JP2022527996A - メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物の分裂組織細胞株のフィトコンプレックス及び選択された抽出物 - Google Patents

メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物の分裂組織細胞株のフィトコンプレックス及び選択された抽出物 Download PDF

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Abstract

本発明は、メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物の組織、好ましくはカルス組織から選択される分裂組織細胞株に関する。本発明はまた、選択された細胞株の誘導体、即ち、細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物にも関する。選択された分裂組織細胞株は、高いロスマリン酸含量を特徴とする。さらに、本発明は、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体の化粧品、機能性食品及び医学的用途にも関する。【選択図】図１５

Description

本発明は、高いロスマリン酸含量を特徴とするメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物の選択された分裂組織細胞株、並びに前記分裂組織細胞株又はその誘導体の化粧品、機能性食品及び医療用途に関する。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）は、シソ（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）科に属する自然発生的、多年草、耐寒性の草本植物であり、その薬効成分で知られ、芳香性のハーブとして高く評価されている。
伝統的な医療で使用されるシソ（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）科の多くの植物は、主にそのポリフェノール含量、特にそのロスマリン酸含量に関係する生物活性を有する。
ポリフェノール、とりわけ、ロスマリン酸は、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の典型的な成分である。文献に報告されている多くのデータは、ロスマリン酸の多数の異なる活性：抗酸化、抗菌、抗ウイルス、抗炎症、抗アレルギー、抗血栓及び抗腫瘍について記載している。さらに、ロスマリン酸は、アルツハイマー病を有する人々の細胞外血管及び実質性アミロイド沈着物に見出されるβアミロイドタンパク質によって誘導される神経毒を低減する。
これらの植物中のロスマリン酸及びポリフェノール含量は、極めて変動的である。この変動は、制御するのが困難な複数の要因：季節、植物齢、栽培地域及び製品の調製に用いられる組織に関連している。
さらには、標準化された植物誘導体（即ち、再現可能な含量の代謝物を含む）の調製は、多くの問題：異なる植物組織中での代謝物の含量の変動、季節による変動、植物寄生体による汚染、栽培地域に関係する相違、並びに収穫、貯蔵及び抽出中の分子の生物活性の喪失を引き起こす。抽出によって、植物又はその部分から直接得られる植物調製物の植物成分の含量の極端な変動は、その有効性にマイナスの影響を与える。
汚染物質のない標準化植物フィトコンプレックスを工業的量で取得するための別の方法は、インビトロ細胞培養物を使用するものである。この技術は、標準化された様式で再現することが可能な含量の活性物質を含む調製物を提供することから、植物抽出物の変動に関係する問題を解決することを可能にする。本発明は、この技術基盤に関連するものであり、標準化され、再現可能な含量の活性物質を含むフィトコンプレックスを取得することができる、選択された分裂組織細胞株を提供する。
本発明は、高いロスマリン酸含量を含むメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物の選択された分裂組織細胞株及びその誘導体を提供する。
本発明の第１の態様は、メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属、好ましくはメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種に属する植物由来の選択された分裂組織細胞株、好ましくは植物自体から得られるカルス組織由来の細胞株に関する。
本発明の第２の態様は、選択された分裂組織細胞株の誘導体、即ち、細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物に関する。
分裂組織細胞株及びその誘導体は、高いロスマリン酸含量を特徴とする。
本発明の第３の態様は、化粧品及び／又は医薬品の観点から許容される賦形剤と混合して、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体を含む組成物に関する。
本出願人は、選択された細胞株又はその誘導体が、抗酸化、抗炎症活性を有し、オートファジーを阻害すると共に、ミトコンドリアの形態の維持に有利に働くことにより、細胞死を低減することができることを実証した。特に、選択された細胞株又はその誘導体は、酸化的傷害を被ったニューロンの細胞死を低減することができる。
従って、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体は、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療又は予防、並びに膠芽腫及び脳虚血の治療又は予防のための、抗炎症剤として用いることができる。
さらには、本発明は、老化の徴候から皮膚を保護するための、及び細胞酸化を予防若しくは低減するための、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体の化粧品用途にも関する。
本発明の主題は、さらに、酸化ストレスの予防又は低減を目的とする、及び細胞老化に対する、選択された分裂組織細胞株又はその誘導体の機能性食品用途にも関する。
本発明の別の態様は、高いロスマリン酸含量を含むメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の植物分裂組織細胞の調製及び選択のためのプロセスに関する。
以下に本発明を詳述し、例として添付の図を参照にしながら説明する。
固体培地中に維持される、本発明の選択された分裂組織細胞株（Ｍｏ－４ＡＲと称する）を明視野光学顕微鏡で撮影した写真を示す。 図１の一部の拡大（２００×）を示す。 二酢酸フルオレセインで染色後の図１の一部の拡大（２００×）を示す。 Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの３３０ｎｍでのクロマトグラムを示す。 負イオン化によって得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィールを示す。 負イオン化によって得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラムを３次元で示す。 正イオン化によって得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィールを示す。 正イオン化モードでのロスマリン酸のピークのスペクトルを示す。 正イオン化によって得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラムを３次元で示す。 負イオン化モード（Ａ）及び正イオン化モード（Ｂ）でのマトリックスを示す（ｍ／Ｚ－＝マス負電荷、及びｍ／Ｚ＋＝マス正電荷、並びにｒｔ＝保持時間）。 ＬＰＳで刺激し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理したＴＨＰ－１細胞において、抗ＬＣ３抗体で標識した細胞内部に存在するオートファゴソーム小胞の数の評価を示す。 ＬＰＳで刺激し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理した、及び未処理のＴＨＰ－１細胞のミトコンドリア形態の評価を示す。 ＬＰＳで刺激し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理したＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－１βの発現を示す。 ＬＰＳで刺激し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理した、及び未処理のＴＨＰ－１細胞中のＬＤＨ試験による細胞毒性の評価を示す。 ロテノンで処理し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスでの処理を含む、及び含まないドーパミン作動性ニューロン（ＬＵＨＭＥＳ）のＬＤＨ試験による細胞毒性の評価を示す。 ロテノンで処理し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスでの処理を含む、及び含まないドーパミン作動性ニューロン（ＬＵＨＭＥＳ）内に存在するオートファゴソーム小胞の数の評価を示す。 ロテノンで処理すると共に抗ＬＣ３抗体で標識し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理していない（Ａ）、及びＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理した（Ｂ）ドーパミン作動性ニューロンを示す。 ロテノンで処理し、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスでの処理を含む、及び含まないドーパミン作動性ニューロンのミトコンドリア形態の評価を示す。
定義
本発明に関連して、「分裂組織系列」又は「分裂組織細胞」とは、新しい細胞を生み出すように有糸分裂により分裂する能力を維持することができる植物系列又は細胞を意味する。全ての分裂組織細胞は、別の分裂組織細胞に由来する。植物分裂組織細胞の機能は、動物の幹細胞の機能と同等である。
本発明に関連して、「カルス組織」とは、薄い細胞壁と、二次代謝産物が蓄積した大きな液胞を備える未分化細胞又はほとんど特殊化していない細胞の無秩序な塊を指す。
本発明に関連して、別に記載のない限り、「ｗ／ｗ」は、細胞株の乾燥質量に関する重量／重量の量を意味する。
本発明の第１態様は、メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属、好ましくはメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種に属する植物由来の分裂組織細胞株に関する。
一実施形態では、前記分裂組織細胞株は、以下：
１）メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、ロスマリン酸、及び好ましくは、多糖含量を測定するステップ；
５）最も高いロスマリン酸含量、及び好ましくは、多糖含量を有する細胞クローンを選択するステップ
を含むプロセスによって得られる。
ステップ１）では、メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属の植物から得られた組織を固体培地中に配置して、未分化カルス組織を取得する。メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の組織は、好ましくはメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の少なくとも１枚の葉又はメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の複数の葉である。
本発明の好ましい実施形態では、固体及び液体培地は、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含む。
固体培地は、さらに寒天を含むが、液体培地は、寒天を含有しない。
固体及び液体培地は、各々、１５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のナフチル酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
好ましい実施形態では、固体培地は、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
好ましい実施形態では、液体培地は、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される。
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、好ましくは以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される。
固体及び液体培地のいずれも、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
一実施形態では、固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される。この化合物の組合せは、ガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地である。
一実施形態では、固体及び液体培地のいずれも、上に挙げた塩に加えて、以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する。
固体及び液体培地は、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
固体及び液体培地の双方は、好ましくは各々、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のミオイノシトール；７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のピリドキシン－ＨＣｌ；及び５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のチアミン－ＨＣｌを含有する。
ステップ１）の後、カルス組織を好ましくは複数の部分に分割し、これらを、固体培地に連続的に移すことにより安定化させて（ステップ１ａ））、安定化した細胞を取得する。このステップは、安定化ステップと呼ばれる。
安定化ステップ１ａ）の後、安定化細胞の部分は、好ましくは、最初の「クローン選択」を経る。クローン選択は、適切な期間、好ましくは５～２０日の培養、より好ましくは１０～１５日の期間にわたって安定化細胞を培養するものである（ステップ１ｂ）。これらの細胞を１５℃～３５℃、好ましくは２４℃～２６℃の温度の暗所でインキュベートする。
ステップ２）では、固体培地から安定化細胞の凝集体を取り出すことにより、複数の細胞クローンを単離する。
ステップ３）では、細胞クローンを各々、前述した液体培地中に接種する。
一実施形態によれば、ステップ４）において、細胞クローンの適切な増殖を達成するような時間、好ましくは１０～１５日の増殖相の後、各クローンの多糖含量を定量する。
一実施形態では、ステップ５）において、ロスマリン酸の産生が最適であるメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の植物細胞株を取得するまで、２回目のクローン選択を繰り返す。
好ましい実施形態では、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．０５％～４０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０８％～３５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３％～２０％ｗ／ｗの量のロスマリン酸を含有する細胞株を取得するまで、ステップ５）のクローン選択を繰り返す。
好ましい実施形態では、前記細胞株は、２５％～７０％ｗ／ｗ、より好ましくは３０％～６５％ｗ／ｗの量の多糖を含有する。
好ましい実施形態では、細胞株は、１％～３５％ｗ／ｗ、好ましくは１．５％～３０％ｗ／ｗ、より好ましくは２％～２５％ｗ／ｗの量のタンパク質を含有する。
好ましい実施形態では、細胞株は、５％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは７％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは８％～１８％ｗ／ｗの量の脂質を含有する。
好ましい実施形態では、前記選択された分裂組織細胞株は、Ｍｏ－４ＡＲ株であり、３～２０％ｗ／ｗ、好ましくは３．９～４．２％ｗ／ｗのロスマリン酸を含有する。
本発明の第２の態様は、選択された分裂組織細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物である細胞株の誘導体に関する。
フィトコンプレックスとは、乾燥若しくは凍結乾燥された細胞、細胞ホモジネート、又は細胞壁及びそれらの構成要素を意味する。フィトコンプレックスは、好ましくは、細胞ホモジネートである。
前記フィトコンプレックスは、好ましくは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．０５％～４０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０８％～３５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３％～２０％ｗ／ｗの量のロスマリン酸を含有する。
フィトコンプレックスはまた、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、２５％～７０％ｗ／ｗ、より好ましくは３０％～６５％ｐ／ｐの量の多糖を含有する。
フィトコンプレックスは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、１％～３５％ｗ／ｗ、好ましくは１．５％～３０％ｗ／ｗ、より好ましくは２％～２５％ｗ／ｗの量のタンパク質を含有する。
フィトコンプレックスは、フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、５％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは７％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは８％～１８％ｗ／ｗの量の脂質を含有する。
好ましい実施形態では、前記フィトコンプレックスは、前記選択された分裂組織細胞株Ｍｏ－４ＡＲに由来し、３～２０％ｗ／ｗ、好ましくは３．９～４．２％ｗ／ｗのロスマリン酸を含有する。フィトコンプレックスは、好ましくは選択された分裂組織細胞株Ｍｏ－４ＡＲの細胞ホモジネートである。
抽出物は、アルコール溶媒中の、例えば、メタノール若しくはエタノール、又は様々な割合：５０：５０若しくは６０：４０若しくは７０：３０の水／エタノール混合物中の細胞株自体又は細胞株のフィトコンプレックスの抽出物を意味する。抽出物は、好ましくは細胞株の細胞ホモジネートの抽出物である。前記抽出物の含量は、フィトコンプレックス又はそれが得られた細胞株の含量と一致し、抽出技術によって変動し得る。
本発明の第３の態様は、化粧品、機能性食品及び／又は薬学的観点から許容される少なくとも１つの賦形剤と結合した分裂組織細胞株並びに／又はその誘導体（フィトコンプレックス及び／若しくは抽出物）を含む組成物に関する。
一実施形態では、組成物は、組成物の重量に対して、０．０１％～３０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０３％～１５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～１０％ｗ／ｗの濃度で細胞株及び／又はその誘導体を含む。前記組成物は、好ましくは、細胞ホモジネートであるフィトコンプレックスを含む。
一実施形態では、細胞株及び／又はその誘導体は、賦形剤と混合させる前に、分散させて、本発明の組成物を調製する。例として、好適な分散剤は、グリセリン、プロピレン又はブチレングリコールである。
本発明の組成物は、薬学的及び／又は化粧品用途について許容される少なくとも１つの賦形剤を含み、それは、組成物の調製に有用であり、一般に、生物学的に安全且つ無毒性である。
前記賦形剤は、皮膚用の少なくとも１つのコンディショニング剤、保湿剤、又は閉塞剤、界面活性剤、安定化剤、保存料又はエモリエント剤である。
本発明の組成物は、好ましくは丸薬、カプセル、錠剤、粒状粉、ハードシェルカプセル、口腔内崩壊顆粒、サシェ又はロゼンジとして、経口投与のために製剤化する。
一実施形態では、組成物は、そこに含まれる活性成分を急速に、又は投与後に遅延及び／若しくは制御様式で放出するように製剤化され、好ましくはリポソームとして製剤化される。
本発明の一実施形態によれば、組成物は、非経口投与のために製剤化される。特に、組成物は、液体の形態、好ましくは滅菌溶液、エマルジョン又は懸濁液の形態で製剤化される。
組成物はまた、クリーム、ゲルクリーム、ゲル、セラム、オイル、エマルジョン、エマルジョン－ゲル（エマルゲル）、軟膏、点眼薬、マウスウォッシュ、パッチ、スプレー、好ましくは鼻腔用スプレー、又はスティック（リップクリームなど）として局所用途のために製剤化することもできる。例えば、抗しわ及び抗酸化活性を有するフェイスセラム又はクリームとしての、好ましくはハンドクリーム又はフェイスクリームとしての組成物の製剤化が特に好ましい。
本明細書に含まれる実験データは、前述した細胞株又はその誘導体が、細胞死を低減し、且つ抗炎症作用及び抗酸化作用（フリーラジカルの低減）を及ぼすことができることを示している。
とりわけ、本出願人は、細胞株の誘導体が、オートファジーを低減すると共に、ミトコンドリア形態の維持に有利に働くことにより、インビトロ神経変性モデル、特にパーキンソン病のモデルにおける細胞死を制限することができることを証明している。オートファジーの阻害及びミトコンドリア形態の維持は、ニューロン死の減少に関連する機構である。実際に、ニューロン中の低レベルのオートファジーは、ホメオスタシスを維持するための生理学的条件であるが、過剰なオートファジーは、ニューロン死の原因となり得る。さらに、ミトコンドリア形態の変化は、細胞損傷と相関するために、細胞死を招き得る。
さらに、本出願人は、細胞株の誘導体が、インターロイキン１－β（ＩＬ－β）の放出を阻害すると共に、リポ多糖（ＬＰＳ）による酸化的傷害後の酸化ストレスを低減することにより、炎症レベルを低下させることができることも実証した。
本発明のさらに別の態様は、薬剤として使用するための、とりわけ、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療又は予防のための、並びに膠芽腫及び脳虚血の治療又は予防のための細胞株又はその誘導体に関する。
本発明はさらに、抗炎症剤としての使用のための細胞株又はその誘導体に関する。
本発明のさらに別の態様は、細胞株又はその誘導体の化粧品用途に関する。
化粧品用途とは、皮膚老化の徴候の予防、軽減及び／又は対処、抗しわ活性並びに抗酸化活性を意味する。
本発明のさらに別の態様は、皮膚の老化の徴候及び／又はフリーラジカル増加の予防若しくは軽減若しくは対処を目的とする栄養補助食品としての細胞株又はその誘導体の使用に関する。この場合、細胞株又はその誘導体は、丸薬、カプセル、錠剤、粒状粉、ハードシェルカプセル、口腔内崩壊顆粒、サシェ又はロゼンジなどの経口用途のための組成物に製剤化される。
本発明の別の態様は、高いロスマリン酸含量及び、好ましくは高い多糖含量を有する分裂組織植物細胞の調製及び選択のためのプロセスに関する。前記方法は、以下：
１）メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
４）各クローンについて、ロスマリン酸、及び好ましくは、多糖含量を測定するステップ；
５）最も高いロスマリン酸含量及び多糖含量を有する細胞クローンを選択するステップ
を含む。
一実施形態では、分裂組織の調製は、好ましくはメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種から選択される植物からの葉の組織を収集するステップ、例えば水でそれを洗浄するステップ、それを小片に細断するステップ、及びそれをプレート上で、例えば、エタノール、次亜塩素酸ナトリウム及び第一水銀塩を用いた連続的処理により殺菌するステップを伴う。
ステップ１）では、収集した組織を固体培地中に配置して、未分化カルス組織を取得する。
本発明の好ましい実施形態では、固体及び液体培地は、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含む。
固体培地は、さらに寒天を含むが、液体培地は、寒天を含有しない。
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１５～５０ｇ／Ｌ、より好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のナフチル酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１ｍｇ／Ｌ～２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
好ましい実施形態では、固体培地は、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
好ましい実施形態では、液体培地は、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する。
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される。
固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、好ましくは以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及びＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ並びにそれらの組合せから選択される。
固体及び液体培地のいずれも、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含み、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される。
一実施形態では、固体及び液体培地の双方で、植物細胞の成長に好適な塩は、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される。この塩の組合せは、ガンボーグＢ５培地である。
一実施形態では、固体及び液体培地のいずれも、上に挙げた塩に加えて、以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンをさらに含む。
固体及び液体培地は、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む。
固体及び液体培地は、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する。
固体及び液体培地のいずれも、好ましくは各々、７０～１３０ｍｇ、より好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のミオイノシトール；７０～１３０ｍｇ、より好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度のピリドキシン－ＨＣｌ；及び５～２０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のチアミン－ＨＣｌを含有する。
ステップ１）の後、カルス組織を好ましくは複数の部分に分割し、これらを、固体培地に連続的に移すことにより安定化させて（ステップ１ａ））、安定化した細胞を取得する。このステップは、安定化ステップと呼ばれる。
安定化ステップ１ａ）の後、安定化細胞は、好ましくは、最初の「クローン選択」を経る。クローン選択は、好適な期間、好ましくは５～２０日の培養、より好ましくは１０～１５日の期間にわたって安定化細胞を培養するものである（ステップ１ｂ）。これらの細胞を１５℃～３５℃、好ましくは２４℃～２６℃の温度の暗所でインキュベートする。
ステップ２）では、固体培地から安定化細胞の凝集体を取り出すことにより、複数の細胞クローンを単離する。
ステップ３）では、細胞クローンを各々、前述した液体培地中に接種する。
一実施形態によれば、ステップ４）において、細胞クローンの適切な増殖を達成するような時間、好ましくは１０～１５日の増殖相の後、各クローンの多糖含量を定量する。
一実施形態では、ステップ５）において、ロスマリン酸の産生が最適であるメリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）の植物細胞株を取得するまで、２回目のクローン選択を繰り返す。
次に、選択した細胞株を、フラスコ又はバイオリアクター又は発酵槽内で増殖させて、バイオマスの増加を達成する。バイオマスの増加は、ＭＯと呼ばれる液体増殖培地中の最初の段階で起こる。液体増殖培地ＭＯは、前述したガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）塩、上に挙げたビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する培地である。
液体増殖培地ＭＯは、ガンボーグ塩のうち、ＫＮＯ3を１．５ｇ／Ｌ～３．５ｇ／Ｌ、好ましくは２ｇ／Ｌ～３ｇ／Ｌの量で含有する。スクロースは、好ましくは、１５ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌで含まれる。ＮＡＡは、好ましくは、０．５ｍｇ／Ｌ～１．５ｍｇ／Ｌで含まれる。ＩＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。キネチンは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。
液体培地ＭＯで増殖させた細胞は、最終増殖相のために、ガンボーグ塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する最終液体培地ＭＯ－Ｆ中に移し、これによってロスマリン酸含量及びバイオマスの増加を誘導する。
最終液体培地ＭＯ－Ｆは、ガンボーグ塩のうち、ＫＮＯ3を０．５ｇ／Ｌ～２ｇ／Ｌの量で含有する。スクロースは、好ましくは、２５ｇ／Ｌ～４５ｇ／Ｌで含まれる。ＮＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。ＩＡＡは、好ましくは、０．２ｍｇ／Ｌ～１ｍｇ／Ｌで含まれる。キネチンは、好ましくは、０．１ｍｇ／Ｌ～０．５ｍｇ／Ｌで含まれる。
好ましい実施形態によれば、ＭＯ増殖培地及び最終ＭＯ－Ｆ培地の双方で、フラスコ、バイオリアクター又は発酵槽中の細胞株の増殖は、暗所の条件下、１５℃～３５℃、典型的には２５℃の温度で、７～３０日、好ましくは１４～２１日にわたって実施する。
最終液体培地ＭＯ－Ｆでの増殖の終わりに、細胞株を濾過した後、細胞を回収して、フィトコンプレックスの形態で次のステップで使用するか、或いはまた、後のアルコール溶媒中の抽出相にそれらを付して、高いロスマリン酸含量を特徴とする細胞抽出物を生成することもできる。
フィトコンプレックスは、生きた細胞の凍結乾燥又は乾燥によって得ることができ；この場合、フィトコンプレックスは、死滅細胞の凍結乾燥物である。
一実施形態では、フラスコ、バイオリアクター又は発酵槽中での増殖の終わりに、細胞を、好ましくは酸性化溶液（例えば、アスコルビン酸若しくはクエン酸若しくは酢酸を含む）中での、例えば、機械的粉砕によりホモジナイズした後、凍結乾燥又は乾燥させる。後者の場合、フィトコンプレックスは、細胞及びその内部構造が崩壊している細胞ホモジネートである。これらの異なるタイプのフィトコンプレックスは、全てが、既述のように高いロスマリン酸含量を有することを特徴とする。
或いは、好ましくは細胞ホモジネートの形態のフィトコンプレックスは、従来の技法を用いて、アルコール溶媒（例えば、メタノール若しくはエタノール又はエタノール／水混合物）中での抽出に付す。こうして得られた抽出物は、上に詳述したように、高いロスマリン酸含量を特徴とし、前述した通り、化粧品、機能性食品又は医薬組成物の調製のために使用することができる。
或いはまた、精製後、生きた細胞をそのまま、本発明の組成物の調製に直接使用することができる。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞株の作製及び選択
文献に記載されている標準的手順を用いて、カルス組織の誘導を達成した。この手順により、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の滅菌植物からの葉の収集を実施する。滅菌植物は、順に、７０％エタノールの水溶液で約２分、２％次亜塩素酸ナトリウム及び０．１Ｔｗｅｅｎ ２０で１５分による処理、最後に、滅菌蒸留水で少なくとも４回の洗浄を用いて消毒した種子から取得した。消毒済種子を、寒天の添加により固体にし、成長ホルモンは含まないガンボーグＢ５栄養培地を含有するトレイ内に配置する。照明下及び２５℃での好適な期間（１５日）のインキュベーションの後、種子は発芽を開始する。発芽から２０日後、滅菌条件下で生長した植物から小さな葉を収集する。葉を１ｃｍ未満の寸法（０．１～０．５ｃｍ）の小片に細断した。植物組織の断片を、寒天の添加により固体にした栄養培地を含むペトリ皿内に載せて、成長ホルモンを添加した。２５℃の暗所での好適な期間のインキュベーション後、未分化カルス組織が形成し；次にこれを、新鮮な培地を含む、より広い表面に移した後、増殖させる。
得られた分裂組織細胞は、固体培地に何回か移すこと（二次培養）によって、安定化させる。
２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン及び０．７～０．９％の植物用寒天が添加され、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５培地（ＭＯ培地）中でメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の細胞株を維持する。この特定の培地中で得られた細胞株は、Ｍｏ－４ＡＲと称された。得られた分裂組織細胞が植物種メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）に属することをＤＮＡフィンガープリント分析により確認した。
細胞株ＭＯ－４ＡＲを増殖させて、液体培地（寒天を含まないＭＯ培地）に細胞を移すのに十分な量のバイオマスを取得する。液体培地での増殖後、細胞懸濁液をバイオリアクターに移すことができ、これは、さらなる増殖相のための最終生産培地又はＭＯ増殖培地を含有し得る。
生産液体培地（ロスマリン酸含量を増加するように最適化されている）は、３５ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、及び０．２５ｍｇ／Ｌのキネチンが添加され、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５（ＭＯ－Ｆ培地）である。
細胞株Ｍｏ－４ＡＲの形態的特徴
Ｍｏ－４ＡＲと称されるメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の細胞株を固体ＭＯ培地中で維持するが、これは、褐色気味のベージュ色であり、脆い質感をしている。図１～３は、固体ＭＯ培地中に維持される細胞培養物の写真（図１）、並びに明視野モードで（図２）及び二酢酸フルオレセインで染色後に（図３）、ＡＸＩＯ－Ｉｍａｇｅｒ Ａ２光学顕微鏡（ＺＥＩＳＳ）で観察された細胞株Ｍｏ－４ＡＲの細胞の写真を示す。
ホモジナイゼーション手順
選択され、２５℃（±２）のバイオリアクター内で１４日間増殖させた細胞のバイオマスをホモジナイズする手順は、以下：
ａ）ＭＯ－Ｆ培地中でのＭｏ－４ＡＲ細胞培養物の増殖から得られたバイオマスの濾過により、細胞のみを取得し、培地を廃棄するステップ；
ｂ）細胞の２倍量の食塩水（滅菌水中０．９％Ｗ／Ｖ ＮａＣｌ）で細胞を洗浄するステップ；
ｃ）濾過し、洗浄したバイオマスに、１．５％Ｗ／Ｗ（０．５～２％Ｗ／Ｗ）のクエン酸（又はアスコルビン酸若しくはクエン酸とアスコルビン酸の混合物）を添加するステップ；
ｄ）例えば、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ又は細胞及びその内部構造を破砕するのに好適な他の器具を用いて、混合物をホモジナイズするステップ；
ｅ）凍結乾燥又は空気循環乾燥又は回転シリンダー乾燥又は流動層乾燥又は噴霧によりバイオマスを乾燥させるステップ
を含む。
記載の手順を用いて、Ｍｏ－４ＡＲと称されるフィトコンプレックスを取得する。
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの内容の明細：
３５～５５％の炭水化物
０，１～３０％のロスマリン酸
２～２５％のタンパク質
８～１８％の脂質
３～６％の水分
５～１３％の灰
５～３０％のクエン酸
ＭＯ－Ｆ培地中の標準化Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの調製の例は、非限定的な例として提供される。
このようにして得られたフィトコンプレックスは、そのまま使用されるか、又は０．５～５％ｗ／ｗの範囲の濃度で植物グリセリン又はブチレングリコール又はプロピレングリコール中に分散される。こうして得られた懸濁液は、ＣＲＯＰ（登録商標）－Ｇと称される。
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの調製及び分析
固体ＭＯ培地（２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン及び０．８％の植物用寒天を含有する、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５培地）中で培養された、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の株由来の、既述のように安定化及び選択された分裂組織細胞（Ｍｏ－４ＡＲと称される）を、２００ｍｌの液体ＭＯ－Ｆ培地（３５ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、０．２５ｍｇ／ＬのＫを添加した、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５培地）を含有する５つの１リットル容量フラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖであった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に置いた。１４日のインキュベーション後、植物バイオマス（１リットルの細胞懸濁液）を収集し、孔径５０μｍのナイロンメッシュで濾過し、８２０ｍｌの滅菌食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ）で洗浄した。洗浄した細胞（新鮮重量４１０ｇ）に４．１ｇのクエン酸を添加し、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘでホモジナイズした。
ホモジナイズした細胞を凍結乾燥した。１リットルの細胞懸濁液から、以下：１．２８ｇのロスマリン酸、１６ｇの総多糖類、５．７６ｇのタンパク質、２．７２ｇの脂質、１．４４ｇの灰、及び４ｇのクエン酸を含有する３２ｇの凍結乾燥物（Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス）が得られた。
Figure 2022527996000002
以下に記載する方法を用いて、ホモジネートの特性決定を実施した：
ａ）ＵＰＬＣ－ＤＡＤによるＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中のロスマリン酸の定量
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの１００ｍｇの粉末を計量して１５ｍＬ試験管に導入し、３０容量のエタノールと水６０：４０（Ｖ／Ｖ）を添加した。懸濁液をボルテックスミキサーで３０秒混合した後、氷浴中で１５分音波処理し；最後に、６℃にて１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の終了時に、上清を回収した。１５ｍＬの上清を新しい試験管に移し、ＵＰＬＣシステムにロードするまで、氷中で保存した。サンプルを１：１０（初めに溶媒で１：５、続いて水で１：２）希釈した。希釈したサンプルを０．２２μｍフィルターで濾過した後、ＵＰＬＣシステムにロードした。ロスマリン酸の定量に用いるクロマトグラフィーシステムは、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ ＶａｎＧｕａｒｄ Ｐｒｅ－Ｃｏｌｕｍｎ ３／Ｐｋ、サイズ２．１×５ｍｍに連結された、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍカラム、サイズ２．１×１００ｍｍである。ＵＰＬＣ－ＤＡＤ分析に用いるプラットフォームは、ＰＤＡ ｅλダイオードアレイ検出器に連結された、溶離液管理モジュール、Ｂｉｎａｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍａｎａｇｅｒ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓ、及びオートサンプラー、Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ－ＦＴＮ ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｃｌａｓｓから構成されるＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を含む。Ｅｍｐｏｗｅｒ ３（Ｗａｔｅｒｓ）ソフトウェアを用いて、データを取得し、解析した。使用したクロマトグラフィー法は、以下：溶媒Ａ：水、０．１％ギ酸；溶媒Ｂ：１００％アセトニトリルであった。初期条件は、９９％溶媒Ａであり；さらに、流量は、分析期間全体を通して、０．３５０ｍｌ／分で一定のままである。クロマトグラフィーカラムは、３０℃に温度制御した。表２に示すように、勾配及びイソクラティック相を交互にすることにより、分子の溶離を実施した。
Figure 2022527996000003
ロスマリン酸の定量のために、３３０ｎｍの波長に関連するクロマトグラムを使用した。ロスマリン酸は、信頼できるロスマリン酸の商業的標準の検量線（ＣＡＳ ２０２８３－９２－５；純度≧９５％；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって定量した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアを用いて、データ解析を実施した。３３０ｎｍでのＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィールを図４に示す。
表３は、ＵＰＬＣ分析による、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中に検出されたロスマリン酸の濃度を示す。
Figure 2022527996000004
ｂ）Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ解析
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの粉末を、ボルテックス式ミキサーで３０秒攪拌した後、氷の下、１５分間４０Ｈｚの音波処理装置内で、３０容量のメタノール：水９０：１０を用いて抽出し；４℃にて、１８０００ｇで１０分の遠心分離後に抽出物を回収した。分析の前に、３２０ｎｍで０．４～０．６の分光光度的吸光度を取得するように、好適な量の同じ溶媒（メタノール：水９０：１０）でサンプルを希釈した。サンプルを水でさらに希釈し、ＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳにより分析した。
クロマトグラフ分離を伴う質量分析法のために、ＥＳＩ供給源を備える、Ｅｓｑｕｉｒｅ ６０００ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と「オンライン」で連結されたＨＰＬＣシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ １，オートサンプラーを備える溶媒モジュール（Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ））を使用した。Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ５．２－ＥｓｑｕｉｒｅＣｏｎｔｒｏｌ ５．２プログラムを用いて、クロマトグラフ及び質量データを収集し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ５．２－Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．２ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理した。
流量：２００μｌ／分、２５℃；注入量：１０μｌ。
使用したカラム：７．５×２．１ｍｍガードカラムと連結された、Ａｌｌｔｉｍａ ＨＰ Ｃ１８ ３μｍ １５０×２．１ｍｍ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，Ｄｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。
ＥＳＩ：ネブライザーガスＮ２，圧力５０ｐｓｉ、温度３５０℃、乾燥ガス１０ｌ／分
質量取得：５０～１５００ｍ／ｚの範囲で交流するフルスキャン；真空圧：１．４×１０～５ｍバール。
タンデム質量分析法の場合：フラグメンテーション振幅：１Ｖ；衝突ガス：ヘリウム。
使用したクロマトグラフ分離法は以下の通りであった：
溶離液：
－溶液Ａ：５％ＡＣＮ及び０．５％ギ酸水溶液、溶液Ｂ：１００％ＡＣＮ
溶離の合計時間：４２分
勾配：
－分析の開始：溶離液Ａ１００％；
－勾配１：１０％の溶離液Ｂを２分；
－勾配２：２分時点で、２０％のＢを１０分；
－勾配３：１２分時点で、２５％のＢを２分；
－勾配４：１４分時点で、７０％のＢを７分；
－イソクラティック１：７０％のＢで６分；
－勾配５：２７分時点で、９０％のＢを５分；
－イソクラティック２：１０分毎に９０％のＢ；
－カラムの最終再平衡化：４２分時点で、０％のＢを１分、６０分時点で分析の終了。
負イオン化によって得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィール（ＢＰＣ、基準ピーククロマトグラム）を図５に示す。
このプロフィールは、保持時間の２５分時点でドミナントピークを示す。このピークは、ｍ／ｚ３５９を有する化合物と一致する。このピークの保持時間、そのｍ／ｚ値、及びそのフラグメンテーションスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）は、ロスマリン酸のもの（商業的標準）と一致する。
図６は、負イオン化モードによるＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスに対して実施された分析のクロマトグラムを３次元で示す。
正イオン化モードでのＨＰＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳを用いて得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのクロマトグラフプロフィール（ＢＰＣ、基準ピーククロマトグラム）を図７に示す。
ロスマリン酸のピークは、酸がイオン化される傾向が低いために、あまり明瞭ではない（矢印で示す）。正イオン化モードでのピークのスペクトルを図８に示す。
図９は、正イオン化モードで実施されたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの解析のクロマトグラムを３次元で示す。
負イオン化モードのマトリックスは、３０シグナル（代謝物質並びにそれらの付加物及び断片に対応する）を含み、正イオン化モードのマトリックスは、７０シグナルを含む（図１０）。
ｃ）Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中の多糖含量の定量分析
分析は、フェノール硫酸法（Ｓｅｇａｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｍ Ｊ Ｅｎｏｌ Ｖｉｔｉｃ．）を改変することによって実施した。この方法は、多糖の酸加水分解を伴い、これにより単糖が放出される。単糖は、フェノールと反応して、黄色を発色し、これは、４９０ｎｍで分光光度計を用いて測定することができる。得られた結果は、５００ｍｇ／ｇのＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスと同等の量の多糖を示し、これは、５０％に相当する。
ｄ）Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスのタンパク質含量の分析
Ｌｙｎｃｈ，Ｊ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，“Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｓ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９），８２（６），１３８９－１３９８に記載されている通り、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法を用い、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスに対して、タンパク態窒素の総含量の測定を実施した。
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中のタンパク質含量は、１８％ｗ／ｗであった。
ｅ）Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの脂質含量の分析
Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｓｏｘｈｌｅｔ ｌｉｐｉｄｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｔｔｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ｏｒ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ”．Ｇｒａｓａｓ ｙ Ａｃｅｉｔｅｓ（１９９７），４８（４），２２６－２３０に記載されている方法に従って、少なくとも１２時間にわたる、ジクロロメタンでのＳｏｘｈｌｅｔ抽出により、全脂質画分の抽出をＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスに対して実施した。
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中の脂質含量は、８．５％ｗ／ｗに等しかった。
ｆ）Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス中の水分及び灰の分析
４０℃のストーブに材料を１２時間放置することにより、フィトコンプレックスに対して水分の測定を実施した。灰の測定は、一定重量に到達するまで、３００℃のマッフル炉内で材料を処理することにより取得した。
フィトコンプレックスの水分は、２．５％に等しく、灰は、４．５％に等しかった。
工業規模でのＭｏ－４ＡＲの調製
固体ＭＯ培地（２０ｇ／Ｌのスクロース、１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸、１ｍｇ／Ｌのインドール酢酸、０．５ｍｇ／Ｌのキネチン及び０．８％の植物用寒天を含有する、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５）中で培養したＭｏ－４ＡＲと称されるメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の株に由来する、既述のように安定化及び選択した分裂組織細胞を、２００ｍｌの液体ＭＯ培地を含有する１リットル容量の１０のフラスコに接種した。液体培地に接種した分裂組織細胞の量は、６％Ｗ／Ｖに等しかった。このようにして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、８００ｍｌの液体ＭＯ培地を含有する３リットル容量の１０のフラスコに接種した。２００ｍｌの細胞懸濁液を、３リットル容量のフラスコに入った８００ｍｌのＭＯ培地中に移した。こうして得られた懸濁液を２５℃の暗所でインキュベートし、１２０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカーの上に載せた。７日のインキュベーション後、細胞懸濁液を用いて、９０リットルのＭＯ－Ｆ培地（３５ｇ／Ｌのスクロース、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ＬのＩＡＡ、及び０．２５ｍｇ／ＬのＫが添加され、最終ｐＨ６．５のガンボーグＢ５）を含有するバイオリアクターを接種した。
バイオリアクター内での１４日の増殖後、植物バイオマス（１００リットルの細胞懸濁液）を収集し、孔径５０μｍのナイロンメッシュで濾過し、６２Ｌの滅菌食塩水（０．９％Ｗ／Ｖ）で洗浄した。洗浄した細胞（新鮮重量３１ｋｇ）に３１０ｇのクエン酸を添加し、Ｕｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘでホモジナイズした。
ホモジナイズした細胞を乾燥させた。１００リットルの細胞懸濁液から、３１２０ｇのＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスが得られた。
マクロファージ細胞培養物についてのオートファジー、ミトコンドリア形態、ＩＬ－１ｂ発現及び細胞毒性の測定による、ＬＰＳでの酸化ストレス後のマクロファージ細胞に対するＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの細胞保護活性を評価するための試験
ＴＨＰ－１細胞株に対して試験を実施した。この細胞株は、急性骨髄性白血病患者の末梢血に由来する単球から構成される。ＴＨＰ－１細胞を、ＰＭＡ（ホルボール １２－ミリスタート１３－アセタート）によりマクロファージに分化させる。細胞株を懸濁又は接着状態で維持する。Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの抽出物の存在下又は非存在下で、マクロファージをＬＰＳで活性化させる。
生物学的アッセイをセットアップするためのフィトコンプレックス抽出：続いて３容量のメタノールで処理した１００ｍｇのＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスを抽出のために計量した。得られた溶液をＶｏｒｔｅｘミキサーで混合してから、１５分間氷冷中の音波処理に付した後；これを４℃にて、４５００ｒｐｍで１０分遠心分離した。取得した上清を回収し、３０μＬアリコートに分割した。次に、抽出溶媒を作製して、ＳｐｅｅｄＶａｃにより室温で３時間蒸発させた。乾燥させたサンプルを－２０℃で、使用まで保存した。
細胞（１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激）に投与する直前に、乾燥サンプルのアリコート（３０μＬの抽出物に相当）を２００μＬのエタノール及び１８００μＬの水に溶解させた。５００μＬの希釈物を２．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に添加し、０．２２μｍで濾過して、それを滅菌した。得られた溶液を用いて、２０，０００，０００ＴＨＰ－１細胞を接種した。同じ数のＴＨＰ－１細胞を、対照サンプルとして、５００μＬの滅菌水を添加した２．５ｍＬのＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。処理細胞のサンプル、及び対照溶液で処理したサンプルを３７℃で１８時間、５％ＣＯ2流（Ｖ／Ｖ）の下でインキュベートした。インキュベートの終わりに、無血清ＲＰＭＩで洗浄した細胞を、オートファジー、ミトコンドリア形態、ＩＬ－１β及びＬＤＨを評価するための試験に使用した。
ＬＣ３発現によるオートファジーの評価
フィトコンプレックスで処理した細胞及び未処理の細胞をスライド上に固定し、抗ＬＣ３抗体（オートファゴソーム小胞のマーカ）で染色した後、様々な条件下でオートファジー活性を測定した。オートファジーの程度の評価は、蛍光顕微鏡を用いて、細胞内に存在するオートファジー細胞（蛍光）の数を計数することにより実施する。
抗ＬＣ３抗体でのマーキングは、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）のＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスが、ＬＰＳによる酸化ストレスの誘導後にＴＨＰ－１細胞中のオートファゴソームの産生を有意に阻害することができることを証明した（図１１、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
オートファジーは、細胞がストレス状況にあるとき、一般に増加する細胞防御機構である。その活性化は、それ自体でマイナスのプロセスではないが、細胞が、それに損傷を与えている可能性がある傷害に応答していることを示している。Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、酸化ストレス後のＴＨＰ－１細胞中のオートファジーを有意に低減することから、ＬＰＳによるストレスの誘導の効果を低下させる。
ミトコンドリア形態の評価
ミトコンドリア形態の評価は、ミトコンドリアタンパク質ＴＯＭ２０に特異的な蛍光染色（免疫蛍光）を用いて実施した。ミトコンドリアの形状；特に、長軸と短軸の比（「アスペクト比」：ＡＲ）は、その健康状態の優れた指標である。ＡＲが高いほど、ミトコンドリアは良好且つ健康であり：従って、より高い値は、細胞保護に関してプラスの結果と同等である。
ＬＰＳで刺激され、且つＭＯ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理した、及び未処理のＴＨＰ－１細胞に対して、ミトコンドリア形態の評価を実施した（図１２、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞から得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、対照と比較して、ミトコンドリアの「アスペクト比」（概ね長円と考えられるミトコンドリアの長軸と短軸の比）を増加する上で有効であることが実証された。
ＩＬ－β発現の評価
ＩＬ－１βは、炎症性サイトカインであり、ＲＴ－ＰＣＲ解析により定量した。１８時間Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックス及びＬＰＳで処理した、及び未処理のＴＨＰ－１細胞の核酸を、特定の溶解バッファー及びＲＮＡキットを用いて抽出した。ｃＤＮＡ転写キットを用いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置を用いて、ＩＬ－１βの遺伝子発現を試験した。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞から得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ－１細胞中のＩＬ－１βの発現を阻害する上で有効であることが実証された（図１３、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
細胞毒性（ＬＤＨ）の評価
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）由来のＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックス及びＬＰＳで処理した、及び未処理のＴＨＰ－１細胞の細胞毒性の評価は、細胞溶解後の培地中に遊離された酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量することによって実施した。１８時間のインキュベーション後、１アリコートの培地を取り出し、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ混合物と一緒にインキュベートする。溶液を、アッセイしようとする培地に２：１比で添加する。溶液を２０分間室温の暗所でインキュベートする。ＨＣｌ １Ｎの添加により反応を停止する。４９０ｎｍでの吸光度を測定することにより、分光光度計でサンプルを読み取る。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞から得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、ＬＰＳにより引き起こされた細胞死を制限する上で有効であることが実証された（図１４、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
パーキンソン病の細胞モデルに対するＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの作用の評価
パーキンソン病は、６０歳以上の集団の１％が罹患する神経変性疾患であり、これは、細胞の見地から、中脳の黒質のドーパミン作動性ニューロンに関与している。ニューロン死は、無動症候群又は振戦麻痺を招く。この生物学的試験では、ドーパミン作動性ニューロンのインビトロモデル（ＬＵＨＭＥＳ）を使用し、これを神経毒（ロテノン）に曝露して、パーキンソン病患者に起こるものを模倣する損傷をシミュレートした。メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞からのＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスを用いて、損傷ニューロンに対する保護効果を評価した。
前パラグラフに記載のように、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスをメタノールから抽出した。得られた抽出物を濾過し、使用まで凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を培地に直接添加した（０．５ｍｇ／ｍＬのフィトコンプレックスに相当する最終濃度で）。
細胞毒性試験
細胞に対するその考えられる保護効果を確認するために、１つの条件下で、ｐＨ＝６のロテノン５ｎＭで細胞を２時間処理することにより、細胞を神経毒性環境に付すと共に、別の条件下で、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの抽出物と一緒にロテノンを添加した。５％ＣＯ2流（Ｖ／Ｖ）と共に３７℃で２時間のインキュベーション後、２つの異なる条件下で培地中の酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）に対してアッセイを実施した。
図１５から認められるように、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞から得られるＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの効果は有意にプラスである。言い換えれば、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、ロテノンにより誘導される損傷からドーパミン作動性ニューロンを保護する（１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
ＬＣ３オートファジーの評価
フィトコンプレックスがドーパミン作動性ニューロンの細胞死を低減する機構を調べるために、細胞を同じ方法で損傷させて、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの存在及び非存在下で、毒性（ｐＨ＝６のロテノン５ｎＭで２時間）を試験した。次に、細胞をスライド上に固定し、抗ＬＣ３抗体（オートファゴソーム小胞のマーカ）で染色した後、２つの異なる条件下でオートファジー活性を定量した（図１６、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊ｐ＜０．０１）。
ドーパミン作動性ニューロンのＬＣ３染色の場合、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）のＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスで処理された細胞では、色（白）の強度が、フィトコンプレックスで処理していない細胞（＋対照）よりも低い（図１７）ことを認めることができる。
ミトコンドリア形態の評価
ロテノンの作用機構は、ミトコンドリアレベルで細胞呼吸を遮断すること（呼吸鎖の遮断）にある。そのため、これにより、細胞が酸素を用いて、ＡＴＰの形態でエネルギーを生産することが妨げられる。このプロセスは、ミトコンドリア内で起こることから、Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスが及ぼす防御機構を検証するために、ミトコンドリアタンパク質ＴＯＭ２０を染色することにより、ミトコンドリアの形態を分析した（ここでも、既述した条件下で）。ミトコンドリアの形状は、その健康状態の標識である。特に、長軸と短軸の比（「アスペクト比」）を測定した。
メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞のＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスは、ロテノンで処理したドーパミン作動性ニューロン中のミトコンドリアのアスペクト比を有意に増加し得ることが実証された（図１８、１元配置分散分析及びダネットの事後検定を用いて、＊＊ｐ＜０．０１）。
結論として、メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の分裂組織細胞から得られたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスを、ロテノンで損傷したドーパミン作動性ニューロンから成るパーキンソン病のモデルに適用すると、ロテノン自体によって誘導された損傷からの保護を細胞にもたらす。
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスの２相及び多重エマルジョン並びにゲル形態への製剤化
Ｍｏ－４ＡＲフィトコンプレックスを３％Ｗ／Ｗの濃度のグリセリン（ＩＮＣＩ名：グリセリン（及び）メリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）カルス溶解物（及び）クエン酸）に分散させた。分散液を３％で以下に記載する処方に添加した。
Figure 2022527996000005
Figure 2022527996000006
水相の成分を混合し、７０℃に加熱した。油相の成分を混合し、７５℃に加熱した。ターボ乳化機の作用下で、２つの相を合わせた。約４０℃まで冷却した後、穏やかに攪拌しながら、グリセリンに分散させたＭｏ－４ＡＲフィトコンプレックスを添加した。

Claims (26)

  1. 以下：
    １）メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
    ２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
    ３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
    ４）各クローンについて、ロスマリン酸及び多糖含量を測定するステップ；
    ５）最も高いロスマリン酸含量及び多糖含量を有する前記細胞クローンを選択するステップ
    を含むプロセスによって得られる、メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属、好ましくはメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種に属する植物由来の選択された分裂組織細胞株であって、
    前記固体及び液体培地が、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含み、
    前記細胞株が、前記細胞株の乾燥質量に対して、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．０５％～４０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０８％～３５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３％～２０％ｗ／ｗの量のロスマリン酸、及び２５％～７０％ｗ／ｗの量の多糖を含有する分裂組織細胞株。
  2. 前記固体及び液体培地が、各々、１５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは１８～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～２ｍｇ／Ｌの濃度のＮＡＡ、０．１～２．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～１ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．２～１ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１に記載の分裂組織細胞株。
  3. 前記液体培地が、以下：２５～５０ｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフチレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１又は２に記載の分裂組織細胞株。
  4. 前記固体培地が、以下：１０～３０ｇ／Ｌ、好ましくは１５～２５ｇ／Ｌの濃度のスクロース、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のナフチレン酢酸（ＮＡＡ）、０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．５～１．５ｍｇ／Ｌの濃度のインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び０．２～１ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．３～０．８ｍｇ／Ｌの濃度のキネチンを含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  5. 前記植物細胞の成長に好適な塩が、以下：ＣａＣｌ2、ＫＮＯ3、ＭｇＳＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、（ＮＨ4）2ＳＯ4及びそれらの組合せから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  6. 前記植物細胞の成長に好適な塩が、以下：ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、ＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、Ｈ3ＢＯ3、Ｋｌ、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及びそれらの組合せから選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  7. 前記固体及び液体培地が、好ましくは各々、１２０～１７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１３０～１６０ｍｇ／Ｌの濃度のＣａＣｌ2；８００～３０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０００～２６００ｍｇ／Ｌの濃度のＫＮＯ3；２２０～２７０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２３０～２６０ｍｇ／Ｌの濃度のＭｇＳＯ4、１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＨ2ＰＯ4；及び１００～１８０ｍｇ／Ｌ、好ましくは１１０～１５０ｍｇ／Ｌの濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4を含有する、請求項５に記載の分裂組織細胞株。
  8. 前記固体及び液体培地が、好ましくは各々、０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ；０．０１～０．０５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５～０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ；２０～６０ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０～４５ｍｇ／Ｌの濃度のＮａＥＤＴＡ・２Ｈ2Ｏ；１５～４５ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０～３５ｍｇ／Ｌの濃度のＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；１～７ｍｇ／Ｌ、好ましくは２～５ｍｇ／Ｌの濃度のＨ3ＢＯ3；０．１～２ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．４～１ｍｇ／Ｌの濃度のＫｌ；５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度のＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ；０．１～０．５ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１５～０．３ｍｇ／Ｌの濃度のＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ、及び０．５～５ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～３ｍｇ／Ｌの濃度のＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含有する、請求項６に記載の分裂組織細胞株。
  9. 前記固体及び液体培地の双方が、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  10. ミオイノシトールが、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度で存在し；ピリドキシン－ＨＣｌが、７０～１３０ｍｇ、好ましくは９０～１１０ｍｇの濃度で存在し；チアミン－ＨＣｌが、５～２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは７～１５ｍｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項９に記載の分裂組織細胞株。
  11. ３０％～６５％ｗ／ｗの量の多糖を含有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  12. １％～３５％ｗ／ｗ、好ましくは１．５％～３０％ｗ／ｗ、より好ましくは２％～２５％ｗ／ｗの量のタンパク質を含有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  13. ５％～２５％ｗ／ｗ、好ましくは７％～２０％ｗ／ｗ、より好ましくは８％～１８％ｗ／ｗの量の脂質を含有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株。
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株のフィトコンプレックス又は抽出物。
  15. 乾燥若しくは凍結乾燥された細胞、又は細胞ホモジネート、又は細胞壁及びそれらの構成要素、好ましくは、前記分裂組織細胞株のホモジネートである、請求項１４に記載のフィトコンプレックス。
  16. 前記フィトコンプレックスの乾燥質量に対して、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．０５％～４０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０８％～３５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３％～２０％ｗ／ｗの量のロスマリン酸を含有する、細胞ホモジネートである、請求項１４に記載のフィトコンプレックス。
  17. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株並びに／又は請求項１４～１６のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物を含む組成物。
  18. 総組成物に対して、０．０１％～３０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０３％～１５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０５％～１０％ｗ／ｗの濃度で分裂組織細細胞株及び／又はフィトコンプレックス及び／又は抽出物を含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記フィトコンプレックスが、細胞ホモジネートである、請求項１７又は１８に記載の組成物。
  20. クリーム、ゲルクリーム、ゲル、セラム、オイル、エマルジョン、エマルジョンゲル（エマルゲル）、軟膏、点眼薬、マウスウォッシュ、パッチ、スプレー、好ましくは鼻腔用スプレー、スティック、丸薬、カプセル、錠剤、粒状粉、ハードシェルカプセル、口腔内崩壊顆粒、サシェ、ロゼンジ、リポソーム、又は滅菌溶液、エマルジョン若しくは懸濁液として製剤化される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 薬剤としての使用、好ましくは神経変性疾患、例えば、パーキンソン病及びアルツハイマー病の治療及び／又は予防、膠芽腫及び脳虚血の治療及び／又は予防を目的とする、或いは抗炎症剤としての、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 化粧品として、好ましくは皮膚の老化の徴候及び／又は皮膚中のフリーラジカル増加の予防若しくは軽減若しくは対処、或いはしわの予防又は軽減を目的とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  23. 機能性食品として、好ましくは酸化ストレス及び細胞老化の予防又は軽減を目的とする、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分裂組織細胞株、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のフィトコンプレックス及び／若しくは抽出物、又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  24. メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属、好ましくはメリッサ・オフィシナリス（Ｍｅｌｉｓｓａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）種に属する植物由来の植物分裂組織細胞の調製及び選択のプロセスであって、前記細胞は、細胞株の乾燥質量に対して、０．０５％ｗ／ｗ超、好ましくは０．０５％～４０％ｗ／ｗ、より好ましくは０．０８％～３５％ｗ／ｗ、さらに好ましくは３％～２０％ｗ／ｗの量のロスマリン酸、及び２５％～７０％ｗ／ｗの量の多糖を含有し、前記プロセスが、以下：
    １）メリッサ（Ｍｅｌｉｓｓａ）属に属する植物から得られた組織を固体培地に植えるステップ；
    ２）複数の細胞クローンを単離するステップ；
    ３）単離したクローンの各々を液体培地に接種するステップ；
    ４）各クローンについて、前記ロスマリン酸及び多糖含量を測定するステップ；
    ５）最も高いロスマリン酸含量及び多糖含量を有する前記細胞クローンを選択するステップ
    を含み、
    前記固体及び液体培地が、植物細胞の成長に好適な塩、スクロース、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、インドール酢酸（ＩＡＡ）及びキネチンを含有する、プロセス。
  25. 前記固体及び液体培地の双方が、好ましくは以下：ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ及びそれらの組合せから選択される、植物細胞の成長に好適なビタミンを含む、請求項２４に記載のプロセス。
  26. 前記植物細胞の成長に好適な塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する液体増殖培地中で前記株を増殖させた後、前記植物細胞の成長に好適な塩、ビタミン、スクロース、ＮＡＡ、ＩＡＡ及びキネチンを含有する最終液体培地に前記細胞を移すことによる、前記分裂組織細胞株の増殖相を含む、請求項２４又は２５に記載のプロセス。
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