TW202306496A - 植物補充劑及其用於預防動物疾病、促進動物生長和存活的方法 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種動物飼料組成物，其包括以植物為基底的飼料添加劑。本揭露另提供一種促進動物整體健康狀況的方法，包括提高飼料效率及降低飼料轉換率、於豬腸道菌相中增加益生菌及減少病原體、抗發炎、影響初級代謝、促進生長及存活率，以及預防或治療由病原菌、豬繁殖與呼吸症候群病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的疾病。

Description

植物補充劑及其用於預防動物疾病、促進動物生長和存活的方法

本揭露總體上是關於昭和草(Crassocephalum rabens)或其萃取物，及提供其用於預防或治療腹瀉及增進斷奶豬的體重增加及存活率的方法，且更具體地是關於提供昭和草或其萃取物作為斷奶豬的非抗生素生長促進劑及植生素的方法。

斷奶階段是家豬養殖中最具挑戰性的階段，通常伴隨著生長表現下降和腹瀉發生率增加。在現代養豬業中，斷奶通常在3至4週齡左右進行，仔豬面臨從以液體為主的飲食到以固體為主的飲食的轉變，這是仔豬生命中一個突然、複雜且具高度壓力的事件。斷奶中的仔豬通常容易受到營養、生理及心理上壓力源的影響，而這些壓力源會導致腸道形態、生理功能的改變，以及腸道微生物組群的變化(Thomas A.Marsteller and Brad Fenwick,“Actinobacillus pleuropneumoniae disease and serology,”Swine Health and Production.1999(7)：161-165；Zhuofei Xu,et al.,“Comparative genomic characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae,”Journal of Bacteriology 2010(192)：5625-5636；Joy M Campbell, Joe D Crenshaw and Javier Polo,“The biological stress of early weaned piglets,”Journal of Animal Science and Biotechnology 2013(4)：19)。據信，腸道微生物相的破壞是導致斷奶後腹瀉的主要因素之一(Raphaele Gresse et et al.,“Gut microbiota dysbiosis in postweaning piglets：understanding the keys to health,”Trends in Microbiology 2017(25)：851-873)。

在過去幾十年中，抗生素及其他形式的抗微生物劑(anti-microbial agents，AMAs)係公認為用以預防腹瀉及痢疾的抗微生物生長促進劑(AGP)，以此促進自妊娠、分娩、斷奶至育成階段的生長表現(Christy Manyi-Loh et al.,“Antibiotic use in agriculture and its consequential resistance in environmental sources：potential public health implications,”Molecules 2018(23)：795)。然而，積累的證據亦顯示具抗生素抗性的微生物相及其相關抗藥性基因的演化，對牲畜及人類健康具有無法預料的害處，此相關境況令人擔憂(Lauren Brinkac et al.,“The threat of antimicrobial resistance on the human microbiome,”Microbial Ecology 2017(74)：1001-1008；Zachary M.Burcham,et al.,“Detection of critical antibiotic resistance genes through routine microbiome surveillance,”PloS One 2019(14)：e0213280；David A.Relman and Marc Lipsitch,“Microbiome as a tool and a target in the effort to address antimicrobial resistance,”Proceedings of the National Academy of Sciences 2018(115)：12902-12910)。

據此，歐盟(EU)自2006年1月1日起禁止在牲畜及家禽生產中使用AGPs，而美國食品藥物管理局(FDA)自2017年1月1日起也禁止使用抗生素作為飼料補充劑來幫助牲畜及家禽更快地生長。然而，隨著全球人口的增加，牲 畜及家禽的產量必然顯著上升，因此，在畜牧業中開發非抗生素劑作為傳統AGP的替代方案是尚未滿足的需求。

在至少一個態樣中，本揭露涉及一種在有其需要的動物中促進其生長的方法，包括給予該動物包含有效量之飼料補充劑的動物飼料組成物，其中，該飼料補充劑包含昭和草(C.tabeus)或其萃取物以促進動物的生長。

在本申請的至少一個實施態樣中，該方法包括給予包含C.rabens或其萃取物並結合額外的草藥成分之動物飼料補充劑。在本申請的至少一個實施例中，該額外的草藥成分為薄荷精油。

在本申請的至少一個實施態樣中，促進生長包括調節動物的腸道微生物相。在至少一個實施態樣中，調節腸道微生物相包括抑制或減少該動物中致病性腸道菌叢的量。在一些實施態樣中，該致病性腸道菌叢為選自由梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、韋榮氏球菌屬(Veillonella spp.)、放射線桿菌屬(Actinobacillus spp.)、大腸桿菌-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、隱密桿菌屬(Trueperella spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella spp.)、螺旋桿菌屬(Helicobacter spp.)、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)、黴漿菌屬(Mycoplasma spp.)及嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)所組成群組中的至少一者。在一些實施態樣中，調節腸道微生物相包括增強或增加動物中益生菌叢的量。在至少一個實施態樣中，該益生菌叢為選自由乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、巨單胞菌屬(Megamonas spp.)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae family)、毛螺 菌科(Lachnospiraceae family)、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、巨單胞菌屬(Megamonas spp.)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、擬桿菌屬(Bacteroides spp.)、Anaerostipes spp.菌屬(Anaerostipes spp.)及另枝菌屬(Alistipes spp.)所組成群組中的至少一者。

在本申請的至少一個實施態樣中，促進生長包括抑制或減少該動物中腹瀉及腸道感染中至少一者發生。在一些實施態樣中，該動物中腹瀉及腸道感染選自以下群組之細菌病原體的至少一者有關：大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella spp.)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)、短螺旋菌屬(Brachyspira spp.)、耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)及螺旋桿菌屬(Helicobacter spp.)。

在本申請的至少一個實施態樣中，該動物飼料組成物增進動物的存活率。在本申請的至少一個實施態樣中，該動物飼料組成物增強動物的抗發炎反應。在本申請的至少一個實施態樣中，該動物飼料組成物降低TNF-α及糞便IgA中至少一者或其組合的量。在一些實施態樣中，促進生長包括增進動物體重增加。在一些實施態樣中，促進生長包括增加飼料效率或降低飼料轉換率。在一些實施態樣中，促進生長包括調節動物的初級代謝。在一些實施態樣中，調節初級代謝包括增加或減少胺基酸、脂肪酸、碳水化合物及有機酸中至少一者或其任意之組合的量。

在本申請的至少一個實施態樣中，該動物為斷奶豬。在一些實施態樣中，該動物為成豬。

在本申請的至少一個實施態樣中，該昭和草或其萃取物為粉末形式。在一些實施態樣中，該昭和草作為飼料添加劑。

在本申請的至少一個實施態樣中，該昭和草在該動物飼料組成物中佔約0.001wt%至約5wt%，例如，約0.001wt%、約0.002wt%、約0.003wt%、約0.004wt%、約0.005wt%、約0.006wt%、約0.007wt%、約0.008wt%、約0.009wt%、約0.01wt%、約0.015wt%、約0.02wt%、約0.03wt%、約0.04wt%、約0.05wt%、約0.1wt%、約0.2wt%、約0.5wt%、約1wt%、約1.2wt%、約1.5wt%、約2wt%、約2.5wt%、約3wt%、約3.5wt%、約4wt%、約4.5wt%及約5wt%。

在另一個態樣中，本揭露涉及一種在有其需要的動物中預防或治療由豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)所引起的疾病之方法，包括給予該動物包含有效量飼料補充劑的動物飼料組成物，其中，該飼料補充劑包含昭和草或其萃取物。在至少一個實施態樣中，該方法包括給予包含C.rabens或其萃取物並結合額外的草藥成分的動物飼料補充劑。在本申請的至少一個實施態樣中，該額外的草藥成分可為薄荷精油。在至少一個實施態樣中，該動物飼料組成物增進動物的存活率。

在至少一個態樣中，本揭露涉及一種動物飼料組成物，其包括含有昭和草或其萃取物的飼料補充劑。在本申請的至少一個實施態樣中，該昭和草或其萃取物為粉末形式。在至少一個實施態樣中，該動物飼料組成物進一步包括額外的草藥成分。在至少一個實施態樣中，該草藥成分可為薄荷精油。在一些實施態樣中，該動物飼料組成物包括含有昭和草的飼料補充劑，其中，該昭和草在該動物飼料組成物中佔約0.001wt%至約5wt%，例如，約0.001wt%、約0.002wt%、約0.003wt%、約0.004wt%、約0.005wt%、約0.006wt%、約0.007wt%、約0.008wt%、約0.009wt%、約0.01wt%、約0.015wt%、約0.02wt%、約0.03wt%、約0.04wt%、約0.05wt%、約0.1wt%、約0.2wt%、約0.5wt%、約1wt%、約1.2wt%、 約1.5wt%、約2wt%、約2.5wt%、約3wt%、約3.5wt%、約4wt%、約4.5wt%及約5wt%。

下面對實施態樣的說明並結合圖式，可使該些與其他實施態樣更加清楚，儘管在不悖離本揭露範圍的情況下，可能會影響實施態樣的變化及修改。

圖式說明了本揭露的一個或多個實施態樣，並與書面說明一同用於解釋本揭露的原理。在圖式中盡可能地使用相同參考編號代表實施態樣中相同或相似的元件。

圖1A至1G顯示昭和草(C.rahens)對斷奶豬成長表現的影響。三組4週齡斷奶仔豬分別餵食7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.45%，HCR)。圖1A是顯示三組豬的身體表型和形狀的照片。圖1B顯示體重(kg)。圖1C顯示體重變化(%)。圖1D顯示總體重增加量(kg/豬)。圖1E顯示飼料消費(kg/豬)，而飼料轉換率(FCR)示於圖1F。圖1G顯示在飼餵實驗結束時得到的三組代表性仔豬之非腹瀉發生率/存活率。三組豬的初始數量均為32；而CTL、LCR和HCR組的最終數量分別為27、22及29。數值為平均值±標準差。以ANOVA比較對照組和治療組間的差異。星號表示兩個比較組間的統計顯著性為P<0.05。不同字母(a到c)表示三個比較組間的統計顯著性(P<0.05)。體重增加量=最後稱重日的體重-第一天的體重。飼料轉換率(FCR)=總飼料消費量/總體重增加量。

圖2A至2D顯示C.rabens對於對照組或CR飲食組之斷奶豬的糞便微生物相之作用。圖2A顯示來自飼餵7週的三組具代表性斷奶豬糞便中微生物分類群(或稱操作分類單位，OTU)的稀少數量所作的稀疏曲線(rafaction curves)；依據16S rRNA基因序列的生物分類學，門的層級示於圖2B，科的層級示於圖2C，及屬的層級示於圖2D。三組4週齡斷奶仔豬分別餵飼7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.45%，HCR)。各組糞便樣本(n=3)來自三頭豬隻並取其平均值。微生物屬之標示係根據其OTUs。

圖3A至3E顯示三組斷奶豬分別餵食標準飲食(CTL)或含昭和草飲食(LCR或HCR)7周後的糞便微生物16S rRNA序列比較。得分圖(Score plot)示於圖3A，而對應的負荷圖(loading plot)示於圖3B，熱點圖示於圖3C、病原菌熱點圖示於圖3D，及益生菌熱點圖示於圖3E。三組4週齡斷奶仔豬分別餵食7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.45%，HCR)。各組糞便樣本(n=3)來自三頭不同豬隻並取其平均值。微生物屬之標示係根據其OTUs。

圖4A至4P顯示C.rabens對於對照組或CR飲食組之斷奶豬的糞便致病微生物群屬的作用。全部病原菌的豐度示於圖4A、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)示於圖4B、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)示於圖4C、韋榮氏球菌屬(Veillonella spp.)示於圖4D、彎曲菌屬(Campylobacter spp.)示於圖4E，放射線桿菌屬(Actinobacillus spp.)示於圖4F、大腸桿菌-志賀氏菌(Escherichia-Shigella)示於圖4G、隱密桿菌屬(Trueperella spp.)示於圖4H、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)示於圖4I、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)示於圖4J、腸球菌屬 (Enterococcus spp.)示於圖4K、巴斯德氏菌屬(Pasteurella spp.)示於圖4L、螺旋桿菌屬(Helicobacter spp.)示於圖4M、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)示於圖4N、黴漿菌屬(Mycoplasma spp.)示於圖4O、及嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)示於圖4P。三組4週齡斷奶仔豬分別餵食7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末標準飲食(0.45%，HCR)。各組糞便樣本(n=3)來自三頭豬隻並取其平均值±標準差。以ANOVA比較對照組和各治療組之間在第七周結束後的差異。不同字母(a到c)表示三組間的顯著性差異(P<0.05)。

圖5A至5L顯示了C.rabens對於對照組或CR飲食的斷奶豬的糞便益生菌群屬的作用。三組4週齡斷奶仔豬分別餵食7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.45%，HCR)。在餵食CR後斷奶豬糞便中全部益生菌的豐度示於圖5A、乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)示於圖5B、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae family)示於圖5C、巨球型菌屬(Megasphaera spp.)示於圖5D、毛螺菌科(Lachnospiraceae family)示於圖5E、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)示於圖5F、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)示於圖5G、Anaerostipes spp.菌屬示於圖5H、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)示於圖5I、巨單胞菌屬(Megamonas spp.)示於圖5J、另枝菌屬(Alistipes spp.)示於圖5K、及擬桿菌屬(Bacteroides spp.)示於圖5L。各組糞便樣本(n=3)來自三頭豬隻並取其平均值±標準差。以ANOVA比較對照組和各治療組間在第七周結束後的差異。不同字母(a到c)表示三組間的顯著性差異(P<0.05)。

圖6A和6B顯示在斷奶豬餵食標準飲食或CR飲食下，C.rabens對糞便IgA濃度(如圖6A)及血清TNF-α濃度(如圖6B)的作用。三組4週齡斷奶仔豬分別餵食7周標準飲食(CTL)、含低劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.25%，LCR)或含高劑量昭和草(CR)粉末的標準飲食(0.45%，HCR)。各組糞便及血清樣本(n=4)來自四頭豬並取其平均值±標準差。以ANOVA比較對照組和各治療組間在第七周結束後的差異。不同字母(a到c)表示三個比較組間的顯著差異(P<0.05)。

圖7A至7C-2顯示C.rabens對於對照組或餵飼CR飲食之斷奶豬的初級代謝物的作用。經PLS-DA分析來自CR餵飼組豬血清之GC/Q-TOF MS數據後，分數圖示於圖7A，而對應的負荷圖示於圖7B。圖7C-1和7C-2顯示相較於CTL組，來自CR餵飼組豬血清之初級代謝物倍數變化的熱圖(heatmap)。

圖8顯示碳水化合物相關益生菌和碳水化合物代謝物之間的斯皮爾曼等級相關係數熱圖，用以代表餵飼標準飲食或CR飲食之斷奶豬的益生菌及碳水化合物間的相關性(每組n=3)。

圖9A至9H顯示C.rubens萃取物(CRE)及CRE混合薄荷精油(CREV)作為飼料補充劑，相較Digestoram(Biomin,Austria)對斷奶豬生長表現及存活率的影響。斷奶豬(5週齡)分為四組，分別為餵飼標準飲食(CTL)、標準飲食加0.05% Digestoram(作為陽性對照組)、標準飲食加0.04% CRE，以及標準飲食加0.04% CRE及0.005%薄荷精油(CREV)。在餵飼試驗期間和結束時收集數據。仔豬的臨床體型/大小和身體狀況示於圖9A，體重(kg/豬)示於圖9B，體重變化(%)示於圖9C，總體重增加(kg/豬)示於圖9D，飼料消費量(kg/豬)示於圖9E，飼料轉換率示於圖9F，經6週每日監測的存活率示於圖9G，及血清TNF-α濃度 示於圖9H。各組斷奶豬的初始數量為32頭。對來自各組的血清樣本(n=10)進行TNF-α量測定。數值呈現為平均值±標準差。以ANOVA比較對照組和全部治療組間的差異。不同字母表示顯著差異(P<0.05)。

昭和草(Crassocephalum rabens S.Moore，C.rabens，CR)，另學名C.crepidioides S.Moore，是一種野生植物，在台灣廣泛用作民間藥材，用於各種發炎相關病症。經證實，源自CR的主要半乳醣脂，1,2-di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol(dLGG)，對於由內毒素或盲腸結紮穿孔引起的小鼠敗血症具有預防和治療效果(Maria K.Apaya,et al.,“Simvastatin and a plant galactolipid protect animals from septic shock by regulating oxylipin mediator dynamics through the MAPK-cPLA2 signaling pathway,”Molecular Medicine 2015(21)：988-1001)。豐富的半乳醣脂組分或dLGG在體外和異種移植或同種異體移植小鼠腫瘤模式中，也顯示出對黑色素瘤和乳癌細胞轉移的抑制效果(Chung-Chih Yang,et al.,“Plant galactolipid dLGG suppresses lung metastasis of melanoma through deregulating TNF-α-mediated pulmonary vascular permeability and circulating oxylipin dynamics in mice,”International Journal of Cancer 2018(143)：3248-3264；Maria K.Apaya,et al.,“Deregulating the CYP2C19/epoxy-eicosatrienoic acid-associated FABP4/FABP5 signaling network as a therapeutic approach for metastatic triple-negative breast cancer,”Cancers(Basel)2020(12)：199)。

在本揭露中，CR係用作斷奶豬飼料添加劑。本揭露證實，與飼餵對照飲食的斷奶豬相比，在斷奶豬中使用CR作為飼料添加劑可減少腹瀉的發生，並改善生長表現及存活率。重新編程腸道微生物群，意即，在發揮益生菌作用的糞便菌相中，益生菌數量增加而致病菌數量減少，降低豬糞便中的IgA，以及調節初級代謝，業經發現是CR在提高斷奶豬飼料效率和疾病預防方面的相關作用。相較於對照飲食組、或對照飲食加上宣稱能協助農場動物之消化及整體表現的商業植物產品Digestoram®，CR萃取物與薄荷精油(CREV)的組合、或單獨使用CR萃取物(CRE)，顯著降低了斷奶豬的腹瀉發生，且提高了斷奶豬的生長表現及存活率。

因其改變腸道微生物群落組成的機制，為仔豬開發無抗生素AGP，首先要了解仔豬腸道微生物組群的微生物和功能演替(Geon Goo Han,et al.,“Evaluating the association between body weight and the intestinal microbiota of weaned piglets via 16S rRNA sequencing,”Applied Microbiology Biotechnology 2017(101)：5903-5911；Hyeun Bum Kim,et al.,“Microbial shifts in the swine distal gut in response to the treatment with antimicrobial growth promoter,tylosin,”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2012(109)：15485-15490)。找到新方法開發擬仿AGPs作用的替代方案至關重要。然而，AGPs對宿主和微生物組群的功能和交互作用仍不清楚。因此，希望藉由宿主和微生物的屬性來優化動物健康。

在本揭露中，發現一種藉由調節仔豬腸道微生物組群來幫助動物健康並預防疾病的植物性添加劑。

動物飼料係指餵飼家畜和寵物(伴侶動物)的食物。

術語「治療」係指將有效藥劑施用於有其需要的個體，其目的是治療、減輕、緩解、補救、改善、減少或預防疾病、其症狀或對疾病的易感性。

在不限制本揭露的範圍之下，根據本揭露實施態樣的示例性儀器、方法及其相關結果提供如下。須注意，為了方便讀者，示例中可使用標題或副標題，但此絕非用以限制本揭露的範圍。此外，本文提出並揭露了某些理論；但無論它們是對還是錯，只要根據本揭露實施，它們都不應該限制本揭露的範圍，不考慮任何特定的行動理論或方案。

材料和方法

昭和草植物粉末(CR)及昭和草萃取物(CRE)

經由本領域具通常知識者已知的常規方法獲取、乾燥和研磨C.rabens植物以獲得植物粉末。在本揭露中，可以使用整株植物和沒有根的部分植物來獲得植物粉末。C.rabens植物萃取物藉由新鮮壓榨植物獲得或藉由50%至95%乙醇萃取製備。收集的液體萃取物可以凍乾或進一步與其他植物成分混合，如沸石、豌豆粉、麥芽糖糊精、麥麩或小麥粗粉，以形成單含一定量CR或CRE的有效配方，或含有CR或CRE與其他植物成分混合的配方。

薄荷精油

薄荷精油可以從不同的薄荷物種中製備，例如M.spicata「茱莉雅甜薄荷」、M.aquativa var.「檸檬酸萊姆薄荷」、M.aquatic var.「墾丁水薄荷」。在至少一個實施例中，薄荷精油是從位於台灣彰化縣或南投縣區域的行政院農業委員會臺中區農業改良場農田中在最佳栽培條件下栽培和收集的薄荷植物中取得的。獲取成熟的植物並進行水蒸氣蒸餾以收集精油。不同來源的薄荷精油可以單獨使用，也可以等體積混合使用，以符合最終劑量。

動物

共有96頭健康的去勢斷奶仔豬(Duroc×[Landrace×Yorkshire]，初始體重7.86±1.25kg；日齡28±2)取自台灣糖業公司(臺灣臺南)家畜事業部。將仔豬隨機分派為6圈，每圈有16頭。根據完全隨機化的設計，將仔豬分派至3組6圈中，即每組兩圈。

此三組斷奶仔豬為：(1)對照組(CTL)組以玉米、全脂豆粕和乳清粉為主的基礎飲食餵飼；(2)低劑量(LCR)組，餵飼基礎飲食，並混合0.15%重量CR植物粉末；(3)高劑量(HCR)組，以混合0.45%重量的CR植物粉末的基礎飲食餵飼。所有飲食均符合營養需求委員會(NRC)(1998)推薦的營養需求。給已經食用了3週的教槽餵飼的動物餵食7週的對照飲食或含CR飲食(LCR或HCR)。

於另一批試驗中，將仔豬隨機分派至4組8圈中，即每組兩圈。斷奶仔豬分為(1)CTL組：以基礎飲食餵飼；(2)Digestoram組：以基礎飲食與0.05% Digestoram(Biomin,Austria)混合餵飼的動物作為陽性對照組；(3)CRE組：以混合0.04%重量的沸石塗層的CR植物萃取物之基礎飲食餵飼的動物；(4)CREV組：以基礎飲食加0.04%重量的CRE和0.005%重量的薄荷精油餵飼的動物。向斷奶仔豬提供對照飲食或對照飲食加上其他配方，持續4週(從7週齡到11週齡的動物)。

在兩批試驗中，試驗仔豬並無施用抗生素。按照先前描述的方法監測所有動物的健康狀況(Stephen G.Matthews,et al.,“Early detection of health and welfare compromises through automated detection of behavioral changes in pigs,”The Veterinary Journal 2016(217)：43-51)並飼養於溫度受控的保育室中 (25±2℃)，飼料和水可隨意獲取。在每週結束時測量飼料攝取量和體重以測定體重增加、飼料消費和飼料轉換率(FCR)。

在試驗期間，每天監測所有豬隻的臨床腹瀉觀察。如果觀察到水樣糞便，則將它們分類為糊狀或液體狀，並記錄為腹瀉病例。非腹瀉發生率(%)計為一段時間內非腹瀉仔豬總數除以該期間仔豬數再乘以100。所有動物實驗均按照台灣中央研究院動物照護指導方針進行。所有程序均經中央研究院實驗動物照護及使用委員會核准(protocol no.19-099-1346)並遵循實驗動物使用指導(National Academy Press,Washington,DC)。

糞便採樣

在斷奶前(日齡28)及以標準飲食或標準飲食加CR餵飼7週後(於11週齡)，從斷奶豬的肛門收集糞便樣本。將糞便樣本置於BD BBLTM CultureSwab Plus收集管中並儲存於-80℃。

採血

在飼料配給前的早晨從頸靜脈採集全血並進行血液檢測。在經過鋰-肝素處理的試管中抽取用於生化和代謝剖析測定的血液樣本，並立即冷卻，並在收集後2小時(h)內離心以進行血清分離。血清在分析前置於20℃下冷凍。測定血清葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、三酸甘油脂(TG)、血尿素氮(BUN)、尿素(UA)、肌酐(CRE)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)。以丙胺酸轉胺酶(ALT)和天門冬胺酸轉胺酶(AST)評估肝細胞功能。鹼性磷酸酶(ALP)被認為可能參與肝膽損傷及用作成骨細胞活性的標誌物。總膽紅素係作為肝膽損傷指標。

腸道微生物相組成分析

糞便樣本的基因組DNA(gDNA)藉由商購的DNA萃取試劑組(QIAamp Powerfecal DNA Kit,QIAGEN,Hilden,Germany)萃取。gDNA濃度經測量並調整至5ng/μg以用於PCR及純化。對於16S rRNA基因定序，V3-V4區域藉由特定引子組增幅(319F：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’(SEQ ID NO：1)；和806R：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’(SEQ ID NO：2))(N=A、T、C或G；W=A或T；H=A、C或T；V=A、C或G)根據16S rRNA總體基因體定序文庫製備程序(Illumina)。簡而言之，5ug的gDNA用於以KAPA HiFi HotStart Ready Mix(Roche)進行的PCR反應，其反應條件為：95℃ 30秒(s)；55℃ 30秒；72℃ 30秒；72℃ 5分鐘；然後保持在4℃。PCR產物在1.5%瓊脂膠體檢測。選擇大約於500bp明亮主帶的樣本，並使用AMPureXP珠進行純化，以用於隨後的文庫製備。

定序文庫是根據16S總體基因體定序文庫製備程序(Illumina)製備。簡而言之，使用16S rRNA V3-V4區域PCR擴增子和附有雙索引和Illumina定序接子(Illumina)的Nextera XT Index Kit進行二次PCR。在Qubit 4.0螢光計(Thermo Scientific)和Qsep100TM系統上評估索引PCR產物質量。藉由MiSeq Reporter、BaseSpace和Greengenes數據庫對16S rRNA基因擴增子定序的結果進行分析，以對餵飼CR或未餵飼的豬隻間的微生物組群進行分類。

斷奶豬唾液樣本中豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)的檢測

按照已備妥進行PCR實驗的試劑盒說明，使用QIAamp cadorPathogen Mini Kit(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)從唾液樣本中萃取RNA。使用即時多重RT-PCR檢測試劑盒(QIAGEN GmbH,Hilden,Germany)進行PCR，用於檢測PRRS病毒(Labor DiagnostikGmbH Leipzig)的歐洲(EU)基因 型、北美(NA)基因型和高致病性NA株(HP)，此試劑盒在一種混合物(PRRSV-Mix)中含有酶、引子和探針，以及陽性和陰性對照組。該試劑盒可同時檢測PRRSV的EU-和NA-基因型、NA-基因型的HP株以及擴增和萃取對照組(β-actin housekeeping基因的mRNA)。PRRSV-Mix是用Optical Tube Strips(Agilent Technologies)以RNA洗脫製備的。每個樣本的配方包括80%的PRRSV-Mix和20%的樣本或對照組。在ABI 7500即時PCR系統(Applied Biosystems)上使用以下加熱曲線進行PCR：逆轉錄反應在45℃進行10分鐘；起始PCR活化步驟在95℃進行10分鐘；95℃ 15秒(s)變性40個循環；56℃黏著30秒；並在72℃下延展30秒。所有樣本以一式兩份進行測試。

分析斷奶豬糞便IgA及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)

藉由豬IgA酵素結合免疫吸附分析(ELISA)套組(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)測定糞便IgA。新鮮糞便和對照組以分析稀釋液稀釋為1：10 w/v(0.1克於0.9mL)，再以渦漩震盪30秒以均質化，然後以4000×g離心10分鐘。所有樣本以一式三份進行測試。使用標準曲線對相對IgA抗體進行量化，該標準曲線使用陽性參照例的兩倍連續稀釋製成。使用Graphpad Prism 5.0(Graphlad Software，San Diego，CA，USA)在450nm處測量的標準曲線的插值採用具有最小平方配適的非線性回歸。血清中TNF-α的濃度藉由商用酵素結合免疫吸附分析(ELISA)套組(R&D Systems,USA)測定，並依據其說明手冊操作。

使用氣相層析/四極柱飛行時間式質譜測定法(GC/Q TOF-MS)進行初級代謝組分析

將來自受試斷奶豬的血清樣本(每個50μL)與含有核糖醇(0.2mg/mL)的80%甲醇混合作為內部標準，然後劇烈渦旋震盪並放入液態氮中10分鐘。該方法重複3次以徹底去除蛋白質部分。在4℃下以13,000rpm離心10分鐘後，收集上清液並以SpeedVac(Labconco,USA)真空乾燥。將乾燥的分析物與20μL甲氧胺(20mg/mL於吡啶中)在30℃下培養90分鐘，然後與含有1%三甲基氯矽烷(TMCS)的N,O-bis(三甲基矽基)三氟乙醯胺(BSTFA)在70℃下反應及衍生化120分鐘。

使用中央研究院農業生物科技研究中心代謝組學核心設施的GC/Q-TOF質譜儀(Agilent Technologies,USA)對豬血清樣本的初級代謝組進行研究。衍生樣本(0.5μL)以氦氣作為載氣注射，以1mL/min的速度流入Agilent J&W DB-5ms管柱(30m×250μm×0.25μm)。GC烘箱溫度斜坡在60℃下保持1分鐘，然後升至325℃(10℃/分鐘)並保持恆定10分鐘。質量範圍為50至600Da，以全掃描模式收集數據。將質譜與NIST Chemistry WebBook(美國國家標準暨技術研究院)和PubChem(美國國家生物技術資訊中心)進行比較。將質量(質荷比)片段的峰高依每個樣本的內標準(核糖醇)標準化。

數據分析及統計

多元偏最小二乘判別分析(PLS-DA)用以定義獨立樣本的最大分類和分離。統計分析以SAS程式(SAS Institute,USA)進行。組間差異以ANOVA確定。P<0.05視為具有統計意義並用不同字母表示。

實施例1：CR植物粉對斷奶豬生長表現的影響

斷奶仔豬餵飼基礎飲食和低劑量或高劑量CR飲食35天。在實驗期間每天記錄臨床觀察、飼料消費和存活率。CR補充劑對斷奶豬生長表現的影 響總結於圖1A至1G。LCR組和HCR組仔豬臨床體型大小和體質狀況均明顯優於CTL組，且HCR組動物明顯大於LCR組和CTL組，如圖1A所示。CR治療7週後，相較於CTL組，LCR組和HCR組斷奶豬的體重均顯著增加。在7周治療期結束時，相較於CTL組，LCR和HCR斷奶仔豬的體重分別增加了13.98%和27.78%(P<0.05)，如圖1B和1C以及下面的表1所示。

表1. 昭和草植物對斷奶豬體重參數和飼料轉換率的影響

此外，HCR組仔豬在保育期結束時平均比LCR組重2.27kg(P<0.05)，如上表1所示。CR治療組的體重增加顯著高於對照組，如圖1D所示。依圖1E，雖然LCR組的總飼料消費低於CTL和HCR組，但相較於CTL組(3.05)相比，LCR(1.93)和HCR(1.84)組的FCR顯著增強(P<0.05)，如圖1F和表1所示，此表明CR植物促進了斷奶豬的生長表現。

三組斷奶豬參照存活率的降低動物腹瀉發生率如圖1G所示。餵飼HCR的豬隻存活率(90.63%)遠高於CTL組(84.38%)和餵飼LCR的豬隻(68.75%)

實施例2：CR植物粉對斷奶豬PRRS發病率的影響

豬繁殖與呼吸症候群(PRRS)是目前影響養豬業者於經濟上最重要的疾病。隨機選自12頭豬的唾液樣本以評估CR對CTL、LCR和HCR組豬隻PRRS發病率的影響。在餵飼期間，從每組中隨機抽取4頭豬的唾液樣本，在起始日(第28天)和最終日(第77天)進行PRRS分析。CR補充劑對斷奶豬PRRS發病率的影響總結於下表2。所有豬隻在28日齡時檢測結果均為陰性。CTL、LCR和HCR組77日齡豬隻的PRRS發病率分別為75%、50%和0%。

表2. 在餵飼對照或CR補充飲食^a的斷奶豬中，昭和草對PRRS病毒分佈的影響

實施例3：斷奶豬的血液學和生化/生理參數

檢測以對照飲食或CR補充飲食餵飼的斷奶豬的周邊血液細胞全貌。在第7周用血細胞計數器對各組動物(n=4)的全血細胞計數進行分析，如下表3所示。平均而言，三組動物全血中的大多數細胞類型均無顯著差異，且均在健康動物的正常範圍內，除了在淋巴細胞(77-80)和WBC(23.9-30.6)群中，所有三 組動物的數量均略高於正常範圍內的值，而在所有三組受試動物中均檢測到嗜中性球(18.7-22.7)。

表3. 餵飼對照或CR飲食之斷奶豬的血液學參數

下表4顯示了CTL、LCR和HCR斷奶豬血清生化/生理參數的平均值(每組n=4)。一般而言，CR飲食不影響血脂、葡萄糖、腎功能相關標誌物、肝指數酶，或改變蛋白質濃度，如TG、總膽固醇、血液尿素氮、尿酸、肌酐、白蛋白、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶(ALP)等，表示CR補充劑對受試動物並無有害或毒性。

表4. 餵飼對照或CR飲食之斷奶豬的血清生化參數

實施例4：分析16S rRNA MiSeq定序數據

對9個糞便樣本中的16S rRNA基因進行定序後，品質過濾後總共產生了289,839個讀數，每個樣本的平均序列數為96,613±29,482個讀數。基於樣本數據集上稀有分類群數量(或者操作分類單位，OTU)的稀有曲線評估顯示，所有3條曲線(每條曲線是3頭豬的平均值)趨於形成一個高原，證明有足夠的序列覆蓋樣本中包含的多數生物多樣性，如圖2A所示，這顯示在大腸微生物相中可檢測到幾乎所有的細菌種類。在CTL、LCR和HCR組中鑑定而觀察到的OTU平均數量分別為525.7±106.1、545.0±136.1和586.7±79.7，如下表5所示。稀疏曲線未顯示9頭豬糞便中細菌類群組成的顯著差異，HCR組的α多樣性指數值(PD whole tree、Chao 1、Shannon-Weaver index和ACE)略高，但相較於CTL組並無統計學上意義。

表5. 依據16S rRNA基因序列測定豬腸道微生物的α多樣性

實施例5：依據基因數據的斷奶豬和CR飼料豬的微生物多樣性

腸道微生物群落比較

為了評估CTL、LCR和HCR組豬的腸道微生物組群的比較性分析和組成，從9頭豬(每組3頭豬)中隨機抽取糞便樣本並進行16S rRNA MiSeq定序。測定斷奶豬腸道菌相反應CR供給的總體結構變化。總基因體分析顯示，斷奶豬腸道微生物屬於25個門、31個綱、57個目、99個科和206個屬。使用OTU水平分析以測定使用所有樣本結合的微生物群落組成，門如圖2B所示，科如圖2C所示，屬的層級如圖2D所示。

對匯集的糞便樣本於微生物門級中經分配後的分類概況顯示，在CTL組中，厚壁菌門(Firmicutes)是主要的門(75.5%)，其次是擬桿菌門(Bacteroidetes)(14.3%)、放線菌門(Actinobacteria)(6.4%)和變形菌門(Proteobacteria)(1.5%)。在LCR和HCR組中，微生物門的分布以厚壁菌門(81.9%和72.5%)為主，其次是擬桿菌門(11.4%和16.9%)、放線菌門(4.4%和6.1%)、ε-變形菌門(Epsilonbacteraeota)(0.31%和2.05%)，以及變形菌門(0.5%和0.9%)，如圖2B所示。CTL組具有最高的變形菌門相對豐度(相較於LCR和HCR組分別為2.98倍和1.78倍)。值得注意的是，變形菌門包括多種病原體，例如埃希氏菌屬(Escherichia)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、沙門氏菌屬(Salmonella)、螺桿菌屬(Helicobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和許多其他須注意的致病菌屬。

在科的層級中，CTL組中斷奶豬的微生物群裡三個最豐富的微生物科主要由瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)(20.9%)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)(16.6%)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)(11.0%)組成。LCR組中四個豐富的細菌科主要由乳桿菌科(20.88%)、瘤胃球菌科(17.97%)、毛螺菌科 (Lachnospiraceae)(12.94%)和鏈球菌科(Streptococcaceae)(10.07%)組成。HCR組的瘤胃球菌科(19.6%)、乳桿菌科(14.1%)、普雷沃氏菌科(13.5%)和毛螺菌科(10.9%)的相對豐度最高，如圖2C所示。值得注意的是，瘤胃球菌科、乳桿菌科、普雷沃菌科和毛螺菌科是許多在食物中蛋白質和碳水化合物的分解中發揮作用腸道微生物。LCR和HCR組在這四個微生物科中的相對豐度(59.97%和58.10%)高於CTL組(56.29%)。

在屬的層級中，乳桿菌屬(Lactobacillus)是三組豬腸道微生物群中最顯著豐富的屬。CTL、LCR和HCR組的乳桿菌屬豐度分別為16.6%、20.9%和19.1%。在LCR和HCR組中，瘤胃球菌(Ruminococcaceae)(6.6%和6.5%)和普雷沃氏菌屬(Prevotella)(5.4%和10.7%)較豐富，而普雷沃氏菌屬(8.1%)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)(6.1%)和梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)(5.8%)是CTL組中最豐富的屬，如圖2D所示。

藉由多元偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對經16S rRNA定序檢測到的總共206個屬進行多變量分析。PLS-DA揭示了每個實驗組腸道微生物群落的不同聚集。PLS-DA得分圖顯示CR誘導斷奶豬糞便微生物群落結構的改變，如圖3A所示。在分數圖中，每個點代表一個單獨的測試豬隻，可以觀察到的分群、趨勢和離群值。分數圖揭示了各組的不同聚集，這顯示CR治療涉及細菌重編程或改變。對應的負荷圖確定了與三個特定組別的動物有強烈關聯的異常微生物，如圖3B所示。一個微生物群屬與起源的距離代表了在PLS-DA上不同群體聚集的貢獻。相對於CTL，LCR和HCR干預均誘導了微生物群落結構和特定微生物屬的顯著變化。高劑量和低劑量的CR消耗都會引起相似的微生物組成變化。

依組使用Z-score進一步分析基因豐度測量值之間的差異，並用於生成熱圖，如圖3C所示。屬的層級的一些相對豐度變化也被辨識出來。CTL組中OTUs具高豐度的Solobacterium菌屬、霍爾德曼氏菌屬(Holdemanella)、柯林斯菌屬(Collinsella)、梭狀芽孢桿菌屬_sensu_stricto_1(Clostridium_sensu_stricto_1)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、罕見小球菌屬(Subdoligranulum)、梭菌屬(Fusobacterium)、柔嫩梭菌屬(Faecalibbcterium)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、大腸桿菌-志賀氏菌(Escherichia-Shigella)和腸球菌屬(Enterococcus)在CR群中是減少的。在斷奶豬的LCR和HCR組中觀察到類似的差異趨勢。LCR組中最豐富的OTUs是瘤胃球菌科_UCG_005(Ruminococcaceae_UCG_005)、理研菌科RC9_gut_group(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、布勞特氏菌屬(Blautia)、巨球型菌屬(Megaspeaera)、Agathobacter菌屬、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和杜爾氏菌屬(Dorea)。HCR組中主要OTUs是瘤胃球菌科_UCG_014(Ruminococcaceae_UCG_014)、克里斯滕森菌科_R_7group(Christensenellaceae_R_7_group)、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)、Alloprevotella菌屬、普雷沃氏菌屬_2(Prevotella_2)、瘤胃球菌科_NK4A214_group(Ruminococcaceae_NK4A214_group)、Anaerococcus菌屬、鏈型桿菌屬(Catentibacterium)、普雷沃氏菌屬_7(Prevotella_7)、小類桿菌屬(Dialister)和彎曲菌屬(Campylobacter)。

病原菌和益生菌屬豐度測量值之間的差異係依組使用Z-score進一步分析，並用於生成熱圖，分別如圖3D和圖3E所示關於病原體豐度，顯示CTL組最高，CR組豐度顯著降低。然而，三組在不同的益生菌豐度方面各有優 勢。HCR組中巨單胞菌屬(Megamonas)、瘤胃球菌科_UCG_010、瘤胃球菌科_UCG_014、毛螺菌科_NK4B4_group和瘤胃球菌屬_1較高；毛螺菌科_ND3007_group、毛螺菌科_AC2044_group、瘤胃球菌科_UCG_004、瘤胃球菌屬_2、瘤胃球菌科_UCG_005、Anaerostipes菌屬和瘤胃球菌科_UCG_013在LCR組中較高；瘤胃球菌科_UCG_003、嗜膽菌屬(Bilophila)、瘤胃球菌科_UCG_009、另枝菌屬(Alistipes)、毛螺菌科_FCS020_group和瘤胃球菌科_UCG_002在CTL組中較高。

病原菌和益生菌叢分析

分析致病微生物屬的豐度以顯示CR對斷奶豬的影響，如圖4A至4P所示。分析了在斷奶豬中引起腹瀉和豬胃潰瘍的微生物病原體如大腸桿菌_志賀氏菌(Escherichia_Shigella)(圖4G)、產氣莢膜桿菌(Clostridium perfringens)、彎曲菌屬(Campylobacter spp.)(圖4E)、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)(圖4N)及螺桿菌屬(Helicobacter spp.)(圖4M)。CTL、LCR和HCR組中大腸桿菌_志賀氏菌屬的豐度分別為0.230%、0.024%和0.034%。CTL組中梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)相較於LCR和HCR組呈現顯著較高的豐度。例如，產氣莢膜梭菌僅存在於CTL(0.015%)中。與CTL(0.604%)和HCR(0.687%)相比，彎曲桿菌屬於LCR組(0.307%)的豐度較低。勞森氏菌屬和螺桿菌屬於CTL(0.0109%和0.0523%)組中，其豐度分別相對高於LCR0.001%和0.0039%和HCR(0%和0.0033%)組。

呼吸道病變可分為三種主要疾病實體：鼻炎、肺炎和胸膜炎。呼吸道相關的細菌病原體已知為巴斯德氏菌屬(Pasteurella spp.)(圖4L)、黴漿菌屬(Mycoplasma spp.)(圖4O)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)(圖4P)、放線桿菌屬(Actinobacillus spp.)(圖4F)、隱密桿菌屬(Trueperella spp.)(圖4H)、博德特氏菌屬(Bordetella spp.)及沙門氏菌屬(Salmonella spp.)。在CTL、LCR和HCR中發現巴斯德氏菌屬的豐度分別0.1076%、0.0010%和0%。與LCR(0.0038%)和HCR(0%)組相比，黴漿菌屬顯著存在CTL(0.0109%)組。與LCR(0.001%)和HCR(0%)組相比，CTL(0.0059%)組的豬鏈球菌較高，而嗜血桿菌屬(圖4P)僅在CTL(0.0197%)組中檢測到。與飼餵CR的豬相比(LCR組為0.0395%，HCR組為0.0049%)，CTL(0.5251%)豬的放線桿菌屬(圖4F)豐度相對較高。在CTL、LCR和HCR組中，隱密桿菌屬的豐度(圖4H)分別為0.2023%、0.0178%和0.0010%。

分析主要造成人畜共通疾病的微生物病原體如梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)(圖4B)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)(圖4C)、韋榮氏球菌屬(Veillonella spp.)(圖4D)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)(圖4I)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)(圖4J)及腸球菌屬(Enterococcus spp.)(圖4K)。CTL組顯示梭狀芽孢桿菌屬(5.5590%)、鏈球菌屬(5.0596%)和韋榮氏菌屬(2 8486%)的豐度最高這些屬分別比LCR組高1.94倍、2.92倍和9.28倍，比HCR組高2.19倍、3.30倍和131.2倍。與CTL組相比，CR降低了假單胞菌屬、葡萄球菌屬和腸球菌屬的屬豐度。LCR和HCR組在這三個屬中的豐度低於CTL組。CTL組的假單胞菌屬(0.1155%)、葡萄球菌屬(0.1372%)和腸球菌屬(0.1076%)的豐度最高。此外，在CTL組中，假單胞菌屬和葡萄球菌屬分別是LCR組的58.5倍和34.8倍，而假單胞菌屬、腸球菌屬和葡萄球菌屬分別是HCR組的19.5倍、36.3倍和13.9倍。

對CTL、LCR和HCR動物中的益生菌叢進行了分析，並顯示在圖5A至5L。在CTL、LCR和HCR組動物中驗出的益生菌總量分別為27.96%、 36.61%和37.73%，顯示CR補充劑確實顯著增加了斷奶豬的腸道益生菌叢數量。在檢測到的屬菌株中，乳桿菌屬(圖5B)是三組中最豐富的屬，CTL、LCR和HCR分別為16.63%、20.88%和19.07%，七組益生菌中，瘤胃球菌科(圖5C)、巨球型菌屬(Staphylococcus spp.)(圖5D)、毛螺菌科(Lachnospiraceae family)(圖5E)、瘤胃球菌屬_1(genus Ruminococcus_1)(圖5F)、瘤胃球菌屬_2(genus Ruminococcus_2)(圖5G)及Anaerostipes菌屬(圖5H)在LCR和HCR組中是高於CTL組的。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(圖5I)及巨單胞菌屬(Megamonas spp.)(圖5J)在HCR組中相對較高，而另枝菌屬(Alistipes spp.)(圖5K)在LCR組中被高度誘導。擬桿菌屬(Bacteroides spp.)在三組動物中沒有觀察到統計學上差異(圖5L)。

實施例6：C.rabens對斷奶豬糞便IgA和血清TNF-α量的影響

C.rabens對斷奶豬糞便IgA濃度的影響如圖6A所示。在第7週測定糞便IgA濃度。CTL、LCR和HCR組的糞便IgA濃度分別為632.46ng/g、639.48ng/g和461.21ng/g。TNF-α是一種眾所周知的促發炎細胞因子，在第7週時於CTL組的血清中檢測到289.7pg/mL，而LCR(143pg/mL)和HCR(209.7pg/mL)組則發現降低，如圖6B所示。這些結果顯示，CR治療降低了斷奶豬的糞便IgA和血清TNF-α量。

實施例7：CR治療的斷奶豬血清之初級代謝組分析

據信，初級代謝組為斷奶豬生長表現的因子之一。使用GC/Q-TOF MS研究CR治療對豬新陳代謝的潛在影響。對血清中檢測到的總共78種代謝物進行了多元偏最小平方判別分析(PLS-DA)。如圖7A得分圖(score plot)，顯示每組為不同叢聚，得解釋CR治療可能會影響斷奶豬的初級代謝。而對應的負荷 圖(loading plot)顯示於圖7B，確定了在對照和CR治療的動物之間具有更顯著變化的代謝物變量。

已鑑定的代謝物根據其化學結構和功能分類和分組，包括胺基酸、碳水化合物、脂肪酸、核苷酸、有機酸、固醇、尿素循環和其他圖7C-1和7C-2顯示了相較於CTL組，來自餵飼CR的豬隻血清之初級代謝物倍數變化的熱圖。

在LCR組鑑定的20種胺基酸和其他代謝物中，觀察到麩胺酸(1.5倍)、白胺酸(1.5倍)、甲硫胺酸(1.5倍)和色胺酸(1.8倍)顯著增加，而在HCR組中，蘇胺酸是降低的(0.5倍)。眾所周知，胺基酸提供補充營養以支持仔豬的腸道發育和生長表現。對於斷奶後的豬，麩胺酸作為一種膳食補充劑，主要作用於能量產生和合成與腸道更新相關的分子。麩胺酸也被證明可以提高斷奶仔豬的飼料效率(L.S.Santos,G.M.Miassi,M.L.P.Tse,L.M.Gomes,P.N.Berto,J.C.Denadai,F.R.Caldara,D.B.Dalto,and D.A.Berto,“Growth performance and intestinal replacement time of 13C in newly weaned piglets supplemented with nucleotides or glutamic acid.”Livestock Science 27,160-165(2019))。在該實施例中，證明了用LCR餵飼提高了斷奶豬血清中的麩胺酸量。

此外，HCR組的白胺酸顯著降低，其為一種支鏈胺基酸。過往研究報導，過量的白胺酸攝食會影響生長豬其他支鏈胺基酸的代謝，從而損害生長表現、氮保留和下視丘血清素合成減少(W.B.Kwon,K.J.Touchette,A.Simongiovanni,K.Syriopoulos,A.Wessels,and H.H.Stein,“Excess dietary leucine in diets for growing pigs reduces growth performance,biological value of protein,protein retention,and serotonin synthesis.”Journal of Animal Science 97,4282-4292 (2019))。在餵食HCR的斷奶豬中檢測到較低的白胺酸量意味著受試動物具有更佳的生長表現。

另外，一些研究調查了蘇胺酸的新陳代謝，因為免疫系統刺激期間會產生具豐富蘇胺酸的免疫系統代謝物，如免疫球蛋白和腸道粘液(M.O.Wellington,J.K.Htoo,A.G.Van Kessel,and D.A.Columbus,“Impact of dietary fiber and immune system stimulation on threonine requirement for protein deposition in growing pigs.”Journal of Animal Science 96,5222-5232(2018))。在該實施例中，顯示餵飼HCR的豬血清中的蘇胺酸表現量降低，這表示免疫刺激程度較低。

另一方面，含硫胺基酸之甲硫胺酸參與豬的生長，是發育豬日糧成分混合物中的限制性胺基酸(N.Litvak,A.Rakhshandeh,J.K.Htoo,and C.F.M.de Lange,“Immune system stimulation increases the optimal dietary methionine to methionine plus cysteine ratio in growing pigs.”Journal of Animal Science 91,4188-4196(2013))。據報導，甲硫胺酸參與了豬的免疫系統，因為它在免疫攻擊期間增強了免疫相關細胞的增生。甲硫胺酸作為DNA甲基化和多胺合成的甲基供體。在本揭露中作為飼料添加劑施用的CR導致在仔豬血清中檢測到更高的甲硫胺酸，表示CR有助於維持仔豬於健康的免疫系統。

色胺酸是單胺能神經傳導物質血清素的即時前體，已被證明在斷奶豬中可以減少壓力賀爾蒙、降低攻擊性行為，並改善生長表現。CR用作飼料補充劑可提高仔豬血清中的色胺酸量，並有助於提供色胺酸的有利效應。

對於CR對碳水化合物代謝物的影響，鑑定了15種碳水化合物，其中7種發生了變化(增加>1.5倍或減少<0.5倍)，佔已鑑定碳水化合物的47%。在LCR組中，葡萄糖酸(gluconic acid)和甘露糖(mannose)分別上調1.5倍和1.9 倍，而β-龍膽二糖(β-gentiobiose)、甘油(glycerol)和木糖醇(xylitol)則低於CTL組。而相較於CTL組，高劑量CR飲食增加了甘露糖(2.3倍)量，但乳糖、蔗糖、β-龍膽二糖、甘油和木糖醇是降低的。

碳水化合物是生物體的主要能量來源。複雜的碳水化合物，被動物食用後，消化成簡單的單醣進行代謝和吸收，包括葡萄糖、果糖和半乳糖。在本實施例中，在飼餵CR的豬血清中發現，單醣(葡萄糖酸、甘露糖、阿洛酮糖(psicose)和塔格糖(tagatose))量升高，而雙醣(乳糖、蔗糖和β-龍膽二糖)量降低。在餵飼CR的豬隻中甘露糖顯著上調。甘露糖是一種己糖，可以轉化為葡萄糖進行分解代謝，或衍生自葡萄糖進行聚醣生物合成。在豬隻中，大多數碳水化合物在小腸中被水解成單醣，因此，碳水化合物的不同來源和含量會影響生理和胃腸道的健康。

在血清中檢測七種脂肪酸以了解CR對脂肪酸和其他代謝物的影響。其中，LCR組和HCR組的花生四烯酸(arachidonic acid)和油酸(oleic acid)(1.5至1.6倍)高於CTL組。肌苷(Inosine)，一種嘌呤核苷，在HCR組的豬血清中增加了1.9倍，而在LCR組中尿苷(uridine)減少。在血清樣本中檢測到的17種有機酸中，於LCR組中2-氨基己二酸(2-aminoadipic acid)、2-酮異己酸(2-ketoisocaproic acid)和3-羥異丁酸(3-hydroxyisobutyric acid)量升高(1.5至1.6倍)，而3,4-二羥基丁酸(3,4-dihydroxybutanoic acid)、苯甲酸(benzoic acid)及蘇糖酸(threonic acid)減少。

花生四烯酸是前列腺素E2(PGE2)的前體，被認為是促進骨形成、提高豬體重和局部骨礦物質密度的有效刺激劑之一(H.A.Weiler,“Dietary supplementation of arachidonic acid is associated with higher whole body weight and bone mineral density in growing pigs.”Pediatric Research 47,692-697(2000))。油酸，一種單元不飽和ω-9脂肪酸，也被發現顯著在餵飼CR的豬血清中增加。先前一項發現顯示，餵飼添加高油酸的花生給生長肥育豬導致總不飽和脂肪酸增加，這已被證明可以改善豬的生長表現和肉質。

先前的研究顯示，核苷酸在新生兒階段和免疫反應和微生物群有關。已被證明具有免疫治療活性的肌苷在CR餵養的豬中增加。補充LCR後，血清尿苷的消耗量增加，此已被證明有利於腸道發育和健康，從而改善早期斷奶豬的生長表現並降低腹瀉風險。

實施例8：CR治療的斷奶豬腸道微生物組群和血清初級代謝物之間的相關性

16S定序數據根據京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫註釋，以識別潛在相關的KEGG路徑，如下表6所示。在第1級預測中，相對豐度最高的途徑與代謝有關。進一步在代謝類別中進行第2級預測，碳水化合物代謝相對於其他代謝是最豐富的。由於GC/Q-TOF MS分析鑑定的47%的碳水化合物在餵飼LCR和HCR的動物中發生了顯著變化，因此藉由斯皮爾曼(Spearman)等級相關係數(r)分析了碳水化合物相關益生菌(屬的層級)和碳水化合物代謝物之間的功能相關性。

表6. KEGG數據庫對斷奶豬糞便微生物組群的功能分析

益生菌與碳水化合物(r

0.5)呈正相關，如圖8和下表7。乳酸桿菌屬顯著地與乙基葡萄糖苷(ethyl glucoside)、D-松糖(D-pinitol)、D-(+)-松二糖(D-(+)-turanose)、乳糖(lactose)、D-阿洛糖(D-allose)、葡萄糖酸(gluconic acid)及D-蘇 糖醇(D-threitol)此七種碳水化合物具有最強正相關(r=0.75-0.5)。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)是與D-蘇糖醇(r=0.77)和甘露醇(r=0.5)呈正相關的益生菌之一。Myo-肌醇(Myo-inositol)是一種作為激素和神經傳導物質的參與者的碳環糖，與瘤胃球菌屬_1(r=0.7)、巨球菌屬(r=0.53)、毛螺菌科(r=0.63)和嗜膽菌屬(r=0.59)呈顯著正相關。乳糖與韋榮氏球菌屬呈正相關(r=0.59)。這些數據顯示，餵飼CR的斷奶仔豬腸道微生物組群中各種益生菌的數量顯著增加，這對餵飼CR之動物的初級代謝中的碳水化合物代謝有正向影響。

表7. 益生菌和碳水化合物的斯皮爾曼(Spearman)等級相關係數(r

0.5)和相關性

實施例9：CR萃取物(CRE)和與薄荷精油(CREV)混合的CRE對斷奶豬生長表現的影響

斷奶仔豬從7週齡到11週齡分別飼餵基礎飲食或添加Digestoram、CRE和CREV的基礎飲食，持續4週。四組斷奶豬的生長表現總結於圖9A至9H中。受試斷奶仔豬的體型/大小和身體狀況如圖9A所示。餵飼CRE和CREV的動物比CTL組和Digestoram組的動物更強壯，體型更大。從5週齡到13週齡記錄各組中所有仔豬的平均體重(kg)(圖9B)和體重變化(%)(圖9C)。數據顯示，在以CRE或含CREV的飲食餵飼4週(11週齡)或將所有動物轉回基礎飲食兩週(13週齡)後，CRE和CREV組均呈現較CTL和Digestoram組更佳的生長表現，且具有統計學上意義(P<0.05)。在13週齡時，CRE、CREV、CTL和Digestoram組的體重變化分別相較於5週齡(100%)時各自的體重增加了363.9%、380.9%、316.9%和298.8%(圖9C)。

為計算四組斷奶豬的飼料轉換率(FCR)，記錄了飼餵4週(11週齡)後每頭豬的體重增加(kg)和飼料消費(kg/豬)。在CREV、CRE、CTL和Digestoram組中，餵食28天後斷奶豬的平均體重增加分別為9.7kg、8kg、6.7kg和5.5kg(圖99D)。雖然4組間的飼料消費(kg/豬)沒有差異(圖9E)，但相較於Digestoram(2.2)組和CTL(2.5)組，CRE(1.7)和CREV(1.6)組的FCR顯著降低(圖9F)。

另記錄了四組中受試斷奶豬的存活率或疾病導致的死亡(圖9G)。在4週的飼餵實驗中，CREV組的存活率最高(100%)，CRE、Digestoram和CTL 組的動物存活率分別為93.8%、90.7%和81.3%。總體而言，CRE和CREV在促進斷奶豬的生長表現、降低FCR、提高存活率或減少疾病引起的死亡方面優於商業植物產品Digestoram。

受試動物的血清TNF-α量

另檢測了從CREV、CRE、CTL和Digestoram四組收集的血清中TNF-α表現量。如圖9H所示，治療4週後，相較於CTL(135pg/mL)及Digestoram(128pg/mL)，CRE(98pg/mL)和CREV(86pg/mL)組血清中促發炎細胞因子TNF-α的濃度顯著降低。

斷奶豬CTL、Digestoram、CRE和CREV組的血液學參數

分析了斷奶仔豬四組(CTL、Digestoram、CRE和CREV)的血液學參數。全血中檢測到的所有細胞類型均在各組健康動物參照數據的正常範圍內(表8)。

表8. 斷奶豬CTL、Digestoram、CRE和CREV組的血液學參數

本說明書中引用和討論的所有參考文獻均以引用其整體併入本文，其程度與各參考文獻單獨引用併入之程度相同。

Claims (30)

1. 一種促進有其需要的動物生長之方法，包括：

   將包含有效量飼料補充劑之動物飼料組成物給予該動物，其中，該飼料補充劑包含昭和草(Crassocephalum rabens)或其萃取物以促進該動物之生長。
2. 如請求項1所述的方法，其中，該飼料補充劑與額外的草藥成分組合施用。
3. 如請求項2所述的方法，其中，該額外的草藥成分為薄荷精油。
4. 如請求項1所述的方法，其中，該促進生長包括調節該動物的腸道微生物組群。
5. 如請求項4所述的方法，其中，該調節腸道微生物組群包括減少該動物中致病性腸道菌叢的量。
6. 如請求項5所述的方法，其中，該致病性腸道菌叢係選自由梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、韋榮氏球菌屬(Veillonella spp.)、放射線桿菌屬(Actinobacillus spp.)、大腸桿菌-志賀氏菌屬(Escherichia_Shigella)、隱密桿菌屬(Trueperella spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、巴斯德氏菌屬(Pasteurella spp.)、螺旋桿菌屬(Helicobacter spp.)、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)、黴漿菌屬(Mycoplasma spp.)及嗜血桿菌屬(Haemophilus spp.)所組成群組中的至少一者。
7. 如請求項4所述的方法，其中，該調節腸道微生物組群包括增加該動物中益生菌叢的量。
8. 如請求項7所述的方法，其中，該益生菌叢係選自由乳桿菌屬(Lactobacillus spp.)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae family)、巨球型菌屬(Megasphaera spp.)、毛螺菌科(Lachnospiraceae family)、瘤胃球菌屬_1(Ruminococcus_1)、瘤胃球菌屬_2(Ruminococcus_2)、巨單胞菌屬(Megamonas spp.)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、擬桿菌屬(Bacteroides spp.)、Anaerostipes菌屬(Anaerostipes spp.)及另枝菌屬(Alistipes spp.)所組成群組中的至少一者。
9. 如請求項1所述的方法，其中，該促進生長包括減少該動物之腹瀉及腸道感染中至少一者的發生。
10. 如請求項9所述的方法，其中，該腹瀉及該腸道感染中的至少一者與選自以下群組之細菌病原體的至少一者有關：大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌屬(Salmonella spp.)、產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)、短螺旋菌屬(Brachyspira spp.)、耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)、勞森氏菌屬(Lawsonia spp.)及螺旋桿菌屬(Helicobacter spp.)。
11. 如請求項1所述的方法，其中，該促進生長包括促進該動物的體重增加。
12. 如請求項1所述的方法，其中，該促進生長包括降低飼料轉換率。
13. 如請求項1所述的方法，其中，該促進生長包括調節該動物的初級代謝。
14. 如請求項13所述的方法，其中，該初級代謝的調節包括至少增加或減少胺基酸、脂肪酸、碳水化合物及有機酸之至少一者或其任意之組合的量。
15. 如請求項1所述的方法，其中，該動物飼料組成物增進該動物的存活率。
16. 如請求項1所述的方法，其中，該動物飼料組成物增強該動物的抗發炎反應。
17. 如請求項16所述的方法，其中，該動物飼料組成物降低TNF-α、糞便IgA之至少一者或其組合的量。
18. 如請求項1所述的方法，其中，該動物為斷奶豬。
19. 如請求項1所述的方法，其中，該動物為成豬。
20. 如請求項1所述的方法，其中，該昭和草或其萃取物為粉末形式。
21. 如請求項1所述的方法，其中，該昭和草或其萃取物在該動物飼料組成物中佔約0.001wt%至約5wt%。
22. 一種於有其需要的動物中預防或治療由豬繁殖與呼吸症候群病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起之疾病的方法，包括：

    將包含有效量飼料補充劑的動物飼料組成物給予該動物，其中，該飼料補充劑包含昭和草或其萃取物以促進該動物之生長。
23. 如請求項22所述的方法，其中，該飼料補充劑與額外的草藥成分組合施用。
24. 如請求項23所述的方法，其中，該額外的草藥成分為薄荷精油。
25. 如請求項22所述的方法，其中，該動物飼料組成物增進該動物的存活率。
26. 一種動物飼料組成物，其包括含有昭和草或其萃取物的飼料補充劑。
27. 如請求項26所述的動物飼料組成物，其中，該昭和草或該昭和草萃取物為粉末形式。
28. 如請求項26所述的動物飼料組成物，另包括額外的草藥成分。
29. 如請求項28所述的動物飼料組成物，其中，該額外的草藥成分為薄荷精油。
30. 如請求項26所述的動物飼料組成物，其中，該昭和草或其萃取物在該動物飼料組成物中佔約0.001wt%至約5wt%。

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