TWI515003B - 醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途 - Google Patents

Description

醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上 之用途

本發明係關於一種醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病之藥物上之用途，其中該醫藥組成物包含脹果甘草(Glycyrrhiza inflata)萃取物，可增強粒線體新生及降低活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)含量，以達到減少多麩醯胺聚集的功效。

小腦萎縮症(spinocerebellar atrophy)，又稱脊髓小腦萎縮症或脊髓小腦共濟失調症(spinocerebellar ataxia，簡寫為SCA)，是一種複雜的異質性體染色體顯性遺傳的神經退化性疾病(heterogeneous autosomal dominant neurodegenerative disorder)，起因於致病基因中CAG三核苷酸重複擴增，轉譯出的突變蛋白包含增長的多麩醯胺鏈，聚集在神經細胞之細胞核及/或細胞質中。小腦萎縮症臨床症狀包括小腦功能退化及來自神經系統其他部份障礙的症狀。

目前市面上並無可治療或減緩多麩醯胺小腦 萎縮症病程的藥物，而其症狀是不能逆轉的：患者會由不能妥善地控制動作開始；隨著病情惡化，逐漸變得無法行走和提筆，最終進展至無法言語與吞嚥，最惡劣的情況下患者更會以死亡告終。然而，即使小腦、腦幹、脊髓萎縮，大腦正常的機能以及智力通常不受影響，使患者能清楚認知到身體逐漸變得不能活動的事實。

況且，目前西醫療法所使用之外科手術、放射線治療、化學療法、賀爾蒙療法、生物製劑療法等，常常對於患者身體產生強烈副作用，導致患者日趨虛弱。現今，以中藥療法進行治療係屬於比較溫和之治療方法，民眾普遍認同且具有相當高之市場接受度。

有鑒於全球罹患小腦萎縮症之人口逐漸上升，若能找出一種能夠減少多麩醯胺聚集之化合物，勢必能應用於製造不正常多麩醯胺聚集類疾病之醫藥組成物，協助治療如小腦萎縮症之神經退化性疾病，進而有效延緩疾病惡化及使病患獲得較佳的生活品質。

本發明之主要目的係在提供一種醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途，俾能協助治療如小腦萎縮症之神經退化性疾病。

本發明之另一目的係在提供一種醫藥組成物於製備降低活性氧化物含量之藥物、或促進粒線體新生之藥物上之用途，俾能達到減少多麩醯胺聚集之目的。

為達成上述目的，本發明提供一種醫藥組成物 於製備不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病之藥物上之用途，該醫藥組成物包括：一種或多種選自由：脹果甘草(Glycyrrhiza inflata)萃取物、甘草酸銨(ammonium glycyrrhizinate)和甘草查耳酮A(licochalcone A)所組成之群組。其中，甘草酸銨和甘草查耳酮A分別為萃取自脹果甘草之活性成分，但亦可由其他中藥萃取而來。並且，脹果甘草萃取物、甘草酸銨和甘草查耳酮A皆可於市面上購得。

此外，上述醫藥組成物具有促進粒線體新生、降低活性氧化物(ROS)含量之功能。在不正常多麩醯胺聚集類疾病中，變異之多麩醯胺會導致活性氧化物增加，並造成不正常摺疊之蛋白進而堆積；藉此，該醫藥組成物經由促進粒線體新生及降低活性氧化物含量，以減少多麩醯胺蛋白的聚集情形。該醫藥組成物可能透過增加PPARGC1A(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)、NFE2L2(nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2)蛋白表現，進而增加下游蛋白NQO1(NAD(P)H dehydrogenase(quinone 1))、GCLC(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit)、GSTP1(glutathione S-transferase P)、SOD2(superoxide dismutase 2)、及CYCS(cytochrome c,somatic)蛋白表現，以達到降低活性氧化物含量之用途。

其中，該不正常多麩醯胺聚集類疾病不受限，除小腦萎縮症外，還包括漢丁頓疾病(Huntington's disease)、脊髓延髓肌肉萎縮症(spinal and bulbar muscular atrophy)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(dentatorubropallidoluysian atrophy) 等；較佳為小腦萎縮症。在小腦萎縮症中，已知有七種是多麩醯胺(polyQ)之(CAG)n重複擴增所導致，包括SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、及SCA17。這類與多麩醯胺擴增有關的SCA顯示對小腦、腦幹與脊髓有選擇性漸進退化的情形，且在退化的神經中，細胞核或細胞質內有顯著地多麩醯胺蛋白聚集沉積，進而導致特定神經之功能不全及退化現象。

上述脹果甘草萃取物之使用濃度並無特別限制，可依實際使用狀況(如疾病嚴重程度或併用藥物等)而加以調整；於本發明之實施例中，上述脹果甘草萃取物之使用濃度較佳於5μg/mL至500μg/mL之範圍內，更佳於10μg/mL至50μg/mL之範圍內。其中，該甘草酸銨之濃度較佳可介於0.1μM至100μM之範圍內；較佳為1μM至50μM。甘草查耳酮A之濃度可介於1nM至100nM之範圍內，較佳為1nM至50nM。在本發明之實施例中，脹果甘草萃取物的濃度最佳為約50μg/mL，甘草酸銨的濃度最佳為約1μM，甘草查耳酮A的濃度最佳為約10nM。

在脹果甘草萃取物中，活性成分甘草酸銨於動物體內經一腸道細菌作用可轉換成18 β-甘草酸(18 β-glycyrrhetinic acid)(參考文獻：Akao T,Akao T,Hattori M et al.1991.Hydrolysis of glycyrrhizinto 18 β-glycyrrhetyl monoglucuronide by lysosomal beta-D-glucuronidase of animal livers.Biochem Pharmacol 41：1025-1029.)，該腸道細菌種類可為本技術領域中具有通常知識者所知悉。據此，本發明 並未限制脹果甘草萃取物及活性成分甘草酸銨和甘草查耳酮A於生物體內之作用、轉換，僅在目前已知的範疇中，由下述實驗推知甘草酸銨能夠減少不正常多麩醯胺聚集並降低活性氧化物含量。

換言之，包含於醫藥組成物中之脹果甘草萃取物、甘草酸銨和甘草查耳酮A的有效劑量可能會根據投藥路徑、使用賦形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而變化，本領域具有通常知識者可調整能夠對於目標物產生預期療效所需的劑量。

據此，本發明另提供一種減少多麩醯胺聚集、促進粒線體新生、或降低活性氧化物含量之方法，包括：提供一目標物；以及給予該目標物如上述之醫藥組成物。

本文所使用的「降低」或「減少」名詞，係指將包含本發明之醫藥組成物，投予患有不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病(例如小腦萎縮症)、具有疾病症狀、或具有朝疾病發展傾向的目標物，以期達到治療、減輕、減緩、醫治、改善、或改進此病症、症狀之傾向。

為實行本發明所述之用途，上述化合物所製備之醫藥組成物，取決於待治療的疾病以及該疾病的嚴重程度，可經由口服、非口服、噴霧吸入、局部、經直腸、經鼻、舌下、陰道、或經由植入型藥盒(implanted reservoir)等方式投予。於此使用之「非口服」(parenteral)係指皮下注射、皮內注射、靜脈內注射、肌肉內注射、關節腔內注射、動脈內注射、關節液內注射、胸腔內注射、脊髓內注射、疾 病部位內注射、及顱內注射或注入技術。

本發明之脹果甘草萃取物可以在市面上購買而得，或可為以水加熱萃取後，濾除藥渣所得之萃取物；然本發明並非受限於此。簡言之，將100g乾燥脹果甘草與1500mL水混合，在100℃下持續30分鐘，利用100目篩網過篩；接著，將該萃取物濃縮至100mL，再使用200目篩網過篩；將該萃取物以真空濃縮儀(speed vacuum concentration)乾燥後，儲存在-20℃備用。因此，上述脹果甘草萃取物所製備之醫藥組成物可透過任何習知製藥程序，例如，可經過乾燥製程，如噴霧乾燥法、冷凍乾燥法、科學中藥造粒法等，形成一乾燥形式的萃取物，進而製成預防與治療小腦萎縮症之保健食品與臨床治療用藥。例如，依據使用需求，上述化合物所製備之醫藥組成物可包括：至少一種本技術領域中之醫藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑，例如將化合物包埋在脂質體(liposome)中以利於運送、吸收；以水懸浮液、分散液或溶液稀釋以利注射；或製成膠囊、錠片形式以方便存放及攜帶。

詳述之，本發明之化合物可調配成固體或液體形式。固體製劑形式可包括，但不限於：粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑以及栓劑。固體調配物可包括，但不限於：賦形劑、調味劑、黏合劑、防腐劑、崩解劑、助流劑以及填料。液體製劑形式可包括，但不限於：水、溶液(如：丙二醇溶液)、懸浮液、以及乳劑，且該液體製劑形式可與適合的著色劑、調味劑、穩定劑以及增稠劑混合而製備。

舉例而言，粉末製劑的製備係將本發明之化合物與適合之藥學上可接受的賦形劑(如：蔗糖、澱粉以及微晶纖維素)簡單地混合。顆粒製劑的製備則是將本發明之化合物、適合之藥學上可接受的賦形劑、適合之藥學上可接受的黏結劑(如：聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、以及羥丙基纖維素)，然後透過利用溶劑(如：水、酒精及異丙醇)之濕式製粒方法製造；或是透過利用壓縮力的乾式製粒方法製造。此外，片劑製劑的製備可將顆粒製劑與適合的藥學上可接受之助流劑(如：硬脂酸鎂)混合，接著使用壓片機將其壓成片劑製劑。據此，可根據需求而選用藥物形式。

圖1A係本發明一較佳實施例之脹果甘草萃取物之高性能液相層析儀(HPLC)於250nm之分析圖譜。

圖1B係本發明一較佳實施例之脹果甘草萃取物之高性能液相層析儀(HPLC)於368nm之分析圖譜。

圖2A係本發明一較佳實施例之脹果甘草萃取物、甘草酸銨、甘草查耳酮A、及薑黃對HEK-293細胞之細胞毒殺性結果。

圖2B係本發明一較佳實施例之脹果甘草萃取物、甘草酸銨、甘草查耳酮A、及薑黃對SH-SY5Y細胞之細胞毒殺性結果。

圖3A係本發明一較佳實施例之經SAHA、薑黃、脹果甘 草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之ATXN3/Q₇₅-GFP細胞之聚集分析結果。

圖3B係本發明一較佳實施例之經SAHA、及18β-甘草酸處理之ATXN3/Q₇₅-GFP細胞之聚集分析結果。

圖4係本發明一較佳實施例之經多西環素(+Dox)誘導ATXN3/Q₇₅-GFP 293細胞表現之經脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之caspase 3活性分析結果。

圖5係本發明一較佳實施例之經AICAR、薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之PPARGC1A螢光報導細胞之螢光量結果。

圖6A係本發明一較佳實施例之經脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之ATXN3/Q₇₅-GFP 293細胞之PPARGC1A、NFE2L2、HMOX1、NQO1、SOD2、及CYCS之即時聚合酶連鎖反應分析結果。

圖6B係本發明一較佳實施例之經薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之ATXN3/Q₇₅-GFP 293細胞之PPARGC1A、NFE2L2、NQO1、GCLC、GSTP1、SOD2、及CYCS蛋白西方墨點法分析結果。

圖7A係本發明一較佳實施例之共轉染ATNX3/Q₇₅-GFP和PPARGC1A siRNA(或控制組siRNA)之HEK-293T細胞之PPARGC1A、NFE2L2蛋白表現分析結果。

圖7B係本發明一較佳實施例之HEK-293T細胞，經脹果甘草萃取物前處理8小時(或無脹果甘草萃取物前處理) 後，共轉染ATNX3/Q₇₅-GFP和PPARGC1A siRNA(或控制組siRNA)之聚集分析結果。

圖8A係本發明一較佳實施例之經薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之293細胞ATXN3/Q₇₅-GFP之誘導表現量(+Dox)分析結果。

圖8B係本發明一較佳實施例之經薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之293細胞ATXN3/Q₇₅-GFP誘導表現(+Dox)後，細胞之活性氧化物(ROS)分析結果。

圖9係本發明一較佳實施例之山奈酚、薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A之DPPH清除自由基活性分析結果。

圖10A、10B、10C分別係本發明一較佳實施例之經視黃酸處理7天之SH-SY5Y ATXN3/Q₇₅細胞，出現聚集與無聚集細胞之神經突觸生長量(outgrowth)、突觸數(processes)與分枝數(branches)。

圖10D係本發明一較佳實施例之經薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A處理之SH-SY5Y ATXN3/Q₇₅細胞之聚集分析結果。

[製備脹果甘草萃取物及HPLC分析]

以下實驗中所使用的脹果甘草萃取物係由台灣順天堂藥廠股份有限公司提供(Sun-Ten Pharmaceutical Company)。使用由光電二極體方陣(photo diode array detector) 組成之LaChrom Elite HPLC系統(Hitachi)進行高性能液相層析(HPLC)：使用Hypersil ODS(C18)管柱(250×4.6mm，5μm)對50μL(1mg/mL)之脹果甘草萃取物進行層析分離，並用0.04%甲酸(A)或乙腈(B)析出；A：B(v/v)之線性梯度洗脫程序係設定為在1mL/min流速下，以20%B(0至4min)、20~38%B(4至20min)、38~55%B(20至25min)、55~90%B(25至38min)、90%B(38至50min)、20%B(50至65min)進行。管柱及送樣器分別維持在30℃、10℃。之後，在190至400nm掃描光電二極體方陣，並在250、368nm偵測吸光值。其中0.01至1mM(50μL)之甘草酸銨、甘草查耳酮A係作為脹果甘草萃取物之參考。

[細胞培養及細胞增生試驗]

人類胚胎腎細胞HEK-293(ATCCNo.CRL-1573)係使用添加10%胎牛血清DMEM培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium)培養，人類神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y(ATCC No.CRL-2266)係使用添加10%胎牛血清DMEM F12培養液(Dulbecco's modified Eagle's medium F12)培養；細胞於37℃、5%CO₂條件之培養箱培養，培養20小時後，以不同濃度之脹果甘草萃取物(5~30mg/mL)或甘草酸銨、甘草查耳酮A(100nM~1mM)處理1天後，在每孔加入20μL MTT(3,[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，5mg/mL，溶於PBS中；購自Sigma)。作用2小時後，利用Bio-Tek μQuant全波長微盤分光光度計(Universal Microplate Spectrophotometer)檢測紫色甲臢(formazan)結晶 於570nm之吸光值。在此實驗中，使用已知藥物薑黃(C.longa)作為正對照組，薑黃為已知抗類澱粉沉積(amyloidogenic)之藥物。

[建立ATXN3之cDNA]

利用SuperScript^TM III反轉錄酶(購自Invitrogen)，將200ng之自神經母細胞瘤SK-N-SH細胞分離出之聚腺苷酸化(polyadenylated)RNA反轉錄；用於擴增ATXN3/Q₁₄ cDNA(+826至+1152，NM_004993)之正向及反向引子分別為SEQ ID NO：1之5'-ATTCAGCTAAGTATGCAAGGTAGTTCCA(畫線處為Met257密碼子)及SEQ ID NO：2之5'-CATGCCATGGCATGTTTTTTTCCTTCTGTT(畫線處為NcoI酵素位置)。接著，將擴增之含3' polyQ之cDNA片段(轉譯出胺基酸257至361)置入pGEM-T Easy(購自Promega)並定序；使用EcoRI和NcoI切割ATXN3/Q₁₄ cDNA後再置入pEGFP-N1(購自Clontech)。然後，使用HindIII-NotI切割含ATXN3/Q₁₄-EGFP之DNA片段後再置入pcDNA5/FRT/TO載體。另外，製作ATXN3/Q₇₅ cDNA係將88bp之ATXN3/Q₁₄ BsmBI-BsmFI片段置換成自SCA3患者cDNA株之271bp ATXN3/Q₇₅片段。

[等量基因的(isogenic)293與SH-SY5Y細胞株]

人類293衍生之Flp-In^TM-293細胞係如上述培養。使用建構之pcDNA5/FRT/TO-ATXN3/Q₁₄及Q₇₅質體，經標的插入(targeting insertion)Flp-In^TM-293細胞，以形成等量 基因的ATXN3/Q_14~75細胞株。細胞株皆培養於含5μg/mL殺稻瘟素(blasticidin)及100μg/mL潮黴素(hygromycin)(購自InvivoGen)的培養液中。另外，建立人類SH-SY5Y衍生之Flp-In宿主細胞株，並使用上述方法形成等量基因的ATXN3/Q_14~75細胞株，培養方式亦同。

[ATXN3/Q ₇₅ 聚集試驗]

將293 ATXN3/Q₇₅-GFP細胞種入96孔盤中，每孔種2×10⁴個細胞，培養24小時後，處理不同濃度之5μg/mL至5mg/mL之脹果甘草萃取物、0.1μM至100μM之甘草酸銨、1nM至1000nM之甘草查耳酮A、10μg/mL至3mg/mL之薑黃、100nM之組蛋白去乙醯酶抑制劑(SAHA，購自Cayman Chemical)；其中，除了使用薑黃做為正對照組外，亦使用SAHA作為正對照組，SAHA為已知polyQ聚集之抑制劑。細胞經上述中草藥或化合物前處理8小時後，每孔添加10μg/mL之多西環素(doxycycline，購自BD)和5μM益樂鉑(oxaliplatin，購自Sigma)，作用6天以誘導ATXN3/Q₇₅-GFP表現。接著，使用0.1μg/mL之Hoechst 33342(購自Sigma)染細胞，且利用高通量分析(HCA)系統測定聚集量百分比。

另外，由於甘草酸銨於動物體內經一腸道細菌作用可轉換成18 β-甘草酸，以上述相同實驗方式對293ATXN3/Q₇₅-GFP細胞處理0.1μM至10μM之18 β-甘草酸，亦使用SAHA作為正對照組，測定聚集量百分比。

將SH-SY5Y ATXN3/Q₇₅-GFP細胞種入6孔盤 中，每孔種2×10⁵個細胞，同時在每孔添加10μM反式視黃酸(trans retinoic acid，購自Sigma)。隔天，以10μg/mL之薑黃、10μg/mL之脹果甘草萃取物、0.2μM之甘草酸銨、或2nM之甘草查耳酮A處理8小時，再添加5μg/mL四環黴素(doxycycline)誘導ATXN3/Q₇₅-GFP表現。之後，細胞係於含10μM反式視黃酸、四環黴素及薑黃/脹果甘草萃取物/甘草酸銨/甘草查耳酮A培養6天。之後，使用0.1μg/mL之Hoechst 33342染細胞，並如上述測定聚集百分比。

[caspase 3活性試驗]

利用Caspase 3 Assay Kit(購自Sigma)測試caspase 3活性，其方法如下：取10⁶細胞，加入溶破緩衝液(100μL)，置於冰上20分鐘。之後進行離心，取上清液測定蛋白質含量，並以受質乙醯基-Asp-Glu-Val-Asp-7-氨基-4-甲基香豆素(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-methylcoumarin，Ac-DEVD-AMC)測定caspase 3活性。最後以Bio-Tek FLx800微盤螢光儀，於360nm激發濾光片、460nm發散濾光片，測定所釋出的AMC螢光，並依據AMC螢光標準曲線計算caspase 3活性。

[293螢光報導細胞及螢光試驗]

於pAmCyanl-N1建立包含mCherry之螢光報導基因質體，將PPARGC1A(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，一種粒線體轉錄因子)的啟動子片段放置在螢光報導基因mCherry之前端，形成螢 光報導基因細胞。

在96孔盤中每孔種入5×10⁴個細胞，培養兩天後，在培養液中加入各濃度之AICAR(100至250μM)、薑黃(1.5至15mg/mL)、脹果甘草萃取物(1.5至15mg/mL)、甘草酸銨(40至400μM)、及甘草查耳酮A(0.3至3μM)；其中薑黃和AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside)做為正對照組，AICAR為AMPK(AMP-activated protein kinase)的活化劑，可促進PPARGC1A mRNA表現。作用24小時後，使用高通量分析(HCA)系統(ImageXpressMICRO，購自Molecular Devices)，在激發/發散波長453/486nm分析螢光量。

[即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)]

將293 ATXN3/Q₇₅細胞種入96孔盤中，每孔種2×10⁴個細胞，培養24小時後，處理50μg/mL之脹果甘草萃取物、1μM之甘草酸銨、或10nM之甘草查耳酮A；處理8小時後，每孔添加10μg/mL之多西環素，作用6天以誘導ATXN3/Q₇₅表現。使用Trizol試劑(Invitrogen)從ATXN3/Q₇₅細胞中分離出全部RNA，以DNase(Stratagene)處理、定量後反轉錄成cDNA。取100ng cDNA，利用基因專一性的TaqMan螢光探針Hs01016719(測定PPARGC1A mRNA)、Hs00232352_ml(測定NFE2L2 mRNA)、Hs01110250_ml(測定HMOX1 mRNA)、Hs00168547_ml(測定NQO1 mRNA)、Hs01553554_ml(測定SOD2 mRNA)、Hs01588973_ml(測定CYCS mRNA)、及4326321E(測定內生 性控制組HPRT1 mRNA)(購自Applied Biosystems)，以ABI PRISM® 7000序列偵測系統(Applied Biosystems)進行即時定量PCR，分析PPARGC1A、NFE2L2、HMOX1、NQO1、SOD2、CYCS之表現情形。

[西方墨點法(Western Blot)試驗]

將293 ATXN3/Q₇₅細胞先以薑黃(50μg/mL)、脹果甘草萃取物(50μg/mL)、甘草酸銨(1μM)、或甘草查耳酮A(10nM)處理8小時，再以多西環素誘導6天。使用含50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1%SDS及0.5%去氧膽酸鈉、1%Triton X-100、蛋白分解酶抑制劑混合物(購自Sigma)之裂解緩衝溶液打破細胞，以得到總蛋白。取25μg總蛋白於10%SDS-聚丙烯醯胺膠體進行電泳，並轉漬至硝化纖維膜。硝化纖維膜表面經阻塞(blocking)後，加入PPARGC1A(以1：500稀釋，購自Abcam)、NFE2L2(以1：250稀釋，購自Santa Cruz)、NQO1(以1：1500稀釋，購自Sigma)、GCLC(以1：100稀釋，購自Abcam)、GSTP1(以1：1000稀釋，購自Abcam)、SOD2(以1：200稀釋，購自Santa Cruz)、CYCS(以1：400稀釋，購自Santa Cruz)、或β-肌動蛋白(以1：5000稀釋，購自Millipore)，置放於4℃一晚。接著，使用以1：5000稀釋之結合辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)之山羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch)或山羊抗兔子(Rochland)之IgG抗體(GeneTex)及化學發光基質(Millipore)偵測反應複合物。

[PPARGC1A cDNA轉染]

將HEK-293T細胞種入12孔盤中，每孔種2×10⁵個細胞，培養20小時後，使用脹果甘草萃取物(10μg/mL)處理細胞。8小時後，共同轉染ATXN3/Q₇₅-GFP(1.5μg)和PPARGC1A siRNA(50pmol)(sc-38884，購自Santa Cruz)。放置2天後使用0.1μg/mL之Hoechst 33342(購自Sigma)染細胞，且利用高通量分析系統測定聚集量百分比。此外，利用西方墨點法分析PPARGC1A、NFE2L2蛋白表現。

[活性氧化物(ROS)分析]

將293 ATXN3/Q₇₅細胞種入6孔盤中，每孔種10⁵個細胞，培養24小時後，處理薑黃(50μg/mL)、脹果甘草萃取物(50μg/mL)、甘草酸銨(1μM)、或甘草查耳酮A(10nM)。處理8小時後，每孔添加10μg/mL之多西環素及5μM益樂鉑(Oxaliplatin，購自Sigma)，以誘導ATXN3/Q₇₅表現，並透過抑制細胞分裂來累積聚集量。6天後加入5μM螢光試劑(CellROX^TM Deep Red Reagent，購自Molecular Probes)，置於37℃。半小時後以PBS清洗細胞，用流氏細胞儀(購自Becton-Dickinson)，在488/507nm波長之激發/發散下測細胞(5×10⁴顆)內的綠螢光(ATXN3/Q₇₅-GFP表現量)，及在640/665nm波長之激發/發散下測細胞內的紅螢光(活性氧化物含量)。

[DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)試驗]

混合100μM DPPH自由基溶液(購自Sigma)及薑黃(50μg/mL)、脹果甘草萃取物(50μg/mL)、甘草酸銨(1μM)、或甘草查耳酮A(10nM)，震盪15秒後於室溫下靜置 30分鐘。然後，利用微量分光光度計(Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotometer)測量在517nm波長下之吸收及下降情形，藉由方程式：1-(樣品吸光值/控制組吸光值)×100%計算自由基清除活性。抗氧化活性係以EC₅₀表示，其定義為抑制50%DPPH自由基形成所需之化合物濃度。

[統計分析]

數據皆以平均值±標準差(SD)來表示，各實驗皆分別執行3次獨立實驗，且利用學生t試驗(Student’s t-test)分析比較未分類之變異量，所有P值皆為雙尾(two-tailed)且P<0.05表示具有顯著差異。

[實驗結果]

[脹果甘草之組成及其細胞毒殺性]

本實驗利用HPLC全光譜分析、定量脹果甘草萃取物之化學性質，由圖1A之圖譜顯示在250nm時的峰和甘草酸銨之對應滯留時間相符；而由圖1B之圖譜顯示在368nm時的峰和甘草查耳酮A之對應滯留時間相符。在1g/mL脹果甘草萃取物中，甘草酸銨、甘草查耳酮A的重量百分比分別是2.23%、及0.007%，相當於26.6mM、及0.2mM。

而在MTT試驗中，處理24小時之脹果甘草萃取物、甘草酸銨、甘草查耳酮A、及薑黃，對HEK-293細胞及SH-SY5Y細胞之細胞毒殺性結果分別如圖2A、2B所示；細胞存活率係將未處理細胞設定為100%之相對值，圖中並標示出50%存活率線。據此，薑黃、脹果甘草萃取物、 甘草酸銨、及甘草查耳酮A對HEK-293細胞之IC₅₀分別為16.48mg/mL、26.72mg/mL、>1mM及0.30mM；及對SH-SY5Y細胞之IC₅₀分別為14.24mg/mL、21.29mg/mL、0.36mM及0.06mM。而脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及薑黃之細胞毒殺性IC₅₀皆高於或接近最高測試濃度，表示其細胞毒殺性極低，不會傷害細胞。

[脹果甘草萃取物及其活性成分在293細胞模式中降低ATXN3/Q ₇₅ 聚集]

在此實驗中，利用ATXN3/Q₇₅細胞檢測SAHA、薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A對ATXN3/Q₇₅之影響。如圖3A所示，相對聚集量係將未處理細胞設定為100%之相對值，圖中並標示出SAHA處理組之85%聚集量。相對未處理組，作為正對照組之SAHA(100nM)降低ATXN3/Q₇₅聚集量為85%(P=0.011)，而薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A皆表現出比未處理細胞較優之抑制聚集現象(於10~1500μg/mL，薑黃：81~83%，P=0.013~0.007；於5~500μg/mL，脹果甘草萃取物：80~85%，P=0.009~0.002；於0.1~100μM，甘草酸銨：78~83%，P=0.022~0.007；及於1~100nM，甘草查耳酮A：80~84%，P=0.015~0.002)。由於5~500μg/mL脹果甘草萃取物含有0.13~12.5μM甘草酸銨及1~100nM甘草查耳酮A，實驗結果顯示0.1~100μM甘草酸銨及1~100nM甘草查耳酮A具有抑制聚集功能，表示其兩者皆為脹果甘草萃取物於抑制多麩醯胺聚集上之主要活性成分。

另外，請參照圖3B，在18β-甘草酸處理下，證實甘草酸銨於動物體內經一腸道細菌作用轉換後，仍具有降低ATXN3/Q₇₅聚集的效果。

[脹果甘草萃取物及其活性成分在293細胞模式中降低caspase 3活性]

經過6天誘導ATXN3/Q₇₅-GFP表現後，caspase 3活性試驗結果如圖4所示；caspase 3活性係將未誘導組細胞設定為100%之相對值。和未誘導組相比，經過6天誘導ATXN3/Q₇₅-GFP表現之細胞中，caspase 3活性顯著增加；而和未處理組相比，分別經過50μg/mL之脹果甘草萃取物、1μM之甘草酸銨、及10nM之甘草查耳酮A處理的細胞中，caspase 3活性顯著下降(99~102%vs.119%，P=0.021~0.002)。

[脹果甘草萃取物及其活性成分在293報導細胞中促進PPARGC1A活性]

如圖5所示，PPARGC1A活性係將未誘導組細胞設定為100%之相對值。和未處理組相比，在100~250μM之AICAR處理下，顯著提升PPARGC1A啟動子活性(119~113%，P=0.004~0.036)；而在處理3~15mg/mL之薑黃、3~15mg/mL之脹果甘草萃取物、160~400μM之甘草酸銨、及1.2~3μM甘草查耳酮A下亦有相同趨勢(薑黃：118~169%，P=0.044~0.002；脹果甘草萃取物：126~190%，P=0.037~0.004；甘草酸銨：113~147%，P=0.047~0.013；及甘草查耳酮A：126~148%，P=0.028~0.008)。

[脹果甘草萃取物及其活性成分在293 ATXN3/Q ₇₅ 細胞模式中促進PPARGC1A、NFE2L2、HMOX1、NQO1、SOD2、CYCS、GCLC、及GSTP1表現]

HMOX1、NQO1、SOD2、CYCS、GCLC、及GSTP1皆為PPARGC1A和NFE2L2的下游表現基因，這些基因功能皆與粒線體新生(biogenesis)和抗氧化有關。如圖6A所示，在mRNA層級表現，和未誘導組相比，經過6天誘導ATXN3/Q₇₅表現之細胞中，PPARGC1A(83%，P=0.010)、NFE2L2(83%，P=0.005)、HMOX1(79%，P=0.016)、NQO1(74%，P=0.026)、SOD2(76%，P=0.003)、及CYCS(85%，P=0.034)表現顯著下降；而分別經過50μg/mL之脹果甘草萃取物、1μM之甘草酸銨、及10nM之甘草查耳酮A處理的細胞中，PPARGC1A(104~113%，P=0.028~10011)、NFE2L2(123~133%，P=0.031~0.000)、HMOX1(432~649%，P=0.012~0.000)、NQO1(361~383%，P=0.034~0.002)、SOD2(146~173%，P=0.011~0.001)、及CYCS(221~293%，P=0.044~0.000)表現顯著上升。

而在蛋白質層級中，請參照圖6B，利用西方墨點法分析PPARGC1A、NFE2L2、NQO1、GCLC、GSTP1、SOD2、及CYCS之相對表現量，其中以ACTB為控制組。結果顯示：在使用多西環素誘導ATXN3/Q₇₅表現6天後，PPARGC1A(63%、P=0.014)、NFE2L2(64%，P=0.011)、NQO1(75%，P=0.008)、GCLC(79%，P=0.012)、GSTP1(81%，P=0.027)、SOD2(81%，P=0.003)、及CYCS(76%，P=0.049)表現量顯著下降，而此下降情形可利用添加薑黃(50 μg/mL)、脹果甘草萃取物(50μg/mL)、甘草酸銨(1μM)、或甘草查耳酮A(10nM)來回復，具有顯著上升情形：PPARGC1A(80~101%，P=0.045~0.001)、NFE2L2(87~92%，P=0.037~0.007)、NQO1(87~98%，P=0.049~0.003)、GCLC(92~102%，P=0.042~0.014)、GSTP1(99~105%，P=0.038~0.016)、SOD2(106~117%，P=0.047~0.036)、及CYCS(114~118%，P=0.017~0.009)。據此，添加脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A可正調控PPARGC1A、NFE2L2及其下游基因/蛋白HMOX1、NQO1、SOD2、CYCS、GCLC、GSTP1、SOD2及CYCS表現，進而減少ATXN3/Q₇₅聚集。

[抑制表現PPARGC1A增加ATXN3/Q ₇₅ 聚集]

請參照圖7A，共同轉染PPARGC1A siRNA使PPARGC1A蛋白表現降至84%及NFE2L2蛋白表現降至75%。請參照圖7B，抑制表現(knock-down)PPARGC1A顯著增加ATXN3/Q₇₅聚集(37.2%vs.35.0%，P=0.047)，並減少脹果甘草萃取物之抑制聚集效果(34.9%vs.32.8%，P=0.035)。同時，脹果甘草萃取物處理能夠顯著減少控制組(32.8%vs.35.0%，P=0.048)或PPARGC1A siRNA轉染組(34.9%vs.37.2%，P=0.031)細胞中的聚集現象。

[脹果甘草萃取物及其活性成分降低活性氧化物]

如圖8A、8B所示，使用多西環素誘導6天後，活性氧化物(ROS)顯著增加(151%，P=0.002)，各組間細胞內表現的ATXN3/Q₇₅-GFP螢光量沒有顯著差異(32.1~32.9倍， P=0.738~0.918)。經過脹果甘草萃取物及其活性成分前處理，可顯著降低ATXN3/Q₇₅-GFP引起的活性氧化物含量(由151%降至132~143%，P=0.048~0.003)，證實脹果甘草萃取物及其活性成分確實可降低活性氧化物。

[脹果甘草萃取物及其活性成分之清除自由基活性]

在此實驗中，使用具有強抗氧化能力之山奈酚(Kaempferol)做為正對照組。如圖9所示，甘草酸銨未偵測到自由基清除活性，薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A之EC₅₀分別為27μM、>4mg/mL、2.1mg/mL、及121μM。藉此，甘草酸銨並非為脹果甘草萃取物中用以清除自由基的主要成分。

[脹果甘草萃取物及其活性成分誘導SH-SY5Y AXTN3/Q ₇₅ 細胞及其神經表型]

當使用視黃酸處理ATXN3/Q_14~75-GFP SH-SY5Y細胞7天促進神經分化，在顯微鏡下可發現在約1%已神經分化的ATXN3/Q₇₅-GFP細胞中形成聚集，而ATXN3/Q₁₄-GFP細胞則未有聚集現象，形成的聚集量並隨著時間增加而增加(未示於圖中)。如圖10A至10C所示，出現聚集的ATXN3/Q₇₅-GFP細胞與無聚集的ATXN3/Q₇₅-GFP細胞相比，有聚集的細胞呈現顯著減少神經突觸生長量(total outgrowth)、突觸數(processes)、及分枝數(branches)的現象(神經突觸生長量：2.44μm vs.21.90μm，P=0.000；突觸數：1.16 vs.2.12，P=0.000；及分枝數：0.04 vs.0.54，P=0.002)。而 在薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A前處理下，請參照圖10D，ATXN3/Q₇₅-GFP表現的神經細胞聚集分別降低了18%、17%、10%、及9%。結果表示：經由薑黃、脹果甘草萃取物、甘草酸銨、及甘草查耳酮A前處理，ATXN3/Q₇₅-GFP表現的神經細胞可減少聚集。

上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。

<110> 國立台灣師範大學/National Taiwan Normal University

<120> 醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺聚集類疾病之藥物上之用途/Use of Pharmaceutical Composition for Manufacturing Drug of Abnormal Polyglutamine-Mediated Disease

<130> S6725

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthesized primer

<400> 1

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Synthesized primer

<400> 2

Claims (9)

1. 一種醫藥組成物於製備不正常多麩醯胺(polyglutamine)聚集類疾病之藥物上之用途，該醫藥組成物包括：一種或多種選自由：甘草酸銨(ammonium glycyrrhizinate)和甘草查耳酮A(licochalcone A)所組成之群組；其中，該不正常多麩醯胺聚集類疾病係為小腦萎縮症(spinocerebellar ataxia)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該甘草酸銨之濃度係介於0.1μM至100μM之範圍內。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該甘草查耳酮A之濃度係介於1nM至100nM之範圍內。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥組成物更包括：至少一種醫藥學上可接受之載體、稀釋劑或賦形劑。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該甘草酸銨係經一腸道細菌作用而轉換成18 β-甘草酸(18 β-glycyrrhetinic acid)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥組成物係降低活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)之含量。
7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥組成物係增加PPARGC1A(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)、或NFE2L2(nuclear factor (ervthroid-derived 2)-like 2)蛋白表現。
8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥組成物係增加NQO1(NAD(P)H dehydrogenase(quinone 1))、GCLC(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit)、GSTP1(glutathione S-transferase P)、SOD2(superoxide dismutase 2)、及CYCS(cytochrome c,somatic)蛋白表現。
9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中，該醫藥組成物係促進粒線體新生。