JP2019514916A

JP2019514916A - クロシン系化合物及びその用途

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Publication number: JP2019514916A
Application number: JP2018556352A
Authority: JP
Inventors: ヤオシンシェン; ユヤン; チャンダン; ニヤン; バオシウチ; リリン; チャンツァイシア; ガオハオ; チェンユアンペン
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2019-06-06
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: WO2017185900A1; EP3450444B1; US20190177354A1; EP3450444A1; US11440931B2; CN105906672A; JP6740372B2; CN105906672B; AU2017255363A1; EP3450444A4; AU2017255363B2

Abstract

一系列のクロシン系化合物及びそれのアルツハイマー病の予防・治療に関連する薬理学的用途を提供する。漢方薬クチナシを原料とし、複数の分離方法を通じて一系列のクロシン系化合物を得て、インビトロ細胞実験により、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に起因する酸化損傷およびＬ−グルタミン酸に起因する興奮性アミノ酸損傷の保護作用を有する化合物をスクリーニングした結果、これらクロシン系化合物が良好なＨ２Ｏ２およびＬ−グルタミン酸に起因する細胞損傷を保護する作用が有することを示した。酸化ストレスと興奮性アミノ酸の著しい増加はアルツハイマー病の神経損傷の重要な要因であるため、これらの化合物は優れたアルツハイマー病の予防・治療効果を有し、開発と利用の見通しが広い。

Description

本発明はクロシン系化合物、及びそのアルツハイマー病の予防・治療における関連薬理学的応用に関する。

クロシン（ｃｒｏｃｉｎｓ）は構造が特別な水溶性のカロテノイドであり、クロセチン（ｃｒｏｃｅｔｉｎ）及びその異なるグリコシル基と結合してなる糖エステルを含み、サフラン（ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．）及びクチナシ（ＧａｒｄｅｎｉａｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓＥｌｌｉｓ）における共有色素成分である。伝統的な応用において、サフランはヨーロッパやアジアで婦人科良薬として広く使用され、クチナシ黄色色素は、天然着色剤として使用される。近年、サフラン粗抽出液（ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．Ｅｘｔｒａｃｔｓ：ＣＳＥ）、クチナシ黄色色素及びモノマー成分であるクロシンビスゲンチオビオシド（ｃｒｏｃｉｎ−１）、クロセチン（ｃｒｏｃｅｔｉｎ）が中枢神経系保護（非特許文献１〜４を参照）、心血管系・脳血管系保護（非特許文献５，６を参照）、及び悪性腫瘍の拮抗（非特許文献７〜９を参照）などの面で高効率、低毒性の薬理学的活性を示すことが、多くの研究により表明された。

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓＤｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）は記憶障害、認知障害、及び人格変化を特徴とする老化に伴う進行性の神経変性疾患である。ＡＤは、老人性認知症の最も一般的なタイプであり、ＡＤ患者の初期症状は記憶喪失であり、方向力、理解力、判断力及び記憶力の低下に進展し、患者の後期は全面的な衰退状態になり、知能は完全に失われ、運動や言語の障害がますます明らかになり、最終的に二次感染と不全で死亡することが多い。

世界的な老年化の激化につれて、ＡＤの発生率が年々急速に増加され、各国、特に発展途上国の社会及び人々に重い経済的、家族的な負担をもたらす。１９０６年、ドイツの医者Ａｌｚｈｅｉｍｅｒが始めてこの疾患を記述してから今までの１００年以上、国際的に、この疾患を治療する方法と医薬品がないと認められている。ここから分かるように、理想的な治療薬が存在しない場合、抗アルツハイマー薬のスクリーニング及び研究開発は、非常に広い市場の見通しと深い社会的意義を有する。

ＡＤの顕著な病理学的特徴は、大脳皮質及び海馬の細胞外のアミロイドβ蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａβ）及び細胞内の凝集するｔａｕタンパク質の絡み合いである。現在、多数の学者は、Ａβの大量沈着がＡＤ発症の直接の原因で、この過程において主に炎症及び酸化ストレスのような病理的変化が存在すると考えている。多数の研究により、酸化ストレスがＡＤ発生・進展の重要なメカニズムであることが確認されている。従って、抗酸化損傷を標的とすることがＡＤ予防・治療の有効な手段を見出す重要なルートとなっている。

グルタミン酸は、大脳皮質及び海馬部の内因性神経伝達物質である。正常な生理学的条件下で、グルタミン酸は中枢神経系のシナプス伝達を調節し、学習、記憶、運動、認知及び発育を含む正常な脳のすべての機能に関与する。しかしながら、病理学的条件下では、様々な理由によりグルタミン酸含有量が増加し、受容体が過度に活性化されるため、ニューロン損傷を引き起こし、神経毒性を生じる。異常グルタミン酸がアルツハイマー病、脳虚血及び統合失調症を含む多くの神経学的疾患の病因学及び病態生理学において、重要な役割を果たすことが多くの研究によって発見された。従って、グルタミン酸の神経毒性に拮抗することにより、神経保護の役割を果たすことができる（非特許文献１０を参照）。

ＣＳＥは、優れた体外酸化防止作用及びＡβ原繊維形成の阻害作用を有し、主色素ｃｒｏｃｉｎ−１が低い用量でＡβ原繊維の形成を阻害することができ、サフラン及びその色素がヒト脳におけるＡβ凝集・沈殿を阻害する可能性があり、ＡＤの予防・治療に係る活性を有することを示す（非特許文献２を参照）。Ｃｒｏｃｉｎ−１はグルタチオン（ＧＳＨ）含有量を増加させ、脂質過酸化物形成を阻害し、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を保持することによってＰＣ−１２細胞を保護することができる（非特許文献１１を参照）。

動物実験では、ＣＳＥ（３０ｍｇ／ｋｇ及び６０ｍｇ／ｋｇ）で実験における正常ラットの学習及び記憶能力を改善することができ、ラットのプリンによる記憶障害を効果的に阻害することができる（非特許文献１２を参照）。サフランをカプセル剤にして、軽度・中等度のＡＤの臨床第ＩＩ期治療に使用したところ、２２週間におけるランダム二重盲検試験では、サフランカプセルが陽性医薬品であるドネペジルと同じ治療効果を有し、医薬品の不良反応が陽性薬剤と明らかな差異がなく、嘔吐の副作用は弱まった（非特許文献３を参照）。中等度・重度のＡＤの臨床第ＩＩ期治療に使用したところ、実験群の患者が３０ｍｇ／日で、対照群が陽性対照薬メマンチンを３０ｍｇ／日で服用した結果、実験群が対照群と同じ治療効果を生み出し、且つ明らかな不良反応がないことを示した（非特許文献４を参照）。

ＫａｒａｋａｎｉＡ．−Ｍ．，ＲｉａｚｉＧ．，ＭａｈｍｏｏｄＧ．−Ｓ．，ｅｔａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｒｃｉｎｏｎａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆ１Ｎ／４Ｒｈｕｍａｎｔａｕｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｉｒａｎｉａｎｊｏｕｒｎａｌｏｆｂａｓｉｃｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１５，１８（５），４８５−９２．ＰａｐａｎｄｒｅｏｕＭ．−Ａ．，ＫａｎａｋｉｓＣ．−Ｄ．，ＰｏｌｉｓｓｉｏｕＭ．−Ｇ．，ｅｔａｌ．ＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＡｃｔｉｖｉｔｙｏｎＡｍｙｌｏｉｄ−β ＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＳｔｉｇｍａｓＥｘｔｒａｃｔａｎｄＩｔｓＣｒｏｃｉｎＣｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６，５４（２３），８７６２−８７６８．ＡｋｈｏｎｄｚａｄｅｈＳ．，ＳａｂｅｔＭ．−Ｓ．，ＨａｒｉｒｃｈｉａｎＭ．−Ｈ．，ｅｔａｌ．Ａ２２−ｗｅｅｋ，ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｔｒｉａｌｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｍｉｌｄ−ｔｏ−ｍｏｄｅｒａｔｅＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１０，２０７（４），６３７−６４３．ＦａｒｏｋｈｎｉａＭ．，ＳｈａｆｉｅｅＳ．−Ｍ．，ＩｒａｎｐｏｕｒＮ．，ｅｔａｌ．ＣｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ＷｉｔｈｍｅｍａｎｔｉｎｅｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｏｄｅｒａｔｅｔｏｓｅｖｅｒｅＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ：ａｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ［Ｊ］．ＨｕｍａｎＰｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１４，２９（４），３５１−３５９．ＺｈｅｎｇＹ．−Ｑ．，ＬｉｕＪ．−Ｘ．，ＷａｎｇＪ．−Ｎ．，ｅｔａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｒｏｃｉｎｏｎｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｖｅ＿ｎｉｔｒａｔｉｖｅｉｎｊｕｒｙｔｏｃｅｒｅｂｒａｌｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓａｆｔｅｒｇｌｏｂａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ．２００７，１１３８，８６−９４．ＨｉｇａｓｈｉｎｏＳ．，ＳａｓａｋｉＹ．，ＧｉｄｄｉｎｇｓＪ．−Ｃ．，ｅｔａｌ．Ｃｒｏｃｅｔｉｎ，ａＣａｒｏｔｅｎｏｉｄｆｒｏｍＧａｒｄｅｎｉａｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓＥｌｌｉｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎａｎｄＣｅｒｅｂｒａｌＴｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎＳｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅＲａｔｓ［Ｊ］．ＰｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙＲｅｓｅａｒｃｈ．２０１４，２８（９），１３１５−１３１９．ＳｈｅｎｇｙｕＤＯＮＧ，ＦｕｍｅｉＬＩＵ，ＸｉａｎｇｙｏｎｇＬＩ；ＣＮＥ２細胞の増殖と移動に対するクロシンの阻害作用［Ｊ］；湖北民族学院刊行物・医学版；２０１３、３０（２）、６〜１２．（董盛宇，劉付梅，李祥勇．藏紅花素対ＣＮＥ２細胞的増殖及移動抑制作用［Ｊ］．湖北民族学院学報・医学版．２０１３，３０（２），６−１２．）ＸｉｎｘｉｎｇＷＡＮＧ，ＺｈｅｎｇｈｏｎｇＹＵ，ＳｈｕｌｕＳＨＩなど；クロシンのヒト肺腺癌ＳＰＣ−Ａ１細胞への増殖抑制効果及びメカニズムの研究［Ｊ］；臨床腫瘍学会雑誌．２０１３，１８（４），２９５−２９９．（王新星，于正洪，侍述碌等．藏紅花素対人肺腺癌ＳＰＣ−Ａ１細胞的増殖抑制作用及机制研究［Ｊ］．臨床腫瘍学誌．２０１３，１８（４），２９５−２９９．）ＦｕｘｉｏｎｇＣＨＥＮ，ＪｉａＴＡＯ，ＳｕｉＨＵＡＮＧなど；ＥＢウイルス感染の小児におけるＩＭ及びＥＢＶ−ＡＨＳの臨床研究及びウイルス感染特性［Ａ］；中国医師会、中国医師会小児科会；第１７回全国医学会全国小児科学会編集（第１巻）［Ｃ］；中国医師会、中国医師会小児科会；２０１２：１．（陳福雄，陶佳，黄穗等．児童ＥＢ病毒感染相関ＩＭ和ＥＢＶ−ＡＨＳ的臨床研究和病毒感染特征［Ａ］．中国医学会、中国医学会小児科学分会．中国医学会第十七次全国小児科学会編纂（上册）［Ｃ］．中国医学会、中国医科小児科分会：，２０１２：１．）ＬａｕＡ．，ＴｙｍｉａｎｓｋｉＭ．．Ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１０，４６０（２），５２５−５４２．ＯｃｈｉａｉＴ．，ＯｈｎｏＳ．，ＳｏｅｄａＳ．，ｅｔａｌ．Ｃｒｏｃｉｎｐｒｅｖｅｎｔｓｔｈｅｄｅａｔｈｏｆｒａｔｐｈｅｏｃｈｒｏｍｙｃｔｏｍａ（ＰＣ−１２）ｃｅｌｌｓｂｙｉｔｓａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｆｆｅｃｔｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ［Ｊ］．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ．２００４，３６２（１），６１−６４．ＰｉｔｓｉｋａｓＮ．，ＳａｋｅｌｌａｒｉｄｉｓＮ．ＣｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓＬ．ｅｘｔｒａｃｔｓａｎｔａｇｏｎｉｚｅｍｅｍｏｒｙｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌｔａｓｋｓｉｎｔｈｅｒａｔ［Ｊ］．ＢｅｈａｖｉｏｕｒａｌＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ．２００６，１７３（１），１１２−１１５．

本発明は以下の発明に関する。
［１］一般式（Ｉ）で示されるクロシン系化合物またはその薬学的に許容される塩。

ここで、１３〜１４位の二重結合の立体配置はトランスＥまたはシスＺであり、
Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、グリコシル基およびキナ酸基を表し、
キナ酸の基本構造は、

であり、
これらの中で、１，３，４，５，７位のヒドロキシル基は、水素が除去された後に異なるキナ酸基を形成することができ、例えば、よくある３位、５位が以下のように表される。

前記グリコシル基は、グルコース基、ゲンチオビオース基、キシロシル、ガラクトシル、マンノシル、アラビノース、ラムノシル、リボシル、リソソシルおよびキシラニルであり、
前記グリコシル基の数が０〜２であり、
前記グリコシル基のヒドロキシ基は、サクシノイル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
前記キナ酸基の３，４，５位のヒドロキシル基は、スクシニル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
キナ酸基の１位のカルボキシル基は、メチルエステル化またはエチルエステル化されてよく、
その中、前記一般式（Ｉ）の化合物は以下の化合物を含まない。

［２］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がキナ酸基である。

［３］前記項［２］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

［４］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がシスＺ立体配置であり、Ｒ_１がＨ、グルコース基又はキナ酸基であり、Ｒ_２がＨ、グルコース基またはキナ酸基である。

［５］前記項［４］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

［６］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がグルコース基又はＨである。

［７］前記項［６］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

［８］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２はＣＨ_２ＣＨ_３である。

［９］前記項［８］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

［１０］前記項［１］に記載の化合物であって、１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、キシロシルであり、Ｒ_２がＨである。

［１１］前記項［１０］に記載の化合物であって、前記化合物が以下の化合物である。

［１２］以下の構造式で示されるクロシン系化合物である。

［１３］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物の、神経変性疾患を予防および治療するための医薬品の製造への使用である。

［１４］前記神経変性疾患は、血管性認知症、血管性認知障害、アルツハイマー病、記憶喪失、脳組織変性疾患症候群、またはコリン作動性神経変性疾患を含む、［１３］項に記載の使用である。

［１５］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物と、他のクロシン系化合物を含む組成物であって、前記他のクロシン系化合物が以下の化合物である組成物である。

［１６］前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬品組成物である。

［１７］漢方薬クチナシを原材料とし、エタノール、メタノールまたは水を用いて、異なる抽出回数と時間で熱抽出または超音波抽出する方法により抽出し、抽出液を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得ることを含む、前記項［１］〜前記項［１２］のいずれか１項に記載の化合物の製造方法である。

［１８］クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーにより、水および／または３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を収集し、クチナシクロシンの活性成分を減圧濃縮し、さらに種々のカラムクロマトグラフィーで分離する、前記項［１７］に記載の製造方法である。

［１９］４倍量の６０％エタノールで、１回あたり２時間で３回加熱還流する、前記項［１７］に記載の製造方法である。

［２０］水で溶出した後、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶液を減圧濃縮してクチナシクロシンの活性成分を得る、前記項［１８］に記載の製造方法である。

［２１］前記カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィー、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０オープンカラムクロマトグラフィー、およびＰｒｅ−ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを含む、前記項［１８］に記載の製造方法である。

本願の発明者らは、複数の化学手段を通じて漢方薬のクチナシから、一般式（Ｉ）による新型のクロシン系化合物を抽出し、様々な分光法によって同定し、これらのクロシン系化合物が中枢神経系に優れた保護効果を有することを細胞実験により証明した。

各置換基の定義は、上述のとおりである。
第一組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がキナ酸基である。
ここで、Ｒ_１がＧｌｃ−（１→６）−Ｇｌｃ（ゲンチオビオース基）であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＢ（ＧＪ−１と略称する）が得られる。

ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−５−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＣ（ＧＪ−２と略称する）が得られる。

第二組の好ましい化合物において、１３〜１４位がシスＺ立体配置であり、Ｒ_１がＨ、グルコース基またはキナ酸基であり、Ｒ_２がグルコース基またはキナ酸基である。
ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＤ（ＧＪ−３と略称する）が得られる。

ここで、Ｒ_１が３−カフェオイルキナ酸−４−オキシであり、Ｒ_２がゲンチオビオース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＥ（ＧＪ−４と略称する）が得られる。

ここで、Ｒ_１がＨ、Ｒ_２はゲンチオビオース基である場合、化学名が１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドである新しい化合物（ＧＪ−５と略称する）が得られる。

第三組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がグルコース基又はＨである。
ここで、Ｒ_１が６−Ｏ−トランス−シナポイルゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がゲンチオビオース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＧ（ＧＪ−６と略称する）が得られる。

ここで、Ｒ_１が６−Ｏ−トランス−シナポイルゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がＨである場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＦ（ＧＪ−７と略称する）が得られる。

第四組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２はＣＨ_２ＣＨ_３である。
ここで、Ｒ_１がゲンチオビオース基であり、Ｒ_２がＣＨ_２ＣＨ_３である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＨ（ＧＪ−８と略称する）が得られる。

第五組の好ましい化合物がｎｅｏｃｒｏｃｉｎＩ（ＧＪ−９と略称する）である。

第六組の好ましい化合物において、１３〜１４位がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基、キシロシルであり、Ｒ_２がＨである。
ここで、Ｒ_１がＨ、Ｒ_２がキシロシル−（１→６）−グルコース基である場合、新しい化合物ｎｅｏｃｒｏｃｉｎＪ（ＧＪ−１０と略称する）が得られる。

また、一般式（Ｉ）の範囲での以下の表１に示す化合物は既知なものである。

実施例１：クチナシからのクロシン成分の抽出分離
クチナシの乾燥・成熟した果実４０．０ｋｇを採取し、適切な粉砕の後、４倍量の６０％エタノールで加熱還流して３回抽出した。毎回２時間かけて行った。抽出液を合わせて減圧下で溶媒を除去して、クチナシ全部抽出物として６．２ｋｇ（収率１５．５％）を得た。抽出物を適量の水に溶解して遠心分離し、上清をマクロポーラス樹脂オープンカラムのクロマトグラフィー（２０．０×９０ｃｍ）を行った。４倍のベッド容量の水、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで勾配溶出し、各溶出液を回収し、それぞれ減圧下で溶媒を回収して、約４．５ｋｇの水の溶出と３０％エタノールの溶出を組合わせたものを得、７１０．０ｇの５０％エタノールで溶出されたものを得、１５０．０ｇの７０％エタノールで溶出されたものを得、１１２．０ｇの９５％エタノールで溶出されたものを得た。７０％エタノールで溶出されたものがクチナシクロシン活性成分であった。
７０％エタノール溶出成分１５０ｇがシリカゲルカラムクロマトグラフィー（φ７×６０ｃｍ）、クロロホルム−メタノール−水９９：１〜６：４：０．８による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１１（４９．１ｍｇ）、ＧＪ−１２（１３６．５ｍｇ）、ＧＪ−１３（７．０ｇ）をそれぞれ析出させた。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．９をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水３０％−７０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１９（５４５．１ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、６０％メタノール−水による溶出により化合物ＧＪ−２０（２６５．７ｍｇ）を得、ＨＰＬＣ、６８％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１（１２０．０ｍｇ）、およびＧＪ−３とＧＪ−４との混合物１０４．８ｍｇ（１：２で混合）を得た。さらに、水（０．３％ＴＥＡＡ）：アセトニトリル＝５５：４５により化合物ＧＪ−３とＧＪ−４を分離した。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．７をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水４０％−８０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１１（１６．０ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、５５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−２（６．３ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、４２％アセトニトリル−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−１３（８．０ｍｇ）、化合物ＧＪ−５（１６．０ｍｇ）を得た。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．８をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水５５％−６５％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１６（１４３．７ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、５５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−６（５９．１ｍｇ）、ＧＪ−２（２１．９ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、６８％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１（４００．９ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、３２％アセトニトリル−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−１７（１．８ｍｇ）、ＧＪ−１８（３．５ｍｇ）を得た。
シリカゲルサブフラクションＦｒ．６をＯＤＳカラムクロマトグラフィー、メタノール−水５０％−９０％による勾配溶出により、化合物ＧＪ−１５（３１５．７ｍｇ）を析出させ、ＨＰＬＣ、６０％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、化合物ＧＪ−１０（１０．０ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、６５％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−９（２．０ｍｇ）、ＧＪ−７（６６．２ｍｇ）を得た。ＨＰＬＣ、７０％メタノール−酸性水（０．１％酢酸）による溶出により、ＧＪ−８（１０．０ｍｇ）を得た。

得られた化合物の構造は表２−１および表２−２に示すとおりである。

得られた化合物の物性データは以下の通りである。
化合物ＧＪ−１：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ１０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ９８９．３６４２［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４８Ｈ_６１Ｏ_２２，９８９．３６５４），化合物ＧＪ−１の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３３（５．３２），４５８（５．２８），３３１（４．６８），２５３（４．５２）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６８，１０６１，１２２４，１２６８，１５７６，１６１０，１６９４，２９２０，３４０１ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−２：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ１０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ９８９．３６４６［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４８Ｈ_６１Ｏ_２２，９８９．３６５４），化合物ＧＪ−２の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３１（４．６３），４５７（４．５６），３３１（４．１２），２４９（３．８５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０６４，１２３０，１２７９，１６０２，１６９８，２９２１，３４１７ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−３：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ１０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１０１１．３４７１［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２Ｎａ，１０１１．３４７４），化合物ＧＪ−３の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２９（５．０４），４５３（４．９９），３２４（４．６８），２５１（４．０４）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６９，１０６２，１２２９，１２７７，１６０７，１６９３，２９２０，３３６８ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−４：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ１０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１０１１．３４７１［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２Ｎａ，１０１１．３４７４），化合物ＧＪ−４の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２９（５．０４），４５３（４．９９），３２４（４．６８），２５１（４．０４）ｎｍ；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９６９，１０６２，１２２９，１２７７，１６０７，１６９３，２９２０，３３６８ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−５：赤色アモルファス粉末，ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ６７５［Ｍ＋Ｎａ］^＋，ｍ／ｚ１３２７［２Ｍ＋Ｎａ］^＋，化合物ＧＪ−１４の分子量が６５２であると推定する。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：６７５．２６１７［Ｍ＋Ｎａ^＋］（算出値：６７５．２６２９），化合物ＧＪ−１４の分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１４であることを確認した。^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−６：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ１２０５［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１１８３．４４７９［Ｍ＋Ｈ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_５５Ｈ_７５Ｏ_２８，１１８３．４４４５），化合物ＧＪ−６の分子式がＣ_５５Ｈ_７４Ｏ_２８であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３４（５．２２），４５９（５．１７），３３０（４．７８），２４２（４．６５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０５９，１１１９，１２２５，１２７３，１６１０，１７０１，２９２０，３３８５ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−７：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ８８１［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ８８１．３１８８［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_４３Ｈ_５４Ｏ_１８Ｎａ，８８１．３２０８），化合物ＧＪ−７の分子式がＣ_４３Ｈ_５４Ｏ_１８であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３０（５．３３），４５４（５．２８），３２６（４．８０），２４２（４．７８）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ９７２，１０６９，１１７９，１２２７，１２８４，１６１０，１６９７，２９２２，３３９１ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−８：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ７０３［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ７０３．２９０４［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３４Ｈ_４８Ｏ_１４Ｎａ，７０３．２９４２），化合物ＧＪ−８の分子式がＣ_３４Ｈ_４８Ｏ_１４であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３０（４．６４），４５６（４．５９），３２２（３．８４），２５７（３．９５）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７４，１２２９，１６９７，２９２５，３４００ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−９：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ６５９［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６５９．２６５７［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１３Ｎａ，６５９．２６８０），化合物ＧＪ−９の分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１３であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４３８（４．６３），４６２（４．６０），３２８（３．９０），２６１（３．９４）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７１，１５１５，１６９４，２９２１，３２７７ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

化合物ＧＪ−１０：赤色アモルファス粉末；ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）：ｍ／ｚ６４５［Ｍ＋Ｎａ］^＋；ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６４５．２５１９［Ｍ＋Ｎａ］^＋（ｃａｌｃｄｆｏｒＣ_３１Ｈ_４２Ｏ_１３Ｎａ，６４５．２５２３），化合物ＧＪ−１０の分子式がＣ_３１Ｈ_４２Ｏ_１３であることを確認した。ＵＶ（ＭｅＯＨ）λ_ｍａｘ（ｌｏｇε）：４２８（４．５６），４５３（４．５０），３２０（４．１１），２５７（４．１０）；ＩＲ（ＫＢｒ）ν_ｍａｘ１０７２，１２３０，１７００，２９２４，３４１６ｃｍ^−１；^１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，１５０ＭＨｚ）は表３に示した。

実施例２：クチナシにおけるクロシン単体のＨ_２Ｏ_２及びＬ−グルタミン酸誘発ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞傷害モデルにおける神経保護効果

２．１ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞培養法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞をＤＭＥＭ培地（５体積％ウシ胎児血清を含む）で培養し、５％ＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で培養し、３〜４日ごとに継代した。実験は、対数増殖期細胞を取って行った。

２．２過酸化水素損傷モデルスクリーニング法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３の濃度で接種し、２４時間続いて培養し、Ｈ_２Ｏ_２を含む医薬品液体培地１００μＬを９６ウェルプレートに加えて、Ｈ_２Ｏ_２の最終濃度を４００μＭにし、医薬品の最終濃度を１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭにして各濃度について平行の３つのウェルを設定し、培養を２４時間続けた。２４時間後、上清を吸引し、１００μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを４時間続け、上清を吸引した。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０分間振とうし、５７０ｎｍの波長を選択して、マイクロプレートリーダーで吸光度値^［１２］を測定する。（有効率％＝（ＯＤ_医薬品−ＯＤ_モデル）／（ＯＤ_{コントラスト}−ＯＤ_モデル）＊１００）、スクリーニング結果を表４に示す。

２．３Ｌ−グルタミン酸損傷モデルスクリーニング法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３の濃度で接種し、２４時間続いて培養し、Ｌ−グルタミン酸を含む医薬品液体培地１００μＬを９６ウェルプレートに加えて、Ｌ−グルタミン酸の最終濃度を１６０ｍＭにし、医薬品の最終濃度を１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭにして各濃度について平行の３つのウェルを設定し、培養を２４時間続けた。２４時間後、上清を吸引し、１００μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを４時間続け、上清を吸引した。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０分間振とうし、５７０ｎｍの波長を選択して、マイクロプレートリーダーで吸光度値［非特許文献１３を参照］を測定する。（有効率％＝（ＯＤ_医薬品−ＯＤ_モデル）／（ＯＤ_{コントラスト}−ＯＤ_モデル）＊１００）、スクリーニング結果を表５に示した。

実験結果によれば、化合物ＧＪ−１〜ＧＪ−１０のいずれがＨ_２Ｏ_２誘発ＳＹ５Ｙ細胞損傷モデルにおいて良好な保護を示し、化合物ＧＪ−６、ＧＪ−１０、ＧＪ−８がさらに優れた保護作用を示した。化合物ＧＪ−１〜ＧＪ−１０のいずれがＬ−グルタミン酸誘発ＳＹ５Ｙ細胞損傷モデルにおいても良好な保護を示し、化合物ＧＪ−１、ＧＪ−６、ＧＪ−７、ＧＪ−１０、ＧＪ−９、ＧＪ−８がさらに優れた保護作用を示した。上記の実験結果から、異なる損傷モデルにおける各化合物の有効性は異なり、これはＨ_２Ｏ_２誘発損傷のメカニズムが酸化ストレスであるが、Ｌ−グルタミン酸誘発損傷のメカニズムが興奮性アミノ酸によって興奮毒性損傷が引き起こされ、化合物が異なるメカニズムによって損傷保護を発揮することが知られる。

Claims

一般式（Ｉ）で示されるクロシン系化合物またはその薬学的に許容される塩。

ここで、１３〜１４位の二重結合の立体配置はトランスＥまたはシスＺであり、
Ｒ_１、Ｒ_２はそれぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、グリコシル基およびキナ酸基を表し、
前記グリコシル基は、グルコース基、ゲンチオビオース基、キシロシル、ガラクトシル、マンノシル、アラビノース、ラムノシル、リボシル、リソソシルおよびキシラニルであり、
前記グリコシル基の数が０〜２であり、
前記グリコシル基のヒドロキシ基は、サクシノイル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
前記キナ酸基の３，４，５位のヒドロキシル基は、スクシニル基、カフェオイル基、クマロイル基、シンナモイル基、ＣＨ_３（ＣＨ_２）ｎＣＯ、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）ｎＣＯのようなアシル化基によってアシル化されてよく、
キナ酸基の１位のカルボキシル基は、メチルエステル化またはエチルエステル化されてよく、
前記一般式（Ｉ）の化合物は以下の化合物を含まない。
１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がキナ酸基である請求項１に記載の化合物。
前記化合物が以下の化合物である請求項２に記載の化合物。
１３〜１４位の二重結合の立体配置がシスＺ立体配置であり、Ｒ_１がＨ、グルコース基又はキナ酸基であり、Ｒ_２がＨ、グルコース基またはキナ酸基である請求項１に記載の化合物。
前記化合物が以下の化合物である請求項４に記載の化合物。
１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であり、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がグルコース基又はＨである請求項１に記載の化合物。
前記化合物が以下の化合物である請求項６に記載の化合物。
１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、Ｒ_２がＣＨ_２ＣＨ_３である請求項１に記載の化合物。
前記化合物が以下の化合物である請求項８に記載の化合物。
１３〜１４位の二重結合の立体配置がトランスＥ立体配置であって、Ｒ_１がグルコース基であり、キシロシルであり、Ｒ_２がＨである請求項１に記載の化合物。
前記化合物が以下の化合物である請求項１０に記載の化合物。
以下の構造式で示されるクロシン系化合物。
請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の化合物の、神経変性疾患の予防および治療のための医薬品の製造への使用。
前記神経変性疾患は、血管性認知症、血管性認知障害、アルツハイマー病、記憶喪失、脳組織変性疾患症候群、またはコリン作動性神経変性疾患を含む、請求項１３に記載の使用。
請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の化合物と、他のクロシン系化合物を含む組成物であって、前記他のクロシン系化合物が以下の化合物である組成物。
請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬品組成物。
漢方薬クチナシを原材料とし、エタノール、メタノールまたは水を用いて、異なる抽出回数と時間で熱抽出または超音波抽出する方法により抽出し、抽出液を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得ることを含む、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーにより、水および／または３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を収集し、クチナシクロシンの活性成分を減圧濃縮し、さらに種々のカラムクロマトグラフィーで分離する、請求項１７に記載の製造方法。
４倍量の６０％エタノールで、１回あたり２時間で３回加熱還流する、請求項１７に記載の製造方法。
水で溶出した後、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶液を減圧濃縮してクチナシクロシンの活性成分を得る、請求項１８に記載の製造方法。
前記カラムクロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィー、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０オープンカラムクロマトグラフィー、およびＰｒｅ−ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを含む、請求項１８に記載の製造方法。