TWI558403B - 富含半乳糖脂之植物萃取物及其用途 - Google Patents

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Description

富含半乳糖脂之植物萃取物及其用途
本發明係關於一種半乳糖脂之植物萃取物，特別是指一種自昭和草、白鳳菜或大苞水竹葉萃取獲得之植物萃取物。本發明亦關於該植物萃取物用於製造預防或治療猛爆性肝炎、敗血症及其相關適應症之醫藥組合物以及美白劑之用途。
近年來，研究顯示許多源自植物之天然成分(植物性化合物)具有各式療效，以下以昭和草、白鳳菜以及大苞水竹葉等三種台灣常見植物進行介紹。
昭和草(Crassocephalum rabens S.Moore，簡稱CR)係台灣常見的一種野菜，繁殖力及適應力驚入。昭和草屬菊科(Asteraceae)昭和草屬，味道有如茼蒿，全年皆可採集，尤其未開花之前採摘味道鮮美。目前已知藥用上的功效為解熱，健胃，消腫，治腹痛。
白鳳菜(Gynura divaricata subsp.Formosana,，簡稱GD)又名白紅菜，是菊科(Asteraceae)菊三七草屬(Gynura)的藥用植物，為臺灣特有種植物，分布在臺灣濱海地區，偶見於低海拔山區。白鳳菜的嫩莖葉是可以食用的，宣稱有消炎、解熱、解毒、利尿、降血壓等功 效。
大苞水竹葉(Murdannia bracteata(C.B.Clarke)J.K.Morton ex D.Y.Hong，簡稱MB)為鴨跖草科(Commelinaceae)水竹葉屬的多年生草本植物，多生長在山谷溪邊、山穀水邊及沙地上。大苞水竹葉具有藥用價值，常用於化痰、治療痔瘡、頸部淋巴結的慢性感染疾病和毛囊、皮脂腺或汗腺的急性化膿性感染疾病。
然而，目前研究對於上開三種植物中之活性成分及其作用機制的瞭解仍然有限，且並無任何文獻資料或專利前案曾經揭示，可以從上開三種植物得到具有治療或預防肝炎、敗血症等適應症、並具美白功效的萃取產物或經純化的化合物。
另一方面，大量存在於自然界之半乳糖脂為所謂的糖甘油脂(glycoglycerolipid)，其結構為甘油的sn-1及sn-2位置分別酯化有兩個脂肪酸，而sn-3位置則連接一至四個半乳糖。已知許多天然或合成之糖甘油脂具有特定生物活性，包括抗病毒、抗腫瘤、抗發炎及抑制免疫等活性。然而，此類化合物對其他適應症的功效及生物活性之分子機制尚未明瞭。
鑑於上述先前技術的不足，本發明之一目的為提供一種富含半乳糖脂之植物萃取物，該植物萃取物係將一植物樣品以水或一低級醇類萃取，再以一低級酯類分配萃取以得一低級酯類萃取物，並進一步以一醇類沖提液沖提該低級 酯類萃取物，以得一富含半乳糖脂之溶份，其中該植物樣品係選自於由：白鳳菜、大苞水竹葉及昭和草所組成之群組，且醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為5%~20%。
於一實施樣態中，低級醇類可為甲醇或乙醇。
於一實施樣態中，低級酯類可為乙酸乙酯。
於一實施樣態中，上述之植物萃取物可進一步包含一中的植物萃取物圖譜，例如：值物萃取物自白鳳菜萃得時，可進一步包含一白鳳菜化學指紋圖譜。而自大苞水竹葉萃得時，亦可進一步包含一大苞水竹葉化學指紋圖譜。
於一具體實施樣態中，該醇類沖提液中醇類佔比例約為5%~15%，於另一具體實施樣態中，該醇類沖提液中醇類佔比例約為5%~10%。於又一具體實施樣態中，用於昭和草的醇類沖提液中醇類佔比例可約為10~15%。
於一實施樣態中，醇類沖提液可包含：甲醇和二氯甲烷、甲醇和水、甲醇和乙氰或甲醇和丙酮。
於一具體實施樣態中，甲醇沖提液中二氯甲烷和甲醇之比例為9：1。前述比例之甲醇沖提液可用於沖提，例如：自白鳳菜而得的一低級酯類萃取物。
於一具體實施樣態中，甲醇沖提液中二氯甲烷和甲醇之比例為12：1。前述比例之甲醇沖提液可用於沖提，例如：自大苞水竹葉而得的一低級酯類萃取物。
於一實施樣態中，富含半乳糖脂之溶份可進一步以一逆向高效液相層析法(Reversed phase HPLC)加以純化，以得一生物活性溶份。
於一實施樣態中，該生物溶份可包含，但不限於，如第3圖所示之一昭和草高效液相層析圖譜。
於一實施樣態中，該富含半乳糖脂之溶份可以一醇類沖提液沖提，以得該生物活性溶份，其中該醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為100%~70%。
於一實施樣態中，該富含半乳糖脂之溶份可為一包含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)、1-油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-oleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-亞麻油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-linoleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1,2-二-硬脂四烯醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2-di-stearidonoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)或其組合之溶份。
於一實施樣態中，該富含半乳糖脂之溶份可為一 富含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,-Di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)之溶份。
本發明之另一目的在於提供一種用於預防或治療猛爆性肝炎之醫藥、保健或營養添加用之組合物，包含：預防或治療上有效量之一生物活性成分，其係為上述之植物萃取物或其純化物；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑。
於一實施樣態中，純化物可為dLGG。
本發明之又一目的在於提供一種用於預防或治療敗血症及其相關適應症之醫藥、保健或營養添加用之組合物，包含：預防或治療上有效量之一生物活性成分，其係為上述之植物萃取物或其純化物；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑。
於一實施樣態中，純化物可為dLGG。
於一實施樣態中，相關適應症可為敗血症誘發之急性腎損傷，但不僅限於此。
本發明之再一目的在於提供一種用於美白之組合物，包含：有效量之一生物活性成分，其係為上述之植物萃取物或其純化物；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑。
於一實施樣態中，純化物可為dLGG。
第1圖顯示白鳳菜中富含半乳糖脂溶份(GDE)的化學指紋圖譜。dLGG經測定為該溶份的主成分，其中：
(A)係生物活性溶份GDE的總離子層析圖。
(B)係溶份GDE中五種主要單半乳糖苷二醯基甘油化合物的APCI-MS數據，其顯現出對應於二醯基甘油、單醯基甘油及脂肪酸基團之Na+加合物([M+Na]+)及離子片段的m/z。(C)GDE中單半乳糖苷二醯基甘油成分(1-5)的化學結構。
第2圖顯示大苞水竹葉中富含半乳糖脂溶份(MBE)的化學指紋圖譜。dLGG經測定為該溶份的主成分，其中：
(A)係生物活性溶份MBE的總離子層析圖。
(B)係溶份MBE中五種主要單半乳糖苷二醯基甘油化合物的APCI-MS數據，其顯現出對應於二醯基甘油、單醯基甘油及脂肪酸基團之Na+加合物([M+Na]+)及離子片段的m/z。
(C)係顯示MBE中單半乳糖苷二醯基甘油成分(1-7)的化學結構。
第3圖顯示昭和草的乙酸乙酯溶份(CR-EA)的高效液相層析圖譜(HPLC)。
第4圖顯示大苞水竹葉(MBE)以及白鳳菜(GDE)萃得的富含dLGG半乳糖脂溶份，對於由LPS/D-GalN誘發小鼠之肝損傷及急性猛爆性肝炎的功效數據。實驗證實大苞水竹葉(MBE)以及白鳳菜(GDE)萃得的富含dLGG半乳糖脂溶份對減緩由LPS/D-GalN誘發小鼠的肝損傷及急性猛爆性肝炎是 有效的，其中：
(A)顯示在由左至右分別為：載劑(vehicle，以全-號表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠(以LPS/D-GalN+表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠以保肝藥SM治療(LPS/D-GalN+、Post-SM+表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠以植物萃取物MBE治療(LPS/D-GalN+、Post-MBE+表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠以植物萃取物GDE治療(LPS/D-GalN+、Post-GDE+表示)等組別中，丙肢酸轉胺脢(alanine aminotransferase,ALT)在血清中的含量。以每治療組別6隻小鼠的試驗結果的平均值±標準差呈現數據。不同字母呈現受試組別的顯著差異(P<0.05)。圖示中+號代表有施予某特定藥物，-號代表某未施予特定藥物。
(B)顯示健康小鼠與未治療或經治療小鼠的肝臟切片之H&E染色及組織結構圖式與結果。
第5圖顯示dLGG作為治療劑對LPS/D-GalN誘發小鼠之急性猛爆性肝炎的效果，其中：
(A)顯示由左至右分別為：在載劑(vehicle，以全-號表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠(以LPS/D-GalN+表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠以SM治療(LPS/D-GalN+、Post-SM+表示)、經LPS/D-GalN刺激的小鼠以dLGG治療(LPS/D-GalN+、Post-dLGG+表示)等各組別中，在血清中天門冬酸轉胺脢(aspartate aminotransferase,AST)及ALT的含量。以每治療組別6隻小鼠的試驗結果的平均值±標準差呈現 數據。不同字母呈現受試組別的顯著差異(P<0.05)。
(B)顯示健康小鼠與未治療或經治療小鼠的肝臟切片之H&E染色及組織學結果。
(C)顯示肝組織的凋亡細胞(TUNEL)測試結果。係呈現健康，損傷以及個自治療組別的代表影像。呈現褐色的細胞為TUNEL陽性的凋亡細胞。
第6圖顯示CR-EA、dLGG以及辛維司汀(simvastatin,simva)，對LPS誘發小鼠之發炎現象以及敗血症的預防以及治療效果。在不同治療組別中，血清中IL-6(A)及TNF-α(B)的含量。以平均值±標準差呈現(n=4)數據。不同字母顯示不同組間的顯著差異(P<0.05,ANOVA)。(C)顯示肝臟切片之巨噬細胞(F4/80)免疫組織學法染色結果，呈現巨噬細胞的浸潤現象。由測定F4/80陽性細胞的平均強度以作為治療與未治療組別間的量化比較。此圖係呈現代表影像。
第7圖顯示CR-EA、dLGG以及辛維司汀(simvastatin,simva)，對LPS誘發小鼠之發炎現象以及敗血症的預防以及治療效果。在不同治療組別中，AST(A)and ALT(B)在血清中的含量，以平均值±標準差呈現(n=4)數據。不同字母顯示不同組間的顯著差異(P<0.05,ANOVA)。(C)係顯示經H&E-染色的肝臟切片，其呈現正常小鼠與LPS刺激小鼠的不同治療組別中的肝臟組織形態學結果以及紅血球與發炎細胞浸潤現象。此圖係呈現代表影像。
第8圖顯示CR-EA、dLGG以及辛維司汀(simvastatin,simva)，對LPS誘發小鼠之發炎現象以及敗血症的預防以及 治療效果，其中：
(A)顯示經H&E-染色的腎臟切片，其呈現在正常或經LPS刺激小鼠的不同治療組別中的腎臟組織學結果。
(B)顯示腎臟切片之巨噬細胞(F4/80)免疫組織學法染色結果，其呈現巨噬細胞的腎臟浸潤現象。由測定F4/80陽性細胞的平均強度以作為治療與未治療組別間的量化比較。此圖係呈現代表影像。
第9圖顯示CR-EA、dLGG以及辛維司汀(simvastatin,simva)，對LPS造成幾種肝臟組織之蛋白質過度表現有減緩的作用。這些蛋白質係參與誘發缺氧以及產生發炎與敗血症相關脂質介質有關，其中：
(A)顯示LPS造成之HIF-1α(缺氧誘發因子-1α,hypoxia inducible factor-1α)增加表現量可因CR-EA、dLGG以及控制組藥物simva的處理治療而減緩。
(B)證實由CR-EA、dLGG及simva治療而降低PPAR-δ表現量。HIF-1α以及PPAR-δ表現量的平均強度圖示，作為治療組別間的量化比較。
第10圖顯示昭和草EA溶份或由其分離的單一化合物dLGG之去色素效果，其中：
(A)顯示以50μg/mL的麴酸(KA)、源自全沸水粗萃取物(CR-W-EA)或全乙醇粗萃取物(CR-Et-EA)之EA溶份各25μg/mL或50μg/mL處理B16黑色素瘤細胞72h後外觀顏色比較圖。
(B)顯示以45μM dLGG處理B16黑色素瘤細胞12-48h, 並比較去色效果。
(C)顯示西方墨點法分析以載劑(控制組)或45μM dLGG處理後與黑色素生成相關蛋白小眼症相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)以及酪胺酸酶在B16細胞中之表現。
本文中所用之「有效量、預防上有效量及/或治療上有效量」乙詞係指欲產生所求特定效果、預防及/或治療效果所需活性成分(萃取物或化合物)之量(以其在組合物中所佔重量百分比表示)。於本發明所屬技術領域中具有通常知識者當瞭解，該有效量可能因欲引起特定效果、預防及/或治療之疾病種類及投藥方式等因素而有所不同。一般而言，活性成分在組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳為約30%至約100%。
本文中所用之「醫藥、保健或食品上可接受之載劑」乙詞包含任何標準之醫藥、保健或食品載劑。所謂之載劑可為固態或液態，取決於醫藥、營養添加或保健組合物所需之劑型。固態載劑之實例包括乳糖、蔗糖、明膠及瓊脂。液態載劑之實例包括生理鹽水、緩衝生理鹽水、水、甘油及乙醇。
本文中所用之「純化物」乙詞包含將一原料或粗產物(例如：本案的植物萃取物)進行任何純化步驟純化的一經純化產物。
本發明之實施樣態依下列例子詳細描述，但不限 於此。本發明之上述及其他目的、特徵及優點將因以下敘述及後附圖式而變得更加清楚。
一、材料及方法
1.試劑與抗體
自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)購得D-半乳糖胺N(D-galactosamine N，簡稱D-GalN)、脂多醣(lipopolysaccharide，簡稱LPS)、水飛薊素(silymarin)、辛維司汀(simvastatin)、麴酸(kojic acid，簡稱KA)以及二甲亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)。使用預染的蛋白質標準液(Bioman,Taipei,Taiwan)評估SDS-PAGE的分子量標準液。本發明的實施例中亦使用抗酪胺酸酶、黑色素生成相關蛋白小眼症相關轉錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor,MITF)(Santa Cruz Biotechnology)之初級抗體以及F4/80抗體(eBioscience)。重組小鼠的TNF-α以及用於小鼠TNF-α及IL-6 ELISA套組來自R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN)。使用購自Randox Laboratories(UK)的商業套組測定血清中的天門冬酸轉胺脢(aspartate aminotransferase,AST)以及丙胺酸轉胺脢(alanine aminotransferase,ALT)之活性。所有其他化學物以及溶劑皆為試驗級或高效液相層析使用等級。
2.細胞培養
B16黑色素瘤細胞株係得自美國菌種保存中心(ATCC,Manassas,VA)，並生長於RPMI 1640培養基(Gibco/BRL)，其添加有10%經熱去活化之胎牛血清、100 單位/mL盤尼西林、及100μg/mL鏈黴素，該細胞株培養於37℃下，濕度5%之CO2培養箱中。
3.去色測試
將B16黑色素瘤細胞以1×105細胞/孔之初始密度接種於10cm培養盤中，並在與上述細胞培養相同的條件下培養。接種12h後，以載劑DMSO、麴酸(KA)、CR的水萃及乙醇粗萃取物的乙酸乙酯(EA)溶份(Hou et al.,2007)處理細胞72小時後以離心方式收取細胞，並目視評估所收集細胞的顏色。在另一組實驗中，單一化合物dLGG的去色素效果以相同程序處理細胞但在不同時間點觀察與評估。
4.動物
雌性C57BL/6J小鼠或雌性1CR小鼠(4週大)係由國家實驗動物中心(台北，台灣)所提供。將動物飼養於12小時光/暗週期，22±2℃下，並以標準實驗用飼料及蒸餾水任其自由進食。本發明之實施例係依據機構制定的操作指南進行，並經台灣中研院的實驗動物照護及使用委員會批准。
5.植物萃取物與dLGG之製備
依據Hou et al(2007)(Cancer Research 67,6907-6915)所公開的操作方法稍加修改，以製備昭和草(CR)、大苞水竹葉(MB)以及白鳳菜(GD)的萃取物。於室溫下以2-4倍重量比的95%乙醇萃取約5.0公斤之新鮮全草。使用乙酸乙酯分配(partitioned)全乙醇粗萃取物(Total ethanolic extract)，產生乙酸乙酯(EA)溶份(GD：8.6kg； MB：8.9kg)。進一步使用以二氯甲烷-甲醇沖提(沖提比例：白鳳菜之甲醇/二氯甲烷為1/9；大苞水竹葉之甲醇/二氯甲烷為1/12；昭和草之甲醇/二氯甲烷為1/9)、的矽膠管柱分離GD及MB的EA溶份，個別產生10組次溶份(subfractions)。對於GD，經測試篩選後係使用以95%乙醇沖提的Diaion HP-20凝膠管柱進一步純化次組份7(817g)，得到一富含單半乳糖苷二醯基甘油之溶份(稱為GDE，253.3g)。對於MB，經測試篩選後，係使用以95%乙醇沖提的Diaion HP-20凝膠管柱進一步純化次組份6(1.06kg)(稱為MBE，360.1g)。
使用RP-HPLC/APCI-M測定上述富含溶份的化學指紋圖譜。使用Bruker ADVANCE 500 AV NMR光譜儀進行1H及13C核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)，並使用ThermoFinnigan/LCQ Advantage(Waltham)質譜儀在陽離子模式下進行大氣壓化學電離質譜分析(APCI/MS)，來進行化合物結構之確認。
接著，以下列管柱與沖提條件進行逆相HPLC(RP-HPLC)得到昭和草乙酸乙酯溶份(CR-EA)及其化學圖譜：RP-HPLC半製備型管柱(Phenomenex 5μm,C18,250 x 4.6mm)、以98%甲醇、1mL/min流速進行等位沖提(isocratic elution)。在HPLC圖譜呈現的dLGG係作為生物活性EA溶份中的指標化合物。
GDE或MBE的富含半乳糖脂溶份可進一步使用相同操作程序得到GDE或MBE的HPLC圖譜(以二氯甲烷-甲醇沖提液進行沖提，其中甲醇/二氯甲烷之比例約為9/1至 8/2。)
6.測試dLGG或含dLGG之植物萃取物對LPS/D-GalN誘發小鼠急性猛爆性肝炎的保護效果
觀察在LPS/D-GalN誘發的猛爆性肝炎中，自昭和草分離的化合物dLGG之活體內保肝效果，並與保肝藥水飛薊素(SM)比較。將小鼠任意分為4組(每組n=6)以進行下列試驗：載劑；LPS/D-GalN；50mg/kg水飛薊素(Post-SM50)；以及10mg/kg dLGG(post-dLGG10)，全部以腹腔注射(intraperitoneally,i.p.)方式進行。在小鼠經前述的500ng LPS及含25mg D-GalN的250μL食鹽水處理1小時後(Huang et al.,2012)，施予dLGG及水飛薊素。此外，另兩組小鼠動物，則在LPS/D-GalN刺激之前，先以dLGG或SM進行處理連續3天，每天注射一次劑量，以測試dLGG對LPS/D-GalN誘發的猛爆性肝炎之預防效果。LPS/D-GalN注射後8h，以眼窩採血技術(retro-orbital bleeding)收集血液樣品，接著犧牲所有小鼠，收集血液樣品與肝組織。
7.測試dLGG或含dLGG之植物萃取物對以LPS誘發小鼠敗血症的保護或治療效果
藉由誘發急性發炎以及使用LPS的敗血性休克來評估dLGG或含dLGG的昭和草萃取物之療效，並使用辛維司汀(simvastatin,Simva)作為正控制組。將小鼠任意分成不同的處理組別：載劑；10mg/kg LPS；10mg/kg辛維司汀(Simva 10)；10mg/kg昭和草EA萃取物(CR-EA 10)；50mg/kg昭和草EA extract(CR-EA 50)；5mg/kg dLGG(dLGG 5)；25mg/kg dLGG(dLGG 25)。植物成分或控制組藥物均在施予LPS一小時前注射處理。另一組動物係單獨以25mg/kg dLGG處理(dLGG 25 only)。在LPS注射24h後犧牲所有組別。在犧牲前立即以眼窩採血技術(retro-orbital bleeding)收集血液樣品。並立即收集器官組織。
8.組織學及免疫組織化學法
於10%福馬林緩衝液中將肝臟、肺臟及腎臟組織固定，接著將其包埋於石蠟中。經石蠟包埋的樣品經切片(8-μm)並經蘇木紫-伊紅(hematoxylin & eosin，簡稱H&E)染色。此外，加熱固定經石蠟包埋的肝臟與肺臟切片(4-μm厚)，並使用二甲苯去石蠟及乙醇再水合處理，再以蒸餾水加以清洗。最後浸泡於含目標抗原修復液的Decloaking Chamber(Biocare Medical)中修復抗原。
原位(in situ)偵測凋亡細胞的方法係依據供應商的操作程序(Chemicon)進行，原理是利用末端脫氧核苷酸轉移酶作用於核甘酸序列，造成在脫氧尿苷三磷酸位置形成切口並進行末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)。最後使用AxioVision軟體(Carl Zeiss MicroImaging,Inc.)來分析有標記上的TUNEL-陽性細胞的數目。
肝臟、肺臟及腎臟組織的免疫組織化學染色步驟係將樣品置放於含F4/80初級抗體溶液中過夜。接著清洗後，使用標示螢光之二級抗體反應液中進行樣品組織。巨噬細胞浸潤現象(陽性F4/80染色細胞)則使用AxioVision軟體(Carl Zeiss MicroImaging,Inc.)擷取螢光影像與分析。
9.西方墨點法
各小鼠肝組織(0.1g)，加入適量玻璃珠，以均質機(MM301,Retsch,Haan,Germany)將其均質化2分鐘，添加0.4mL的胞溶緩衝液萃取，並在4℃以15,000×g離心30分(Shyur et al.,2008)。收集上清液，樣品蛋白質總量之濃度係以DC蛋白質測試套組(Bio-Rad)加以測定。蛋白質利用5%-20%梯度SDS-PAGE電泳分離之後，進行電泳轉漬，轉漬膜再以抗特定蛋白質的單株抗體進行免疫染色，最後以增強化學螢光試劑(ECL,Amersham)呈色。
細胞蛋白質是參照前人發表的方法(Chiang et al.,2005)製備。以Bradford法(Bio-Rad)測量蛋白質含量。
10.血清中AST及ALT活性的測量
受試小鼠的血液樣品在4℃以1,400×g離心15分，分離血清。使用購自Randox Laboratories(UK)的商業套組測定血清中的天門冬酸轉胺脢(aspartate aminotransferase,AST)以及丙胺酸轉胺脢(alanine aminotransferase,ALT)之活性。
11.血清中IL-6及TNF-α活性的測量
使用購自eBioscience的商業套組測定小鼠血清的介白素(interleukin,IL-6)以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)含量。
12.統計學分析
所有數據以平均值±標準差表示。以ANOVA比 較差異。不同字母顯示處理組間的差異；P<0.05即被認為在統計學上具有顯著性。
二、結果
白鳳菜、大苞水竹葉、昭和草等三種食用或藥用植物的化學指紋圖譜
使用RP-HPLC/大氣壓化學電離質譜儀(atmospheric chemical ionization-mass spectrometry,ACPI-MS)建立生物活性溶份(GDE及MBE)的化學指紋圖譜，並鑑定存於GDE及MBE的富含半乳糖脂溶份的所有單半乳糖苷二醯基甘油成分。1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galacto pyranosyl-sn-glycerol,dLGG)經鑑定為白鳳菜(參見第1圖)、大苞水竹葉(第2圖)之主要成分。昭和草乙酸乙酯溶份(CR-EA)的化學圖譜(第3圖)係以逆相HPLC(RP-HPLC)得到，在HPLC圖譜呈現的dLGG係作為昭和草具生物活性EA溶份(CR-EA)中的指標化合物。
第1圖A及第2圖A分別顯示在GDE及MBE之總離子層析圖(total ion chromatogram)中的化合物峰值分布。發現具脂肪酸基團的GDE有五種半乳糖脂，辨識出其結構組成為18：3/18：3(3)(dLGG)、18：4/18：4(1)、18：4/18：3(2)、18：2/18：3(4)、16：0/18：3(5)。同時，MBE中七種半乳糖脂化合物的脂肪酸基團，辨識出其結構組成為18：3/18：3(dLGG)、18：4/18：4(1)、18：4/18：3(2)、18：2/18：3(4)、16：0/18：3(5)、18：1/18：3(6)以及16：0/18：2(7)。並未進一步確認於化合物2、 4、5、6及7的2個脂肪酸基團的sn位置。
第1圖B及第2圖B係表列顯示ACPI-MS中對應於二醯基甘油、單醯基甘油及脂肪酸基團之Na+加合物([M+Na]+)及離子片段的m/z，而第1圖C及第2圖C係分別顯示GDE及MBE溶份中單半乳糖苷二醯基甘油的化學結構。主要且具活性的成份化合物dLGG的含量分別為：88.1%(白鳳菜)以及78.9%(大苞水竹葉)。經測定發現昭和草的生物活性溶份中dLGG含量為65.7%(Hou et al.,2007)。以dLGG作為本發明中自三種醫藥用植物萃得之富含半乳糖脂溶份的指標化合物所發展出的化學指紋圖譜方法，可用以確保批次製備上開生物活性溶份的一致性，並可用於作為例行品質確保的操作程序。
2. dLGG作為對以LPS/D-GalN誘發小鼠之急性猛爆性肝炎的治療劑
猛爆性肝衰竭(Fulminant hepatic failure,FHF)為急性肝衰竭的同義詞，係與導致肝功能的快速病變的肝疾病有關，通常會造成毀壞性的後果(Sass and Shakil,2005)。此為會威脅到生命的一種疾病，迄今原位肝臟移植為唯一的治療方法(Russo & Parola,2011)。
LPS/D-GalN誘發小鼠產生急性猛爆性肝炎隻動物模式，可有效模擬在臨床上觀察到之FHF階段式之病理反應，因此廣泛被使用於相關研究(Kosai et al,1999)。本發明以此模式評估dLGG(一種自昭和草、白鳳菜以及大苞水竹葉分離的生物活性成分)以及富含dLGG的半乳糖脂溶份GDE及 MBE在肝損傷上的療效。
與此同時，使用一自市面購得的保肝藥水飛薊素(silymarin,SM)作為對照組。小鼠在注射LPS/D-GalN一小時之後，以腹腔注射(i.p.)方式施予載劑控制組0.5%DMSO、dLGG(10mg/kg)及SM(50mg/kg)。收集不同組別的小鼠血清以測量天門冬酸轉胺脢(aspartate aminotransferase,AST)以及丙胺酸轉胺脢(alanine aminotransferase,ALT)，兩種肝損傷或功能異常的臨床指標之活性。
如第4圖與第5圖所示，係顯示自富含半乳糖脂溶份GDE、MBE以及純化合物dLGG之活性的評估結果。第4圖A顯示GDE、MBE與保肝藥SM可有效降低LPS/D-GalN-刺激小鼠所增加兩倍的血清中ALT含量，至恢復正常值。
如第4圖B所示，以H&E染色進行的組織病理學檢驗的呈現結果，可觀察到因LPS/D-GalN-刺激小鼠中有發炎細胞進入肝小葉的浸潤、組織破壞及肝組織中的紅血球內流(erythrocyte influx)等現象，在處理組中顯著地減少。
如第5圖A所示，在誘發猛爆性肝炎後，以dLGG處哩，可如同保肝藥SM的效果，可明顯抑制(~2.4倍)小鼠體內因LPS/D-GalN所誘發的血清中AST、ALT之增加量。此外，第5圖B所示，LPS/D-GalN刺激小鼠後之肝臟，相較於載劑控制組，呈現發炎細胞進入肝小葉的浸潤、組織破壞及肝組織中的紅血球內流(erythrocyte influx)等現象，該些現象係藉由dLGG及SM兩種治療方式而減緩。而且，dLGG治療亦顯著降低經LPS/D-GalN造成小鼠肝組織中凋亡細胞 (TUNEL陽性染色之細胞)的數量。
除此之外，在小鼠預處理dLGG(1或10mg/kg)1h後，再施於LPS/D-GalN誘導肝病變，dLGG之保護效果一樣顯著(數據未呈現)。這些結果證實dLGG對以LPS/D-GalN誘發小鼠之急性猛爆性肝炎具有治療以及預防的效果。
3.富含半乳糖脂的昭和草萃取物與dLGG對LPS誘發小鼠之發炎現象以及敗血症的預防以及治療效果
急性發炎會造成包括敗血症的嚴重全身性反應，敗血症為一種會造成快速器官衰竭並死亡的複雜適應症。急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)為一種常見的威脅生命的疾病，過去三十年來約有45%的致死率，而在約半數嚴重AKI患者中是因敗血症所造成。(Uchino et al.,2005；Yasuda et al.,2006)
內毒素為一種葛蘭氏陰性細菌的外膜成份，可誘發一連串的發炎級聯反應並參與敗血症的病理機制。由LPS輸液/注射建構的發炎模式已廣泛應用於敗血症研究(Doi et al.,2009)。在本發明的實施例中，使用LPS在C57BL/6J小鼠中誘發急性發炎及敗血性休克，並藉由肝臟、腎臟及肺臟的病理生理比較、測定發炎性細胞激素(IL-6及TNF-α)和ALT及AST(係為肝損傷及肝毒性的指標)在血清之含量，並比較處理組別間參與誘發缺氧以及產生發炎性脂質介質的蛋白質：缺氧誘發因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及脂小體增生活化受體δ(peroxisome-proliferator activating receptor δ,PPAR-δ)的表現程度，來觀察並評估dLGG(5及25mg/kg體重)及CR-EA(10及50mg/kg體重)萃取物的治療及預防效果。
在施予LPS一小時之前，先對控制組施予0.5%DMSO、正控制組施予10mg/kg辛維司汀以及dLGG和CR-EA。臨床藥物辛維司汀為一種HMG-CoA還原酶抑制劑，臨床上對於心血管、腦血管以及急性和慢性腎疾病有效(Epstein et al.,2005；Nissen et al.,2005；Almog,et al.,2004)。史塔丁類藥物療法(Statin therapy，Statin為HMG-CoA還原酶抑制劑藥物類別，辛維司汀為該類藥物的一種)亦對預防人類和動物的敗血症和敗血症誘發的急性腎損傷有效(Yasuda et al.,2006)。此外，一組小鼠係在無LPS刺激下，僅投予dLGG(25mg/kg)。在LPS處理24h後犧牲所有小鼠。收集小鼠血清，測量和比較IL-6及TNF-α之濃度以及AST及ALT的含量。
第6圖(A及B)和第7圖(A及B)顯示，分別以高劑量CR-EA和dLGG處理，再以LPS刺激的小鼠群組中，其血清中促發炎細胞激素之含量顯著降低，其中：IL-6經CR-EA和dLGG治療分別顯著降低2.6及3.5倍；TNF-α分別降低2.0和3.0倍；ALT分別降低1.75和2.3倍；AST分別降低1.3和1.8倍。
如第7圖C所示，由在不同處理群組間之H&E染色所進行的組織學比較顯示：LPS刺激係誘發小鼠肝臟中發炎細胞或紅血球的浸潤現象。第8圖A顯示，CR-EA和 dLGG前處理預防敗血症誘發之急性腎損傷的效果。以H&E染色結果，觀察到有腎皮質損傷、腎小管細胞的空泡性退化和巨噬細胞浸潤的現象。已有報導指出辛維司汀對小鼠使用盲腸連結與刺孔手術之敗血症誘發的急性腎損傷及死亡有改善的效果(Yasuda et al.,2006)。在本發明的實施例中，第8圖A，可觀察到辛維司汀可預防對小鼠使用LPS而導致的敗血症誘發腎損傷，而CR-EA或dLGG處理組中，觀察到相同顯著的預防效果。這些效果可在與載劑控制組小鼠只有相似的腎臟組織染色結果而獲得結論。F4/80免疫組織染色結果顯示：相對於載劑控制組，以CR-EA或dLGG處理會顯著減少LPS造成之腎臟(第8圖C)中巨噬細胞活化與浸潤的現象。正控制組(Simva10)與CR-EA或dLGG處理組相比，亦顯示出相似結果。此外，LPS刺激後，再以25mg/kg劑量的dLGG進行後治療亦可有效降低由LPS所造成的小鼠肝臟、肺臟以及腎臟損傷(數據未示)。
第9圖進一步證實，以CR-EA及dLGG預處理會負調控兩種主要參與發炎媒介物形成以及誘發缺氧現象的蛋白質，PPAR-δ以及HIE-1α的表現。這些結果暗示：CR-EA及dLGG可減緩因氧氣消耗和缺氧環境造成的器官損傷，以及可能會調節發炎性脂質媒介物維持在一恆定狀態。
第6至9圖顯示，單獨僅以dLGG處理小鼠，血清中IL-6、TNF-α、AST以及ALT的含量、器官組織(如：肝臟以及腎臟)的病理評估、和數種蛋白質指標的表現量與載劑處理小鼠相比所呈現的結果皆相似，在肺臟分析的結果 與現象亦相同(結果未示)。這些結果表示dLGG對小鼠不會造成任何傷害。
總結來說，這些結果表示昭和草萃取物和dLGG有潛力作為針對LPS誘發敗血症的預防性或治療性藥劑。
4.以dLGG及CR-EA萃取物進行B16細胞的去色素作用
皮膚為身體最大的器官，總是處在內部和外部因子的影響下。皮膚藉由經常性或內生性色素形成型態(constitutive pigmentation pattern)因應那些刺激反應。黑色素，為一種色素，負責膚色並預防皮膚因環境(如：UV)或其他因子(藥物或化學物)誘發皮膚色素沉著或受到損傷。黑色素係於黑色素細胞中透過黑色素生成反應(melanogenesis)而生成(Costin and Hearing,2007)。酵素酪胺酸酶對哺乳動物產生黑色素而言是必要的(Hearing and Tsukamoto,1991)。小眼症相關轉錄因子(Microphthalmia-associated transcription factor,MITF)係參與黑色素細胞分化、色素沉著、增生及存活的調控，亦為轉錄出黑色素生成酵素或蛋白質基因(例如：酪胺酸酶、酪胺酸酶相關蛋白1及蛋白2)的主要轉錄調控因子(Yasumoto et al.,1997；Hasegawa et al.,2010)。
使用一種含高量色素的B16黑色素瘤細胞作為研究化合物去色素效果的實驗模式始至70年代(Bang et al.,2013；Wrathall et al.,1973)。於本發明之實施例中，係使用昭和草的全沸水粗萃取物(CR-W-EA)或全乙醇粗萃取物(CR-Et-EA)之EA溶份處理後，直接觀察其對B16細胞的去 色素能力。分別使用KA及DMSO作為正控制組以及載劑控制組。
第10圖(A)顯示CR-Et-EA相較於載劑控制組，對於B16黑色素瘤細胞的去色素作用具有劑量依存(dose-dependent)的效果。進一步評估自CR-Et-EA純化的單一化合物dLGG在不同時點的去色素效果。第10圖(B)顯示dLGG(45μM)與載劑控制組相較，以一時間依存方式(time-dependent manner)呈現對於B16黑色素瘤細胞具有顯著的去色素活性。
進一步研究dLGG的去色素效果的分子作用機制。進行西方墨點法以檢驗dLGG對酪胺酸酶與MITF表現的效果。如第10圖(C)所示，dLGG確實能抑制黑色素生成相關蛋白質，MITF與酪胺酸酶的表現。該等數據表明dLGG抑制MITF與酪胺酸酶表現，以阻止B16黑色素瘤細胞中黑色素生成作用，證實dLGG可作為新一代的皮膚美白劑。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。

Claims (16)

  1. 一種富含半乳糖脂之植物萃取物在製備預防或治療猛爆性肝炎之醫藥、保健或營養添加用之組合物的用途，其中該組合物包含：預防或治療上有效量之一生物活性成分，其係為一富含半乳糖脂之植物萃取物或其純化物，其中該植物萃取物係將一植物樣品以水或一低級醇類萃取，再以一低級酯類分配萃取以得一低級酯類萃取物，並進一步以一醇類沖提液沖提該低級酯類萃取物，以得一富含半乳糖脂之溶份，其中該植物樣品係選自由：白鳳菜、大苞水竹葉以及昭和草所組成群組，且醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為5%~20%；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑；其中該富含半乳糖脂之溶份係為一包含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)、1-油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-oleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-亞麻油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-linoleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油 (1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1,2-二-硬脂四烯醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2-di-stearidonoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)或其組合之溶份。
  2. 一種富含半乳糖脂之植物萃取物在製備用於預防或治療敗血症之醫藥、保健或營養添加用之組合物的用途，其中該組合物包含：預防或治療上有效量之一生物活性成分，其係為一富含半乳糖脂之植物萃取物或其純化物，其中該植物萃取物係將一植物樣品以水或一低級醇類萃取，再以一低級酯類分配萃取以得一低級酯類萃取物，並進一步以一醇類沖提液沖提該低級酯類萃取物，以得一富含半乳糖脂之溶份，其中該植物樣品係選自由：白鳳菜、大苞水竹葉以及昭和草所組成群組，且醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為5%~20%；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑；其中該富含半乳糖脂之溶份係為一包含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)、1-油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油 (1-oleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-亞麻油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-linoleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1,2-二-硬脂四烯醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2-di-stearidonoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)或其組合之溶份。
  3. 一種富含半乳糖脂之植物萃取物在製備用於美白之組合物之用途，其中該組合物包含：有效量之一生物活性成分，其係為一富含半乳糖脂之植物萃取物或其純化物，其中該植物萃取物係將一植物樣品以水或一低級醇類萃取，再以一低級酯類分配萃取以得一低級酯類萃取物，並進一步以一醇類沖提液沖提該低級酯類萃取物，以得一富含半乳糖脂之溶份，其中該植物樣品係選自由：白鳳菜、大苞水竹葉以及昭和草所組成群組，且醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為5%~20%；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑；其中該富含半乳糖脂之溶份係為一包含1,2-二-O-α-次 亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)、1-油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-oleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-亞麻油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-linoleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1,2-二-硬脂四烯醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2-di-stearidonoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)或其組合之溶份。
  4. 一種富含半乳糖脂之植物萃取物在製備用於預防或治療急性腎、肝或肺損傷及其相關適應症之醫藥、保健或營養添加用之組合物的用途，其中該組合物包含：預防或治療上有效量之一生物活性成分，其係為一富含半乳糖脂之植物萃取物或其純化物，其中該植物萃取物係將一植物樣品以水或一低級醇類萃取，再以一低級酯類分配萃取以得一低級酯類萃取物，並進一步以一醇類沖提液沖提該 低級酯類萃取物，以得一富含半乳糖脂之溶份，其中該植物樣品係選自由：白鳳菜、大苞水竹葉以及昭和草所組成群組，且醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為5%~20%；以及一醫藥、保健或食品上可接受之載劑；其中該富含半乳糖脂之溶份係為一包含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)、1-油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-oleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-亞麻油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-linoleoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1-棕櫚油醯基-2-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1-palmitoyl-2-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)、1,2-二-硬脂四烯醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2-di-stearidonoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol)或其組合之溶份。
  5. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其 中該低級醇類係甲醇或乙醇。
  6. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其中該低級酯類係為乙酸乙酯。
  7. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其係包含一如第1圖所示之白鳳菜化學指紋圖譜。
  8. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其係包含一如第2圖所示之大苞水竹葉化學指紋圖譜。
  9. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其中該醇類沖提液包含：二氯甲烷和甲醇、甲醇和水、甲醇和乙氰或甲醇和丙酮。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該甲醇沖提液中二氯甲烷和甲醇之比例為9：1。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該甲醇沖提液係用於沖提自白鳳菜而得的一低級酯類萃取物。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該甲醇沖提液中二氯甲烷和甲醇之比例為12：1。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其中該甲醇沖提液係用於沖提自大苞水竹葉而得的一低級酯類萃取物。
  14. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其中該富含半乳糖脂之溶份係進一步以一逆向高效液相層析法(Reversed phase HPLC)加以純化，以得一生物活性溶份。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該富含半乳糖脂之溶份係以一醇類沖提液沖提，以得該生物活性溶份， 其中該醇類沖提液中醇類佔該沖提液之體積百分比為100%~70%。
  16. 如申請專利範圍第1、2、3或4項任一項所述之用途，其中該富含半乳糖脂之溶份係為一富含1,2-二-O-α-次亞麻油醯基-3-O-β-半乳糖吡喃糖基-sn-甘油(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)之溶份。
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