)、NQO1(137%~154% vs.58%,P=0.002~0.0001)、GCLC(105%~113% vs.88%,P=0.024~0.001)、及GSTP1(99%~109% vs.78%,P=0.043~0.001))。據此,添加京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物可正調控NFE2L2、NQO1、GCLC及GSTP1蛋白表現,進而減少ATXN3/Q75
聚集。
[山梔子萃取物及其活性成分降低活性氧化物]
在添加山梔子萃取物及其活性成分及/或多西環素下,比較ATXN3/Q75
-GFP螢光及細胞內活性氧化物含量。如圖6A、6B所示,在是否添加京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物前處理及使用多西環素誘導6天後,各組間細胞內表現的ATXN3/Q75
-GFP螢光量沒有顯著差異(215~228,P=0.169~0.274),但山梔子萃取物及其活性成分前處理,可顯著降低ATXN3/Q75
-GFP表現後的活性氧化物含量(由814降至715~736,P=0.002-0.000),證實山梔子萃取物及其活性成分確實可降低活性氧化物。
[山梔子萃取物及其活性成分之清除自由基活性]
在此實驗中,使用具有強抗氧化能力之山奈酚(Kaempferol)做為正對照組。如圖7所示,京尼平、京尼平苷因未偵測到自由基清除活性,故未示於圖中;山奈酚、
藏花素、及山梔子萃取物之EC50
分別為27μM、277μM、及1.2mg/ml。藉此,由於1.2mg/ml的山梔子萃取物包含12.7μM藏花素,且藏花素之EC50
為277μM,表示藏花素並非為山梔子萃取物中用以清除自由基的主要成分。
[過量表現NFE2L2降低ATXN3/Q
75
聚集]
如圖8所示,表現NFE2L2顯著降低ATXN3/Q75
細胞的聚集量(44.0% vs.54.5%,P=0.020)。由此可推知,京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物藉由正調控NFE2L2及其下游基因表現,進而抑制多麩醯胺聚集。
[山梔子萃取物及其活性成分誘導SH-SY5Y AXTN3/Q
75
細胞及其神經表型]
當使用視黃酸處理ATXN3/Q14-75
-GFP SH-SY5Y細胞7天促進神經分化,在顯微鏡下可發現在約1%已神經分化的ATXN3/Q75
-GFP細胞中形成聚集,而ATXN3/Q14
-GFP細胞則未有聚集現象,形成的聚集量並隨著時間增加而增加(未示於圖中)。如圖9A至9C所示,出現聚集的ATXN3/Q75
-GFP細胞與無聚集的ATXN3/Q75
-GFP細胞相比,有聚集的細胞呈現顯著減少神經突觸生長量(total outgrowth)、突觸數(processes)、及分枝數(branches)的現象(神經突觸生長量:5.62μm vs.23.88μm,P=0.000;突觸數:1.21% vs.2.22%,P=0.002:及分枝數:0.04% vs.0.68%,P=0.001)。而在京尼平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物前處理下,請參照圖9D,ATXN3/Q75
-GFP表現的神經細胞聚集分別降低了18%、21%、21%、及25%。結果表示:經由京尼
平、京尼平苷、藏花素、及山梔子萃取物前處理,ATXN3/Q75
-GFP表現的神經細胞可減少聚集,並伴隨著NFE2L2表現增加(未示於圖中)。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已,本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準,而非僅限於上述實施例。
<110> 國立台灣師範大學/National Taiwan Normal University
<120> 醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途/Use of Pharmaceutical Composition for Manufacturing Drug of Abnormal Polyglutamine-Mediated Disease
<130> S6300
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized primer
<400> 1
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthesized primer
<400> 2
Claims (8)
- 一種醫藥組成物在製備治療小腦萎縮症(Spinocerebellar Ataxia)之藥物的用途,該醫藥組成物包括:一種或多種選自由:山梔子(Gardenia jasminoides )萃取物、京尼平苷(geniposide)和藏花素(crocin)所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該山梔子萃取物之濃度係介於1μg/mL至100μg/mL之範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該京尼平苷和藏花素之濃度係分別介於50nM至5μM之範圍內。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該醫藥組成物更包括:至少一種醫藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該醫藥組成物中之該山梔子係以水加熱萃取後,濾除藥渣所得之萃取物。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,京尼平苷係經一腸道細菌作用而轉換成京尼平(Genipin)。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該醫藥組成物係透過增加NFE2L2(Nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2)蛋白表現以抑制不正常多麩醯胺聚集。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中,該醫藥組成物係透過增加NQO1(NAD(P)H dehydrogenase(quinone 1))、GCLC(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit)、及GSTP1 (Glutathione S-transferase P)蛋白表現以抑制不正常多麩醯胺聚集。
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Ajayi, A et al,"Expanded ataxin-7 cause toxicity by inducing ROS production from NADPH oxidase complexes in a stable inducible Spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7) model", BMC NEUROSCIENCE, 2012, 13:86. * |
Deslauriers, AM et al,"Neuroinflammation and Endoplasmic Reticulum Stress Are Coregulated by Crocin To Prevent Demyelination and Neurodegeneration", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, 2011, 187:4788-4799 * |
Tanaka, M et al,"Neuroprotective Action of Genipin on Tunicamycin-Induced Cytotoxicity in Neuro2a Cells", BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, 2009, 32(7): 1220-1223 * |
Yin F et al,"Geniposide induces the expression of heme oxygenase-1 via PI3K/Nrf2-signaling to enhance the antioxidant capacity in primary hippocampal neurons", BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, 2010, 33(11):1841-1846 * |
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