TWI703980B - 梔子萃取物、其製備方法及其用於護眼之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種梔子萃取物、其製備方法及其用於護眼之用途。該製備方法包含以下步驟：將梔子乾果進行粉碎製程之後，以40wt%~95wt%乙醇進行萃取，得到第一萃取物；將第一萃取物利用大孔吸附樹脂A進行吸附，再經40wt%~95wt%乙醇進行沖提，得到第二萃取物；以及將第二萃取物以大孔吸附樹脂B進行吸附，再經60wt%~95wt%乙醇進行沖提，以得到梔子萃取物。當將該方法所製得的梔子萃取物施予給所需個體時，可改善該個體的視覺功能。

Description

梔子萃取物、其製備方法及其用於護眼之用途

本發明係關於一種梔子萃取物，更具體而言，關於一種梔子萃取物用於護眼之用途。

目前市面上的梔子通常用於中藥，其性寒味苦，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血散瘀之功效，主要用於熱病心煩、黃疸尿赤、火毒瘡瘍等症狀。根據近年來的藥理研究也證實梔子具有抗氧化、抗發炎、降血糖之作用。梔子主要成分包括多種環烯醚類成分、色素等。然而，現今尚未有研究可證實梔子果實可用於改善視力的退化。

隨著年紀的增長、環境的變化或使用程度，都可能造成眼睛的組織逐漸退化。尤其，現今許多人需要長時間使用電子產品，因而容易產生視功能衰退、乾眼症等問題，甚至可能增加罹患視網膜黃斑部病變的風險。因此，現今亟需一種可有效改善視功能之保健營養產品。

有鑑於上述技術問題，本發明之目的在於提供一種具有護眼功能之梔子萃取物，以達到改善視力功能的功效。

根據本發明的一態樣，提供一種梔子萃取物的製造方法，其包含以下步驟：(A)將梔子乾果進行粉碎製程之後，以40wt%~95wt%乙醇進行萃取，得到第一萃取物；(B)將第一萃取物利用大孔吸附樹脂A進行吸附，再經40wt%~95wt%乙醇進行沖提，得到第二萃取物；以及(C)將第二萃取物以大孔吸附樹脂B進行吸附，再經60wt%~95wt%乙醇進行沖提，得到梔子萃取物。

較佳地，在該(C)步驟中，當使用800ml~1000ml乙醇進行沖提，且每管收集15ml~20ml時，所收集的第9管至第45管可作為梔子萃取物。

較佳地，沖提該大孔吸附樹脂B的流速為1~10mL/min。

根據本發明的另一態樣，提供一種梔子萃取物，該梔子萃取物係由上述之製造方法所製得。

較佳地，該梔子萃取物可含有具極性到非極性的藏紅花素(Crocins)。

根據本發明的又一態樣，提供一種上述之製造方法製得的梔子萃取物用於製備護眼的醫藥藥劑及器材、保健品、健康食品、食品之用途，其中將一有效劑量之梔子萃取物施予至所需個體。

較佳地，該有效劑量可為每公斤體重使用約1mg~約40mg。

較佳地，該梔子萃取物可回復所需個體的視覺功能閥值。

根據本發明的梔子萃取物，可具有下列優點：

(1)根據本發明所揭露之方法所製得的梔子萃取物可含有較高的有效成分藏紅花素及其衍生物或水解物。

(2)根據本發明所揭露之方法所製得的梔子萃取物可以人體使用的安全劑量內施予個體後，達到減緩強光所造成的視功能傷害，以維持於較佳視覺功能之功效。

S101~S103:步驟

第1圖係根據本發明的實施例之梔子萃取物的製造方法之流程圖。

第2圖係為評估小鼠視覺功能之實驗流程圖。

第3圖係為視網膜組織地形圖。

第4圖係利用吸附樹脂沖提梔子萃取物所收集的各管於440nm的吸光值之圖表。

第5圖係為藏紅花素標準品之HPLC圖。

第6圖係根據本發明的實施例之製造方法萃取的梔子萃取物之第一分餾部分之HPLC圖。

第7圖係根據本發明的實施例之製造方法萃取的梔子萃取物之第二分餾部分之HPLC圖。

第8圖的(a)係為各組小鼠於第0天至第30天之視覺功能閾值分析圖，(b)係為各組小鼠於第30天之視覺功能閾值之柱狀圖。

本發明將藉由下列較佳實施例及其配合之圖式，作進一步之詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示之實驗數據，係為便於解釋本案技術特徵，並非用以限制其可實施之態樣。

定義

用語「大約」或「大概」，當結合可測量的數值變數使用時，係指變數的指示值以及在指示值的實驗誤差內(例如，平均值的95%信賴區間(confidence interval))或在指示值之10%內的變數的所有值，從中取最大值。

如本文所用，「有效劑量」包括足以改善視功能之梔子萃取物的劑量。

「個體」指需要或被認為潛在需要本發明的萃取物的任何哺乳動物，其包含靈長類、齧齒類、寵物、實驗室試驗動物、眷養野生動物。舉例來說，此可包含，但不限於：猴子、人類、豬隻、牛、綿羊、山羊、馬科動物、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子、貓(felines)、犬(canines)。較佳地，受試者為小鼠或人類。

根據本文提供之一些具體實例之方法施予的萃取物可容易使用醫藥學上可接受之載劑調配、製備或與其一起施予。該萃取物之活性組分(如藏紅花素1(Crocin 1)、藏紅花素2(Crocin 2)、藏紅花素3(Crocin 3)或藏紅花素4(Crocin 4))與醫藥學上可接受之載劑締合。在一個具體實例中，藉由使活性組分與液體載劑、固體載劑或兩者均勻及密切締合來製備組成物。液體載劑包括(但不限於)水性調配物、非水性調配物或兩者。固體載劑包括(但不限於)生物載劑、化學載劑或兩者。

梔子的萃取流程

在本發明中使用的梔子萃取物係使用梔子之乾燥成熟果實作為原料，梔子係為茜草科(Rubiaceae)植物，其學名為Gardenia jasminoides Ellis，根據研究具有抗氧化能力、抗發炎作用、降血糖效果等藥理作用。

參照第1圖，根據本發明之實施例，提供一種梔子萃取物的製造方法，其包含以下步驟：(S101)將乾燥梔子的果實以粉碎機進行粉碎後，使用40wt%~95wt%乙醇的萃取溶劑，並以1：4料液比萃取2次，以得到第一萃取物，其中乙醇最佳為60wt%；(S103)將第一萃取物大孔吸附樹脂A進行吸附，使用60wt%~95wt%乙醇，以1mL/min-10mL/min的流速進行沖提，以得到第二萃取物，其中乙醇較佳為75wt%~85wt%，最佳為80wt%，並且 大孔吸附樹脂A的極性可為非極性到極性，比表面積可為20-60m²/g，孔徑可為50-300A，大孔吸附樹脂A較佳為HP20型大孔吸附樹脂；以及(S105)將第二萃取物以大孔吸附樹脂B進行吸附，使用60wt%~95wt%乙醇，以1mL/min~10mL/min的流速進行沖提，以得到梔子萃取物，其中乙醇較佳為75wt%~85wt%，最佳為80wt%，並且大孔吸附樹脂B的極性可為非極性到極性，比表面積可為20-60m²/g，孔徑可為50-300A，大孔吸附樹脂B較佳為LH20型大孔吸附樹脂。當沖提大孔吸附樹脂B的流速為1~10mL/min，使用800ml~1000ml乙醇量進行沖提，且每管收集15ml~20ml時，在200nm-800nm吸光值測定下，所收集的第9管至第45管可作為梔子萃取物。在另一實施例中，當沖提大孔吸附樹脂B的流速為1~3mL/min，使用880ml乙醇量進行沖提，且每管收集20ml時，在440nm吸光值測定下，所收集的第9管至第30管可作為梔子萃取物。

根據上述所方法所製得的梔子萃取物可為具極性的藏紅花素，該藏紅花素包含選自由藏紅花素1、藏紅花素2、藏紅花素3及藏紅花素4所組成之群組中的至少其一，較佳地，該梔子萃取物係為藏紅花素1。

根據本發明的一實施例，本發明的梔子萃取物以有效劑量施予至少30天之後，可以有效抑制或減少視覺功能的損傷或是改善視力閥值(cpd)。所施予的梔子萃取物之劑量將根據視功能狀況之損傷程度、特定調配物及其他臨床因素(如個體之體重及一般狀態)而定。其中，該有效劑量為每公斤體重使用1mg~40mg。

實例

梔子水溶性萃取物萃取方式

梔子水溶性粗萃率及藏紅花素含量測定

將100g乾燥梔子果實經粉碎機粉碎後，利用濃度40wt%、60wt%或80wt%乙醇，以料液比1：4的比例進行萃取2次，每次於室溫下攪拌1.5小時， 裡用濾紙過濾以獲得濾液，再經真空濃縮接著冷凍乾燥以得到梔子水溶性粗萃物，並計算梔子水溶性粗萃率及藏紅花素含量。其中，梔子水溶性粗萃率以下列公式(1)計算：[公式(1)]梔子水溶性粗萃率(%)=梔子粗萃物重/梔子乾果重×100

基於上述公式(1)得知具有最佳粗萃率的組別，將該組別利用大孔吸附樹脂A進行純化，在本實例中使用HP20型大孔吸附樹脂。首先，將秤取約2g之梔子水溶性粗萃物以0.01M檸檬酸鹽調整pH至4.0，進行大孔吸附樹脂A吸附，先以蒸餾水流洗滌管柱2倍體積洗滌，再以60%、80%或95%乙醇進行沖提收集，將吸收波長為440nm的分離管進行收集混合後，進行真空濃縮並冷凍乾燥萃取物，並以下列公式(2)計算各組大孔吸附樹脂A的萃取率：[公式(2)]大孔吸附樹脂A萃取率(%)=大孔吸附樹脂A萃取物重/梔子粗萃物重×100

基於上述公式(2)得知具有最佳大孔吸附樹脂A萃取率的組別，再以最佳萃取率之組別進行大孔吸附樹脂B進行純化，在本實例中使用LH20型大孔吸附樹脂。秤取約1g之大孔吸附樹脂A萃取物利用大孔吸附樹脂B吸附，先以蒸餾水洗滌管柱2倍體積洗滌，再以60%、80%或95%酒精沖提收集，將有測得440nm分離管進行收集混合後，進行真空濃縮並冷凍乾燥萃取物，接著利用HPLC鑑定梔子萃取物中的藏紅花素，並儲存以待作為動物試驗測試使用。

其中，HPLC之層析測定條件如下：固定相：Phenomenex Luna 3u C18(2)Å

流速：0.2mL/min

波長：440nm

移動相如下表1：

視覺機能評估

實驗小鼠為ICR品系白鼠，性別為雌性。購自樂斯科生物科技股份有限公司(台北，台灣)。小鼠入室週齡為5~6週，於中山醫學大學動物實驗中心飼育室標準環境適應2~3週，期間自由飲食並置於標準照明與飼育環境，遵照中山醫學大學動物飼育規則。之後將實驗分成6組，每組5隻，包含空白對照組、溶劑組(強光損傷並餵食溶劑)、葉黃素組(強光損傷+葉黃素5mg/kg)、Crocin-1組(強光損傷+Crocin-1 5mg/kg)(fraction crude extract-1)、Crocin-5組(強光損傷+Crocin-5 5mg/kg)(fraction crude extract-5)、以及水勢力產品組(強光損傷+鴻元公司之水勢力產品)。實驗配藥方式以每次5mg/kg體重之劑量溶於100ul的溶劑中進行餵食，投藥方式採經口餵食，並且實驗參照第2圖的流程進行。

強光損傷模式

使用市售11W LED燈泡，配合燈罩與燈座架設於專用飼育籠上方，專用飼育籠能減少光線散射並均化光損傷環境之照度。燈泡於每次實驗前皆以光譜儀量測其相對光譜，以避免燈泡隨著使用時間產生衰退或是光譜峰值轉移等現象，減少實驗誤差。損傷模式之照度標準設置以照度計量測飼育籠四角落及中心點，各量測點之光譜介於600~1000Lux之間，中心點照度為最高值。實驗 過程中每10日再確認照度並微調燈泡照射角度，減少因餵食藥物或是更換墊飼料時人為移動導致的誤差。

視覺機能評估模式

於基準線、第10天、第20天及第30天進行小鼠視覺功能閾值評估。使用中山醫學大學視光學系陳伯易老師實驗室小鼠視覺機能評估系統進行測試與分析。視覺功能評估基於動物視動反射。當使用不同空間頻率光柵刺激時，該視力閾值由小鼠身頭部運動確定。在視功能評估測試，將小鼠放於高台上注視螢幕光柵。顯示器和動物眼睛之間的距離15厘米覆蓋110度90度的視野。顯示器屏幕顯示相等的寬度和間隔垂直光柵，以激發小鼠的運動反射。一旦垂直光柵開始顯示，記錄了鼠標頭部和身體的反射運動，進一步分析。操作員可以調整軟件設置改變光柵空間頻率。

組織切片與染色分析

參考第3圖，於實驗末端採集小鼠眼球組織後，統一以右眼進行後續石蠟切片，經由脫水、包埋、製備蠟塊、切片、封片、拍照與定量等過程以分析視網膜組織分層厚度。眼球以矢狀方向進行切片，選用通過眼球中央視神經範圍之切片做為定量範圍。視網膜外核層與外內節層定量方式為以視神經為中心分為上下兩側1.6mm範圍內，每0.2mm採樣一次厚度，上下側共採計16處厚度數據做為視網膜厚度地形圖分析。平均厚度方面排除靠近邊緣之數據浮動，以上下側各1.0mm範圍內共10個數據點平均分析。

實驗結果

梔子粗萃物含量

將梔子乾果粉碎經由40wt%、60wt%或80wt%乙醇萃取後，其結果如表2所示，梔子水溶性粗萃率分別為15.77wt%、25.24wt%及18.57wt%，其中以60wt%乙醇萃取之梔子水溶性粗萃率為最高。

梔子水溶性粗萃率之黃梔子色素含量

結果如表3所示，結果發現40%、60%及80%乙醇萃取組別之黃梔子色素含量分別為17.62%、17.24%及18.36%，其中以80%乙醇萃取組別最高，但總黃梔子色素含量是以60%乙醇萃取組別最高，故接著以60%乙醇萃取組別一步再進行大孔吸附樹脂A分析。

大孔吸附樹脂A萃取之結果

結果如表4所示，經大孔吸附樹脂A吸附，分別以60%、80%或95%乙醇沖提後，大孔吸附樹脂A萃取率分別為12.65%、13.16%及13.31%，均無顯著性差異。

大孔吸附樹脂A萃取物之黃梔子色素含量

結果如表5所示，結果發現60%、80%及95%乙醇沖提組別之黃梔子色素含量分別為37.38%、44.76%及40.74%，其中以80%乙醇沖提組別最高，此外，於60%、80%及95%乙醇沖提組別的總黃梔子色素含量分別為0.05g、0.06g及0.07g，亦以80%乙醇沖提組別最高，故80%乙醇沖提組別一步再進行大孔吸附樹脂B分析。

大孔吸附樹脂B萃取之結果

如下表6所示，80%乙醇組別的大孔吸附樹脂A萃取物利用大孔吸附樹脂B吸附，再以60%、80%或95%乙醇連續性沖提，經濃縮及冷凍乾燥後，60%、80%及95%乙醇組別的萃取率分別為10.81%、68.39%及18.51%，其中以80%乙醇組別的萃取量最高。

大孔吸附樹脂B萃取物之之黃梔子色素含量

如下表7所示，研究結果發現60%、80%及95%乙醇組別之黃梔子色素含量分別為43.93%、49.72%及47.41%，其中以80%乙醇組別最高，此外，於60%、80%及95%乙醇組別的總黃梔子色素含量分別為0.04g、0.34g及0.08g，亦以80%乙醇沖提組別最高。

大孔吸附樹脂B層析圖(乙醇濃度60%-95%)

參照第3圖，將約1g之大孔吸附樹脂A萃取物(80%乙醇沖提物)利用大孔吸附樹脂B吸附，再以每管收集20mL，總體積880mL洗滌乙醇濃度60%-95%乙醇進行沖提，以得到3個分餾部分的大孔吸附樹脂B萃取物，其中於第3管至第8管為第一分餾部分(Fr.1)、第9管至30管為第二分餾部分(Fr.2)及第37管至40管為第三分餾部分(Fr.3)。

藏紅花素標準品之高壓液相層析圖

參照第5圖，將藏紅花素標準品以HPLC進行分析，結果顯示第3圖的波峯1為藏紅花素1，其滯留時間為15.66分鐘，波峯2為藏紅花素2，其滯留時間為16.32分鐘，波峯3為藏紅花素3，其滯留時間為17.22分鐘，波峯4為藏紅花素4，其滯留時間為17.85分鐘，波峯5為藏紅花素5，其滯留時間為18.62分鐘。

第一分餾部分之HPLC分析

參照第5圖及第6圖，第一分餾部分(Fr.1)之波峯1的滯留時間18.64分鐘可對應藏紅花素標準的藏紅花5(34.66%)。

第二分餾部分之HPLC分析

參照第5圖及第7圖，第二分餾部分之波峯1(藏紅花素-1/fraction crude extract-1)的滯留時間15.65分鐘可對應於藏紅花素標準品的藏紅花素1(fraction crude extract-1)(55.24%)、波峯2的滯留時間16.5分鐘可對應於藏紅花素標準品的藏紅花素2(fraction crude extract-2)(8.33%)、波峯3的滯留時間17.18分鐘可對應於藏紅花素標準品的藏紅花素3(fraction crude extract-3)(2.35%)、以及波峯4的滯留時間17.93分鐘可對應於藏紅花素標準品的藏紅花素4(fraction crude extract-4)(18.73%)。

藏紅花素建議用量與換算

根據衛服部台灣中藥典第二版換算，以番紅花來源之藏紅花素作為換算參照，藏紅花素人體每日建議用量為1~3mg/kg/日，小鼠相對於人體每日建議用量換算為12.3~36.9mg/kg/日。

衛福部台灣中藥典第二版建議用量：3~9g/60kg，藏紅花素含量：2%，藏紅花素來源：番紅花。藏紅花素人體建議用量：50~150mg/kg/日*0.02(2%)=1~3mg/kg/日，藏紅花素小鼠相對於人體每日建議用量：1~3mg/kg/日*12.3(倍)=12.3~36.9mg/kg/日。

本發明的梔子經初步萃取，所得梔子水溶性粗萃物再以分光光度法測得藏紅花素含量18%~20%，再經大孔吸附樹脂A萃取並測得的藏紅花素含量35%~40%。根據成人60公斤換算藏紅花素每日攝入量為0.738~2.214/日，相當於每日約7克梔子水溶性粗萃物及每日約1.67克的大孔吸附樹脂A萃取物。

參照第8圖，查以折線圖呈現各數據採集時間點之視覺功能表現。根據實驗第30天的各組的視覺功能表現的結果，空白對照組為0.41±0.03cpd、溶劑組為0.11±0.04cpd、葉黃素組為0.19±0.05cpd、Crocin-1組為0.26±0.07cpd、Crocin-5組為0.22±0.08cpd n=5以及水勢力產品組為0.22±0.07cpd。

根據結果顯示空白對照組於實驗期間具有良好視覺功能閾值表現，相較之下溶劑組的視力閥值明顯衰退(p=0.007)。相對於此，Crocin-1組及Crocin-5組能有效減緩視覺功能衰退之速度，且於與溶劑組及葉黃素組或水勢力產品組相比，小鼠視力維持於較佳視覺功能表現，並且以Crocin-1組的效果最為顯著。

綜合上述，根據本發明所揭露之方法所製得的梔子萃取物可以人體使用的安全劑量內施予個體後，達到減緩強光所造成的視功能傷害，以維持於較佳視覺功能之功效。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其效用，而非限制本發明。因此，任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等校修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

S101~S103:步驟

Claims (6)

1. 一種梔子萃取物的製造方法，其包含以下步驟：(A)將一梔子乾果進行一粉碎製程之後，以40wt%~95wt%乙醇進行萃取，得到一第一萃取物；(B)將該第一萃取物利用HP20型大孔吸附樹脂進行吸附，再經40wt%~95wt%乙醇進行沖提，得到一第二萃取物；以及(C)將該第二萃取物以LH20型大孔吸附樹脂進行吸附，再經60wt%~95wt%乙醇進行沖提，得到一梔子萃取物；其中，在該(C)步驟中，當使用800ml~1000ml乙醇量進行沖提，且每管收集15ml~20ml時，將所收集的第9管至第45管作為該梔子萃取物，且沖提之流速為1mL/min~10mL/min。
2. 一種以如請求項1所述之製造方法製得的梔子萃取物。
3. 如請求項2所述之梔子萃取物，其中該梔子萃取物含有具極性的藏紅花素。
4. 一種以如請求項2的梔子萃取物用於製備護眼的藥劑之用途，其中將一有效劑量之該梔子萃取物施予至一所需個體。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該有效劑量為每公斤體重使用1mg~40mg。
6. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該梔子萃取物係回復該所需個體的視覺功能閥值。

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