NO334587B1

NO334587B1 - Anvendelse av glycosider av diacylglycerol som anti-inflammatoriske midler.

Info

Publication number: NO334587B1
Application number: NO20042112A
Authority: NO
Inventors: Søren Brøgger Christensen; Erik Larsen; Arsalan Kharazmi; Lars Porskjaer Christensen; Kirsten Brandt
Original assignee: Hs Rigshospitalet; Univ Copenhagen; Univ Aarhus
Priority date: 2001-11-21
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2014-04-14
Also published as: CN100469784C; NO20042112L; EP1453844B1; JP4716655B2; JP2010215660A; CN1606563A; US20030139350A1; PL393941A1; PL213644B1; US20050049205A1; PL370888A1; AU2002366210A8; AU2002366210A1; WO2003043613A2; JP2005513023A; DK1453844T3; WO2003043613A3; EP1453844A2; US7084122B2

Abstract

Glykosider av diacylglyserol, for eksempel 3-ß-D-galaktopyranosyloksyl-2(oktadeka-9Z, 1 2Z, 15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoat (GOPO) (A), som ble isolert fra ekstrakter av nyper ved aktivitetsstyrt fraksjonering, kan anvendes som et oralt antiinflammatorisk middel i behandling av inflammatoriske sykdommer som arteritt og osteoartritt.

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av 3-p-D-galaktopyranosyloksy-2-(oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienyloksy)propanyl oktadeka-9Z-12Z-15Z-trienoat (en bestanddel av nyper (fruktene av Rosa canina L.)) i et standardisert produkt.

Bakgrunn for oppfinnelsen

De anti-inflammatoriske egenskapene av vannekstrakter av nyper er tidligere blitt rapportert (Winter, Rein, and Kharazmi, Inflammopharmacology, (1999) vol 7, pp 63-68)). Ekstrakter av nyper er også kjent å inhibere kjemitaksis og kjemiluminescens av humane perifere blodneutrofiler in vitro, og å redusere visse inflammatoriske parametre in vivo (Kharazmi and Winther, Inflammopharmacology, (1999), vol 7, pp 377-386)).

I US-Patent Nr. 6.024.960 beskrives et nypekonsentrat som har et høyt innhold av vitamin C som er funnet å lindre symptomer assosiert med inflammasjon. Nærmere bestemt ble konsentratet oppnådd i samsvar med en prosess som preserverer et relativt høyt vitamin C-innhold, og likeledes innhold av et antall andre vitaminer. I andre beslektede US-Patenter av søker, Nr 09/694.764, av 23. oktober 2000, beskrives oral administrering av en kombinasjon av nypekonsentrat og fiskeolje som nyttig for å lindre leddsmerter, spesielt i relasjon til artritt. Imidlertid var en mengde av nypekonsentrat beskrevet i hver av disse applikasjoner som nyttige for å oppnå en nyttig effekt, relativt høyt og noe uhensiktsmessig for daglig dosering.

I US-Patent Nr. 5.620.962 og 5.767.095 beskrives et monogalaktosyl-dieikosa-pentaenoyl-glyserol (MGDB-EPA) oppnådd fra marin alge som anti-inflammatoriske egenskaper anvendt i en topikal formulering. Disse patenter beskriver at kun galaktosyl-glyseroler esterifisert med minst én eikosapentaenoisk syreenhet oppviser topikale anti-inflammatoriske egenskaper.

p-D-galaktopyranosylglyseroler esterifisert med en 1:10:10-blanding av myristin, palmitin og palmotoleisk syre ble beskrevet til å ha beskjeden inhiberende aktivitet på superoksid-radikaldannelse (H.Kikuchi, Y.Tsukitani, I.Shimizu, M.Kobayashi, I.Kitagawa: Chem.Pharm.Bull.Vol. 31, pp 552-556 (1983)), men ingen ytterligere undersøkelser av de anti-inflammatoriske egenskaper av

denne blanding av forbindelser og potensielle medisinske bruksområder er blitt utført.

Sammendrag av oppfinnelsen

I søkers pågående forsøk for å konsentrere nyper, har søker overraskende opp-daget at en bestemt bestanddel av nyper er et meget aktivt anti-inflammatorisk middel. Siden nyper som inntas oralt effektivt lindrer inflammatoriske smerter så som smerter assosiert med artritt, er en formulering av det identifiserte anti-inflammatoriske middel antatt å være nyttig for behandling av symptomer assosiert med inflammatoriske sykdommer. Den isolerte substans ble identifisert som galaktolipid 3-p-D-galaktopyranosyl-oksy-2-(oktadeka-9Z,12Z,15Z-trienoyl-oksy)propanyl oktadeka-9Z,12Z,15Z-trienoat (1,2-di-0-a-linolenoyl-3-0-p-D-galaktopyranosyl-glyserol), som vil bli beskrevet ytterligere nedenfor. Overraskende ble det funnet at denne forbindelse potent inhiberte kjemotaksis og likeledes kjemiluminescens av polymorfonukleære leukocytter.

Det er således et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et standadisert produkt som beskrevet i kravene 1-4.

Fig. 1 illustrerer det første trinn i fraksjoneringsprosessen som opprinnelig ble anvendt for å isolere det anti-inflammatoriske middel fra nyper av Rosa canina

L.

Fig. 2 viser et typisk HPLC-kromatogram av et THF-ekstrakt fra tørkede og malte skrall av rosefrukten { Rosa canina L.) oppnådd fra Hyben Vital International ApS. Videre er retensjonstiden av den aktive forbindelse (GOPO) angitt.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Det anti-inflammatoriske middel med formel III kan fremstilles med total eller partiell syntese i samsvar med metodene kjent innen fagfeltet (se f.eks. Nagatsu et al., Biooorg., and Medicinal Chem., 1994, vol 4, pp 1619-1622; Ohta et al., Chem.Pharm., 1991, vol 39, pp 1337-1339; Shibuya et al., Chem.Pharm., 1992, vol 40, pp 1166-1169), eller det anti-inflammatoriske middel kan isoleres fra nyper eller andre vegetabilske kilder. Alternativt kan det anti-inflammatoriske middel foreligge i et planteekstrakt eller materiale, for trinnsvis et planteekstrakt eller materiale anriket eller standardisert mht. det anti-inflammatoriske middel.

Idet det isoleres fra nyper innhøstes nypene på generelt kjent måte idet nypene er fullstendig modne. Nypene fra villrosebusker, så som Rosa canina ("dog rose hip".), Rosa galllica, Rosa condita, Rosa rugosa, Rosa hugonis, Rosa nitida, Rosa pendulina, Rosa pimpinellifolia, og Rosa sericea kan med fordel anvendes. Det anti-inflammatoriske middel oppnås fortrinnsvis ved ekstrasjon fra tørkede og malte nyper gjennom løsemiddelekstrahering, ved anvendelse av organiske- eller uorganiske løsemidler så som heksan, diklormetan, etanol eller vann, selv om andre også kan anvendes. Etter ekstrahering evaporeres det oppnådde ekstrakt til tørrhet, for å gjenvinne en ekstraktfunksjon inneholdende det antiinflammatoriske middel, eller, avhengig av ekstraheringstrinnene det antiinflammatoriske middel oppnås selv som et isolat, som vil bli beskrevet videre nedenfor.

3-p-D-galaktopyranosyloksy-2-(oktadeka-9Z,12Z,15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z,12Z,15Z-trienoat (Formel III) ble isolert fra tørrpulver eller nyperose. Den isolerte forbindelse inhiberte ikke bare potent oksidativ utviklingsrespons, men inhiberte også kjemotaksis av humane leukocytter.

Idet en isolert forbindelse kan anvendes, kan også en anriket eller standardisert planteekstrakt eller standardisert plantemateriale oppnådd i prosessen med fullstendig isolering også være nyttig ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt dersom ekstraktet eller det standardiserte produkt kan oppnås ved lavere kostnad enn de isolerte forbindelser. I tillegg kan andre ingredienser i ekstraktet eller plantematerialet støtte eller forbedre effektene av det anti-inflammatoriske middel, så som vitaminene (noen av disse kan ha anti-oksidativ effekt) som forblir i løsningen etter partiell ekstrahering. Valget mellom om man skal behandle inflammasjon med et anriket eller standardisert ekstrakt eller standardisert plantemateriale eller et isolert eller syntetisk produkt vil sannsynligvis avhenge av graden av den inflammatoriske sykdom. F.eks. vil de som lider av artritt av mindre ulempe, mest sannsynlig betjenes ved administrering av anriket eller standardisert ekstrakt eller standardisert plantemateriale, mens de som er mer alvorlig utsatt vil søke bruk av isolert eller syntetisk forbindelse.

Oppfinnernes observasjon at forbindelsen av formel lll-forbindelsene beskrevet heri inhiberer den oksidative utbruddsrespons og likeledes kjemotaksis gjør det sannsynlig å anta at det er en aktiv bidragsyter til den anti-inflammatoriske effekt av det tørre nypepulver. Således antar oppfinnerne at disse funn gjør det sannsynlig at de anti-inflammatoriske midler beskrevet heri, enten som isolerte forbindelser eller inkludert i anrikede eller standardiserte ekstrakter eller anriket plantemateriale, er egnet som behandling av inflammatoriske tilstander, f.eks. de som er assosiert med artritt.

Det er således et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et standardisert produkt som beskrevet i kravene 1-4.

Formulering

Som angitt ovenfor, kan det anti-inflammatoriske middel anvendes direkte som rene forbindelser eller som en bestanddel av et anriket eller standardisert planteekstrakt, eller et standardisert tørt plantemateriale.

Således kan medikamentet være i formen av et ekstrakt av plantemateriale, typisk et ekstrakt hvor konsentrasjonen av det anti-inflammatoriske middel er kjent i den grad at doseringen gitt til pattedyret kan reguleres.

Uavhengig av form, men spesielt der hvor forbindelsen er i form av en ren forbindelse, er det normalt nødvendig å formulere forbindelsen for å forenkle appliseringen derav til pattedyret i behov derav, og for å sikre hensiktsmessig biotilgjengelighet av forbindelsen.

De anti-inflammatoriske midler formuleres fortrinnsvis i en farmasøytisk akseptabel bærer (eller eksipient), valgfritt i kombinasjon med en anti-oksidant. De kan også kombineres med andre aktive ingredienser for å synergistisere de anti-inflammatoriske effekter, eller for å muliggjøre andre supplerende nyttige effekter for brukeren.

Således kan det anti-inflammatoriske middel eller en anriket, eller en standardisert ekstrakt av et standardisert plantemateriale inneholdende det anti-inflammatoriske middel formuleres alene eller med andre ingredienser, som pulvere, granuler, tabletter, suspensjoner, løsninger, eller emulsjoner og inneholdende ingrediensene kjent innen fagfeltet for å fremstille en slik formulering og innpakkes i enkelt- eller multiple daglige doseringsformer.

Fortrinnsvis omfatter et farmasøytisk materiale (medikament) typisk fra ca. 0,1 til ca. 50 vekt% av det anti-inflammatoriske middel i en farmasøytisk akseptabel bærer, fortrinnsvis i en kombinasjon med en anti-oksidant.

Administrering kan foregå ved oral, bukal, parenteral, topikal, rektal, transdermal eller intranasal administrering, selv om oral administrering er foretrukket.

"Farmasøytisk akseptable bærere" som anvendt i er de media som generelt er akseptable for anvendelse i forbindelse med administreringen til pattedyr, inkluderende mennesker.

Termen «pattedyr» er tiltenkt å inkludere større pattedyr så som mennesker, og likeledes husdyr så som hester, hunder, sauer, griser, kuer, etc. Blant disse pattedyr er mennesket et spesielt interessant individ til å ha nytte av oppfinnelsen.

Farmasøytiske materialer er generelt formulert i samsvar med et antall faktorer som er kjent innenfor fagfeltet for å bestemme, og gjøre rede for, inkluderende uten begrensninger, det bestemte anti-inflammatoriske middel, dets konsentrasjon, stabilitet og tiltenkte biotilgjengelighet; den spesifikke inflammatoriske sykdom, forstyrrelse eller tilstand (samlemessig benevnt «tilstand») som behandles med medikamentet; individet, dets alder, størrelse og generelle tilstand; og sammensetningens tiltenkte administrasjonsrute, f.eks. oral, bukal, parenteral, topikal, rektal, transdermal eller internasal administrering. Typiske farma- søytisk akseptable bærere anvendt i parenteral medikamentadministrering in-kluderer f.eks. DSW, en vandig løsning inneholdende 5 vekt% pr. volum av dekstrose, og fysiologisk saltvann. Farmasøytisk akseptable bærere kan inneholde ytterligere ingredienser, f.eks. de som forsterker stabiliteten av de aktive ingredienser inkludert, så som konserveringsmidler og anti-oksidanter.

I én utførelse omfatter medikamentet en anti-oksidant i kombinasjon med forbindelsen definert heri og den farmasøytisk akseptable bærer. Anti-oksidanten er, f.eks. en anti-oksidant valgt fra vitamin C og derivater derav, vitamin E, flavonoider, fenoliske syrer så som metyl, etyl, eller n-propyl p-hydroksy-benzoat, karotener, butylerte hydroksyanisoler, butylerte hydroksytoluener, nordihydroguaiaretisk syre, etc. Denne utførelse er spesielt relevant hvor det anti-inflammatoriske middel omfatter én eller flere umettede bindinger så som dobbeltbindinger, som kan gjøre forbindelsen utsatt for oksidativ degradering.

Det farmasøytiske materialet kan administreres parenteralt ved injisering, infusjon eller implantering (intravenøst, intramuskulært, intra-artikulært, sub-kutenøst eller lignende) i doseringsformer, formuleringer eller f.eks. egnede avgivelsesanordninger, eller implantater inneholdende konvensjonell, ikke-toksiske farmasøytisk akseptable bærere og adjuvanser.

Formuleringen og fremstilling av slike materialer er godt kjent for fagkyndige innen feltet farmasøytisk formulering. Spesifikke formuleringer kan finnes i Remington: The Science and Practice of Pharmacy by R. Gennaro Alfonso (utgiver), 20. utgave (2000), Lippincott, Williams & Wilkins; ISBN: 0683306472.

Det anti-inflammatoriske middel formuleres typisk i et farmasøytisk akseptabelt vandig medium.

Således kan det farmasøytiske materialet omfatte det anti-inflammatoriske middel i form av en steril injisering. For å fremstille et slikt materiale disperseres hensiktsmessig det anti-inflammatoriske middel i en parenteralt akseptabel væske-vehikkel som konvensjonelt kan omfatte suspenderende, solubili-serende, stabiliserende, pH-justerende midler og/eller disperserende midler. Blant akseptable vehikler som kan benyttes er vann, vann justert til en egnet pH ved tilsetning av en egnet mengde av hydroklorisk syre, natriumhydroksid eller en egnet buffer, 1,3-butanediol, Ringer's løsning og isotonisk natriumkloridløs-ning.

Det anti-inflammatoriske middel kan formuleres for avgivelse via forskjellige ruter av administrering. Oral administrering er foretrukket for å forenkle bruken. En enhetsdosering kan omfatte en terapeutisk effektiv mengde av det anti-inflammatoriske middel for en enkelt daglig dosering (f.eks. oralt eller ved å mate et rør i en enteral-diett), eller formuleres for å tilveiebringe multiple dose-ringer pr. dag. En enhetsdosering vil avhenge av mange faktorer inkluderende alder, tilstand, og sykdomsform, men vil i ethvert tilfelle være slik at en fullstendig daglig dosering er fysiologisk akseptabel for individet og kan administreres daglig over en forlenget tidsperiode.

Idet det fremdeles er til undersøkelse, antas det at en dosering fra 0,001-50 mg/kg kroppsvekt pr. dag, så som 0,005-20 mg/kg kroppsvekt pr. dag (mg/kg/dag), av det anti-inflammatoriske middel vil være effektivt i behandling av den inflammatoriske tilstand, spesielt artritt og osteoartrose, og lindring av symptomer assosiert dermed. En tilsvarende mindre doseringsrate kan administreres på en daglig basis som et profylaktisk middel. En foretrukket enhetsdosering er fra ca. 0,001 til ca. 50, så som 0,001-20 mg/kg/dag. Den totale daglige dosering vil være ca. 0,1 til ca. 5000 mg/dag, så som 0,5-500 mg/dag. F.eks. kan enhetsdoseringen administreres ved sammenstille til tabletter eller kapsler, som hver inneholder fra 0,01-500 mg av 3-p-D-galaktopyranosyloksy-2-(oktadeka9Z, 12Z, 15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoat, hvor brukeren tar fra 1-4 kapsler pr. dag.

Selv om fokus for teksten beskrevet ovenfor er for human terapi, forutsettes det også bruk av det anti-inflammatoriske middel i behandling eller profylakse av ikke-humane pattedyr, inkluderende husdyr som har inflammatoriske tilstander forårsaket f.eks. av artritt. Fagkyndige vil enkelt sikre modus og fremgangsmåte for terapi basert på dyret som skal behandles. F.eks. kan materialet inkorporeres i dyrenes vannkilde eller for-inntak, eller det kan administreres som andre medikamenter, i form av en tablett, kapsel, væske, emulsjon, eller lignende.

Idet det ofte er nødvendig av reguleringsgrunner å standardisere plante-ekstrakter eller materialer anvendt som naturmedisin for mennesker, vedrører et ytterligere aspekt ved foreliggende tekst en fremgangsmåte for å standardisere et naturlig medisinprodukt mht. til én forbindelse av formel I:

hvor R og R' uavhengig er valgt fra hydrogen, Cio-24-alkyl, Cio-24-acyl, hvor nevnte alkyl- og acylgruppe har 0-5 umettede bindinger, og R<1>,R<2>, R3 ogR<4>uavhengig er valgt fra hydrogen- og glykosidenheter, med den forutsetning at ikke begge av R og R' er hydrogen, som er 3-p-D-galaktopy-ranosyloksy-2-(oktadeka-9Z,12Z,15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z,12Z,

15Z-trienoat,

som en aktiv ingrediens, hvor nevnte naturlige medisinprodukt er tiltenkt for behandling, lindring eller profylakse av inflammatoriske tilstander i et pattedyr, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) tilveiebringe en batch av et planteekstrakt eller materiale inneholde forbindelsen

3-p-D-galaktopy-ranosyloksy-2-(oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z,12Z,

15Z-trienoat:

(b) bestemme konsentrasjonen av forbindelsen 3-p-D-galaktopy-ranosyloksy-2-(oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z,12Z, 15Z-trienoat - i nevnte batch; (c) fremstille det naturlige medisinprodukt i form av enhetsdoseringsformer som hver omfatter en forut bestemt mengde av den aktive ingrediens, hvor den forutbestemte mengde av den aktive ingrediens tilveiebringes med en mengde av nevnte batch, hvor nevnte mengde bestemmes som den forutbestemte mengde av den aktive ingrediens delt ved konsentrasjonen av den aktive ingrediens i nevnte batch. Dette aspekt er ytterligere illustrert i Eks. 4 og i kravene 1-4.

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer hvordan det aktive prinsipp av nyper ble isolert fra ekstrakter av nyper ved aktivt å lede fraksjonering og fremgangsmåten anvendt for identifisering av den aktive forbindelse (GOPO). Dette eksempel illustrerer også fremgangsmåter for kvantifiseringen av den aktive forbindelse med analytisk HPLC i f.eks. nypeekstrakter.

Aktivt styrt fraksjonering og identifisering av den aktive forbindelse

Den aktive forbindelse i nyperosefrukter ble bestemt med aktivt styrt fraksjonering. Således ble 1000 g av tørkede og malte frukter sekvensvis ekstrahert med heksan, diklormetan, metanol og vann, og ekstraktene ble evaporert. De resulterende rester ble testet for inhibering av kjemotaksis av humane perifere blodneutrofiler in vitro. Fra disse resultater ble det bestemt at den(de) aktive komponent(er) foreligger i diklormetanekstraktet (Fig. 1). Ekstraktet ble separert i clustere av komponenter av silikagel ved anvendelse av en gradienteluering av diklormetan og metanol (utgangspunkt diklormetan alene, og til slutt med metanol alene) og de individuelle fraksjoner ble testet for inhibering av kjemotaksis av humant perifere blodneutrofiler in vitro. Fra disse resultater ble det konkludert at aktiviteten i disse analyser var i hovedsak, om ikke eksklusivt, begrenset til én enkelt forbindelse. Denne forbindelse ble renset med preparativ HPLC og strukturen identifisert med<1>H-,<13>C-, NOESY-, COSY-og HETCOR-NMReksperimenter til å være 3-p-D-galaktopyranosyloksy-2-(oktadeka-9Z, 12Z, 15Ztrienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoat (GOPO). Den kjemiske struktur ble ytterligere bekreftet med basishydrolyse i metanol (metanolyse) og sur hydrolyse. Basisk hydrolyse ga metyl-linolenat som den eneste metylester som vist med GC-MS-analyse, mens sur hydrolyse ga D-galaktose og glyserol som vist med analytisk HPLC-analyse.

Tabeller 1 og 2 viser NMR-data for den isolerte aktive forbindelse (GOPO). NMR-dataene (CD3OD) av GOPO er fullstendig i samsvar med de funn som blir gjort av Wegner et al. i C. Wegner, M. Hamburger, O. Kunert og E. Haslinger, 2000. Tensioactive Compounds from the Aquatic Plant Ranunculus fluitans L.

(Ranunculaceae). Heiv. Chim. Acta, vol 83, pp 1454-1464 (Ref. 1).

Materialer og metoder

Tørkede og malte frukter fra nyperose ( Rosa canina L.) ble oppnådd fra Hyben Vital International ApS (Tullebølle, Danmark). HPLC-grad-heksan, metanol (CH3OH), acetonitril (CH3CN), diklormetan (CH2CI2) og tetrahydrofuran (THF) ble innkjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Silikagel 60 (0,063-0,200 mm) og analytisk (0,1 mm) silikagel 60 F254-plater (TLC-plater) ble også tilgjengelig fra Merck. Analytiske TLC-plater ble utviklet ved anvendelse av 10% H2SO4i CH3OH etterfulgt av oppvarming.

Ekstraheringsprosedvre

Nyperose-pulver (1000 g) ble neddykket i heksan (2 I) i 24 t, filtrert og pulveret ble vasket med heksan (2 x 500 ml). De kombinerte heksanløsninger ble evaporert til tørrhet under redusert trykk. Pulveret ble deretter neddykket i CH2CI2(2 I) i 241, filtrert og restpulveret vasket med CH2CI2(2 x 500 ml). De kombinerte ChfeCbløsninger ble evaporert til tørrhet under redusert trykk. Pulveret ble deretter neddykket i CH3OH (2 I) i 241, filtrert og pulveret ble vasket med CH2OH (2 x 500 ml). De kombinerte CH3OH-løsninger ble evaporert til tørrhet under redusert trykk. Til slutt ble pulveret neddykket i vann (2 I) i 241, filtrert og pulveret ble vasket med vannn (2 x 500 ml). De kombinerte vannløsninger ble evaporert til tørrhet under redusert trykk (Fig. 1).

Kromatografiske tilstander

Resten fra evaporering fra CH2Cl2-løsningene ble oppløst i 100 ml CH2CI2og løsningen plassert på en silikagelkolonne (500 x 40 ml i.d.) i heksan. Kolonnen ble eluert med en trinnvis gradient (1 I) av CH3OH i CH2CI2(0, 1, 2, 5, 10, 20 og 100% CH3OH). Hver fraksjon (100 ml) ble analysert ved analytisk TLC og, dersom relevant, evaporert til tørrhet under redusert trykk.

Preparative HPLC- tilstander

For preparativ HPLC ble en Merck L-6200 intelligent pump og en Merck L-4200 UV-VIS-detektor anvendt. Separeringer ble utført ved 35°C på en Develosil ODS-HG-5 (RP-18, partikkelstørrelse 5 um; 250 x 20 mm i.d., Nomura Chemical Co., Japan)-kolonne beskyttet med en guard-kolonne (50 x 20 mm i.d.) pakket med det samme materialet som kolonnen, ved anvendelse av følgende gradient: 150 ml 25% CH3CN(aq); 150 ml 50% CH3CN(aq); 150 ml 60% CH3CN(aq); 150 ml 70% CH3CN(aq); 150 ml 80% CH3CN(aq); 150 ml 90% CH3CN(aq) og 300 ml 100% CH3CN. Forbindelsene ble detektert ved 203 nm. Gjennomstrømningsrate: 5 ml/min. Injiseringsvolum: 5 ml.

Analytiske HPLC- tilstander

Analytisk HPLC ble utført på et SUMMIT/Dionex HPLC-system utstyrt med en fotodiode-array-detektor (bølgelengdeområde 195-700 nm). Renheten av de isolerte forbindelser ble bestemt ved 35°C med revers fase analytisk HPLC på en LiChrospher 10o RP-18 (partikkelstørrelse 5 um; 244 x 4 mm i.d., Merck)-kolonne ved anvendelse av følgende gradient: 0-10 min. (100% løsemiddel B); 10-25 min. (100-50% løsemiddel B, 0-50% løsemiddel A); 25-55 min. (50-0% løsemiddel B, 50-100% løsemiddel A); 55-64 min. (100% løsemiddel A); 64-74 min. (100-80% løsemiddel A, 0-20% løsemiddel C); 74-85 min. (80% løse-middel A, 20% løsemiddel C); 85-95 min. (80-100% løsemiddel A, 20-0% løsemiddel C); 95-105 min. (100-0% løsemiddel A, 0-100% løsemiddel B); og 105-110 min. (100% løsemiddel B). Alle forandringer i gradienter programmeres lineært. Løsemiddel A: 100% CH3CH. Løsemiddel B: 20% CH3CN (aq). Løsemiddel C: 100% THF. Forbindelsene ble detektert ved 203 nm. Data-samlingstid: 0-75 min. Punktgjennomstrømningsrate: 1 ml/min"<1>. Injiseringsvolum: 20 ul: Retensjonstid for GOPO: Ca. 54 min. (Fig. 2).

Ut fra disse tester ble det bestemt at en ekstraheringsprosess for å oppnå galaktolipid-materialet omfattende trinnene for å oppnå et plantemateriale så som nyper, tørking og maling av plantematerialet (nypene) for å danne et pulver, behandlet pulveret med et første organisk løsemiddel, hvor galaktolipidet er uløselig, fjerne det organiske løsemiddel for å danne en første rest, som er den galaktolipid-inneholdende fraksjon. Anvendelsen av et innledende organisk løsemiddelekstraheringstrinn fjerner ikke-aktive bestanddeler, for å tilveiebringe en økt konsentrasjon av den aktive ekstraheringsfraksjon. Iso-leringen av galaktolipidet involverer trinnene å behandle den første rest med et organo/klorløsemiddel for å ekstrahere galaktolipidet fra den første rest, og fjerne organo/klorløsemidlet for å precipitere en galaktolipid-rik fraksjon.

Det er også mulig å oppnå en galaktolipid-anti-inflammatorisk-ekstraktfraksjon ved direkte ekstrahering av nypepulveret ved anvendelse av organo/klorløse-midlet, og fjerne organo/klorløsemidlet for å precipitere en galaktolipid-rik fraksjon.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer aktiviteten av den aktive komponent i Eks. 1 i forskjellige cellefunksjonsanalyser.

Biologiske data for GOPO

20 mg/ml GOPO fremstilt i dimetylsulfoksid (DMSO) var tilgjengelig fra prosessen beskrevet ovenfor og fortynnet i minimalt essensielt medium (MEM) til finale konsentrasjoner av 100 ug/ml, 50 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml og 0,1 ug/ml for anvendelse i cellefunksjonsanalyser.

Polymorfonukleære leukocytter

Polymorfe nukleære leukocytter (PMN'er) ble isolert fra perifert blod i friske individer i citrerte glass. Cellene ble separert med dekstrantetthetsgradient og lymfoprep-separering. Renheten av PMNTene var større enn 98%, og celle-levedyktigheten som bestemt med tryptan blå farge-eksklusjon var større enn 98%.

Kjemotaksis

Kjemotaksisanalyse ble utført ved anvendelse av en modifisert Boyden-kammerteknikk som beskrevet i P. Jensen and A. Kharazmi, Computer-assisted image analysis assay of human neutrophil chemotaxis in vitro. J. Immunol. Metnods, 1991, vol 144, pp 43-48. De rensede PMN'er ble preinkubert med forskjellige fortynninger av det ekstraherte galaktolipid i 30 min. ved 37°C. Etter pre-inkubering ble kjemotaksis av cellene mot den kjemotaktiske faktor zymosan-aktivert serum (ZAS), som inneholder den biologisk aktive kjemo-attraktant C5a, testet. De migrerte celler ble talt med et datamaskinassosiert bildeanalysesystem.

Kiemiluminescens

Kjemiluminescens-analyse ble anvendt som et mål på oksygen-radikal-generering av aktiverte PMN'er. Fremgangsmåten ble utført som beskrevet i A. Kharazmi, N. Høiby, G. Doring, and N.H. Valerium. PMN'er ble pre-inkubert ved forskjellige konsentrasjoner av det ekstraherte galaktolipid og ble deretter sti-mulert med opsonisert zymosan. Den oksidative utbruddsrespons av de aktiverte celler ble målt med et luminometer (1250-LKB Wallace).

Resultater

Kjemotaksis

Tabell 3 viser resultatene av aktiviteten av GOPO, (100 u£|/ml og 50 u£j/ml fortynninger) på kjemotaksis av humane perifere polymorfonukleære lymfocytter. Resultatene er vist som antallet celler migrert, og prosent inhibering.

De samme eksperimenter som vist i Tabell 3 ble repetert på en ny batch av den aktive forbindelse (GOPO). Tabell 4 viser resultatene av aktiviteten av GOPO, 100 ug/ml, 10 u£|/ml, 1 ug/ml, og 0,1 ug/ml fortynninger på kjemotaksis av humane perifere blod-polymorfonukleære lymfocytter. Resultatene er vist som antallet celler migrert og % inhibering.

Tabell 5. Viser resultatene av kjemoluminescens av humane perifere blod-polymorfonuklære lymfocytter. Resultatene er vist som millivolt.

Tabell 6. Viser resultatene på cellelevedyktighet. Cellelevedyktighet ble bestemt med en trypan blue dye-exclusion-metode. Cellene ble inkubert med trypan blue. De døde celler vil ta opp fargestoff og fremkomme som blå under mikro-skopet. Resultatene er vist som % levedyktige celler.

Konklusjoner

Som vist i tabeller 3 og 4 inhiberte de isolerte forbindelser (GOPO) ved ganske lave konsentrasjoner migreringen av humane perifere blodleukocytter mot det biologisk aktive kjemo-attraktant zymosan-aktiverte serum, som inneholder C5a.

Som vist i Tabell 5 inhiberte den isolerte forbindelse i ganske lave konsentrasjoner kjemiluminescens av humane perifere blodleukocytter. Kjemiluminescens er et mål på oksidativ utbruddsrespons. Dette indikerer at den isolerte forbindelse oppviser anti-oksidantaktivitet. Idet den aktuelle vevsskade forårsaket av inflammatoriske celler så som PMN'er og monocytter/makrofager, gjennom frigivelse av proteolytiske og hydrolytiske enzymer, og likeledes toksiske reak-tive oksygenradikaler aktivert i vev og ledd, bør den isolerte forbindelse være en potent inhibitor av den oksidative utbrudds-respons av humane perifere blodpolymorfonukleære leukocytter, de viktigste og hyppigst forekommende inflammatoriske celler.

Som vist i Tabell 6 var cellene levedyktige i konsentrasjoner av forbindelsen, som inhiberte kjemotaksis og kjemiluminescens, noe som indikerer at inhibe-ringen av cellemigrering og oksidativ burst ikke skyldes toksisitet. Med andre ord synes den aktive forbindelse ikke å være toksisk i de testede konsentrasjoner.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer konsentrasjonen (mg/kg) av den aktive komponent i eks. 1 og 2 i et kommersielt nypeprodukt.

Analyse av kommersielle produkter av nyperose for GOPO med analytisk HPLC Den analytiske HPLC-metode beskrevet under seksjon «Analytical HPLC conditions» ble validert mht. spesifisitet, reproduserbarhet, mellom-presisjon, nøyaktighet, linearitet, område og robusthet i henhold til ICH-retningslinjer fra European Commission (Volume 3 A Guidelines; Medicinal products for human use; Quality and biotechnology 1998 Edition) og ble anvendt for å kvantifisere GOPO i kommersielt tilgjengelige produkter av nyperose. I Tabell 7 er resultatene fra analyser av 10 kommersielle nyperose-produkter for GOPO vist.

Eksempel 4

Anvendelse av oppfinnelsen for å fremstille et standardisert preparat.

I samsvar med retningslinjene utgitt av the Danish Medicines Agency (Lægemiddelstyrelsen), må en naturmedisin standardiseres, til å inneholde en spesifisert mengde av en forbindelse som er spesifikk for planten eller dyre-substansen som den er fremstilt fra. Dersom en forbindelse eksisterer som gjenkjennes til å være ansvarlig for den kliniske effekt av medikamentet, defi-neres den som den aktive forbindelse og må anvendes for standardiseringen. Dersom ingen aktiv forbindelse er kjent, kan produsenten velge en annen karakteristisk forbindelse som markørforbindelsen for standardisering. Siden foreliggende oppfinnelse indikerer at GOPO er den aktive forbindelse i nype-preparatene som kan I indre smerte pga. artritt, må denne anvendes for standardisering av alle nypepreparater som registreres som naturmedisin. Tilsvarende reguleringer for registrering av standardiserte preparater av urte-produkter etc. eksisterer i andre land.

Dersom et produkt er standardisert i samsvar med en forbindelse så som GOPO, betyr dette at hver enhet, f.eks. tablett eller kapsel, inneholder til-strekkelig plantemateriale for å tilveiebringe en definert mengde av GOPO. Dersom f.eks. enhetsdoseringen er definert som 0,1 mg, og konsentrasjonen i produktet måles til 303 mg/kg, som beskrevet i Eks. 3, Tabell 7, må hver enhet fremstilt fra denne batch av materialet inneholde 0,330 g av råproduktet.

Av praktiske grunner, heller enn å justere mengden av materialet anvendt i hver

tablett eller kapsel, fortynnes råproduktet så mye som nødvendig for å oppnå den ønskede konsentrasjon, og deretter anvendes en fast mengde av det for-tynnede produkt for hver tablett eller kapsel. F.eks., for å fremstille kapsler med et innhold på 500 mg materiale og en enhetsdosering på 0,1 mg GOPO fra en batch av plantemateriale inneholdende 303 mg/kg, må det fortynnes til en konsentrasjon av 200 mg/kg. Dette kan utføres ved å tilsette til råproduktet en mengde av kalkpulver eller andre inerte materialer korresponderende til 51,1% av vekten av råproduktet. Da vil hver kapsel som inneholder 500 mg fortynnet materiale også innehold 0,1 mg GOPO, og dermed møte kravene for et standardisert produkt.

Alternativt kan en høykvalitets-batch, f.eks. én som inneholder 303 mg/kg som ovenfor, blandes med en batch av lavere kvalitet, f.eks. én som inneholder 75,8 mg/kg.

I tilfelle vil blandingen inneholde 54,6% av høykvalitets-batch/en, som gir 165,6 mg GOPO/kg, og 45,4% av lavkvalitets-batcl<Y>en, som gir 34,4 mg/kg, for å oppnå en total av den ønskede standardiserte konsentrasjon av 200 mg/kg.

I ethvert tilfelle, idet den aktive forbindelse anvendes for standardisering, må standardiseringskonsentrasjonen velges slik at det finale produkt inneholder en lavere konsentrasjon av aktiv forbindelse, enn den beste del av råmaterialene. Det generelle prinsipp beskrevet her er nyttig til enhver annen type forbindelse beskrevet i teksten, og som foreligger i ethvert kildemateriale.

Claims

1. Et standardisert produkt,karakterisert vedat det er basert på nypemateriale omfattende en forhåndsbestemt mengde av en aktive ingrediens ifølge formel (III):

er 3-P-D-galaktopyranosyloksyl-2-(oktadeka-9Z, 12Z, 15Z-trienoyloksy)propanyl oktadeka-9Z, 12Z, 1 SZtrienoat.

2. Produkt ifølge et av krav 1,karakterisert vedat produktet er preparert i form av enhetsdoseringsformer som hver omfatter en forhåndsbestemt mengde aktiv ingrediens, hvori den forhåndsbestemte mengden aktiv ingrediens er frembrakt av en mengde av den nevnte blandeporsjon, hvis mengde er bestemt som den forhåndsbestemte mengden aktiv ingrediens delt på konsentrasjonen av den aktive ingrediensen i den nevnte blandeporsjonen.

3. Produkt ifølge et av krav 1-2,karakterisert vedat den aktive ingrediensen er frembrakt i en forhåndsbestemt dosering på 0,01-500 mg.

4. Produkt ifølge et av krav 1-3,karakterisert vedat den aktive ingrediensen er frembrakt i en forhåndsbestemt dosering på 0,001-50 mg/kg kroppsvekt.