JP6033255B2

JP6033255B2 - ガラクト脂質を豊富に含む植物抽出物及びその使用

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Publication number: JP6033255B2
Application number: JP2014113980A
Authority: JP
Inventors: 徐麗芬; 馮家華; カルメラアパヤマリア
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2014-06-02
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2034-06-02
Also published as: TWI558403B; EP2810651A1; CN104208114A; CN104208114B; JP2014234388A; EP2810651B1; ES2759878T3; TW201446254A; US20140356301A1

Description

本発明は、ガラクト脂質の植物抽出物に関し、特にベニバナボロギク（昭和草，Crassocephalum crepidioides）、タカサゴサンシチソウ（白鳳菜，Gynura divaricata subsp. formosana）又はマーダニアブラクテアタ（大苞水竹葉，Murdannia bracteata)から抽出することによって得られた植物抽出物に関する。本発明は、当該植物抽出物を、劇症肝炎、敗血症及びその適応症を予防或いは治療する医薬組成物及び美白剤の製造に用いる用途に関する。

近年、植物由来の天然成分（植物性化合物）が様々な治療効果を有することが報告されている。以下、ベニバナボロギク、タカサゴサンシチソウ及びマーダニアブラクテアタなど台湾で普通に見られる植物３つについて紹介する。
ベニバナボロギク（ＣｒａｓｓｏｃｅｐｈａｌｕｍｒａｂｅｎｓＳ．Ｍｏｏｒｅ，略称はＣＲ）は、台湾では普通に見られる野菜であり、驚異的な繁殖力及び適応能力を有する。ベニバナボロギクは、キク科ベニバナボロギク属であり、シュンギクに似た香りがあり、一年中採集でき、特に花が咲く前に採集すれば、味が良い。解熱、健胃、消腫、腹痛の治療などの薬効を有する。

タカサゴサンシチソウ（Ｇｙｎｕｒａｄｉｖａｒｉｃａｔａｓｕｂｓｐ．Ｆｏｒｍｏｓａｎａ，，略称ＧＤ）は、別名で白紅菜であり、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）サンシチソウ属（Ｇｙｎｕｒａ）の薬用植物である。台湾の固有植物種で、台湾の臨海地区に分布して、ときとき低い海抜の山岳地帯に見られている。タカサゴサンシチソウは、柔らかい茎葉が食べられる。消炎、解熱、解毒、利尿、血圧降下など薬効を有する。

マーダニアブラクテアタ（Ｍｕｒｄａｎｎｉａｂｒａｃｔｅａｔａ（Ｃ．Ｂ．Ｃｌａｒｋｅ）Ｊ．Ｋ．ＭｏｒｔｏｎｅｘＤ．Ｙ．Ｈｏｎｇ，略称ＭＢ）は、ツユクサ科（Commelinaceae）イボクサ属の多年生の草本植物であり、山谷の川辺、水際及び砂地で多く見られている。マーダニアブラクテアタは、薬用価値を有し、去痰、痔、頸部リンパ節疾患による慢性感染症及び毛嚢、皮脂や汗腺の急性化膿性感染症の治療に用いられる。

しかしながら、上記３つの植物における活性成分及びその作用メカニズムについて、依然として完全に理解していない。しかも、上記３つの植物から、肝炎、敗血症及びその適応症を予防或いは治療することができ、かつ美白効果を有する抽出物又は純化された化合物が得られることについて、いずれの文献資料又は特許も記載されていない。

一方、自然界に大量に存在するガラクト脂質は、いわゆるグリセロ糖脂質（ｇｌｙｃｏｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄ）である。その構造は、グリセロールのｓｎ−１及びｓｎ−２に、それぞれエステル化された２つの脂肪酸が存在し、ｓｎ−３に１〜４つのガラクトースが結合する。多くの天然又は合成のグリセロ糖脂質は、特定の生物学的活性を有し、抗ウイルス、抗腫瘍、抗炎症作用及び免疫抑制等の活性を含む。しかし、この種類の化合物が他の適応症に対する効果及び生物活性の分子メカニズムは、まだ明らかでない。

本発明は上記に鑑みてなされたものであって、植物サンプルを水または低級アルコール類で抽出して、低級エステルで分配抽出することによって低級エステルの抽出物が得られ、さらに、前記低級エステルの抽出物をアルコール溶離液で溶出することによって、ガラクト脂質を豊富に含む溶出分を得ることができ、前記植物サンプルは、タカサゴサンシチソウ、マーダニアブラクテアタ及びベニバナボロギクからなる群から選択され、前記アルコール類溶離液におけるアルコール類は、前記溶離液に対する体積率が５％〜２０％である、ガラクト脂質を豊富に含む植物抽出物を提供することを目的とする。

一実施態様において、低級アルコール類は、メタノールまたはエタノールであってもよい。
一実施態様において、低級アルコール類は、酢酸エチルであってもよい。
一実施態様において、上記植物抽出物は、植物抽出物のクロマトグラムをさらに含んでもよい。例えば、植物抽出物は、タカサゴサンシチソウから抽出される場合、タカサゴサンシチソウのフィンガープリントクロマトグラムをさらに含んでもよい。また、タカサゴサンシチソウから抽出される場合、タカサゴサンシチソウのフィンガープリントクロマトグラムをさらに含んでもよい。

一具体的な実施態様において、上記アルコール類溶離液におけるアルコール類の割合は、約５〜１５％である。もう一つの具体的な実施態様において、上記アルコール類溶離液におけるアルコール類の割合は、約５〜１０％である。他の具体的な実施態様において、ベニバナボロギクに用いる上記アルコール類溶離液におけるアルコール類の割合は、約１０〜１５％であってもよい。

一実施態様において、アルコール溶離液は、メタノールとジクロロメタン、メタノールと水、メタノールとアセトニトリル、またはメタノールとアセトンを含んでもよい。

一具体的な実施態様において、メタノール溶離液におけるジクロロメタンとメタノールとの比は９：１である。当該比のメタノール溶離液は、タカサゴサンシチソウから得られた低級エステルの抽出物を溶出することに用いられる。

一具体的な実施態様において、メタノール溶離液におけるジクロロメタンとメタノールとの比は１２：１である。当該比のメタノール溶離液は、マーダニアブラクテアタから得られた低級エステルの抽出物を溶出することに用いられる。

一実施態様において、ガラクト脂質を豊富に含む溶出分は、さらに、高速液体クロマトグラフィー法(Reversed phase HPLC)によって純化されることによって、生物活性溶出分を得ることができる。
一実施態様において、上記生物活性溶出分は、図３に示すベニバナボロギクの高性能液体クロマトグラフィーを含んでもよいが、それに限定されない。

一実施態様において、上記ガラクト脂質を豊富に含む溶出分をアルコール溶離液によって溶出することによって、上記生物活性溶出分を得ることができ、当該アルコール類溶離液におけるアルコール類は、当該溶離液に対する体積率が７０％〜１００％である。

一実施態様において、上記ガラクト脂質を豊富に含む溶出分は、1,2-ジ-O-α-リノレオイル-3-O-β-ガラクトピラノシル-sn-グリセロール(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)を含む溶出分であってもよい。

本発明のもう一つの目的は、生物活性成分として予防又は治療において、植物抽出物又はその精製物の有効量と、医薬・保健又は食品的に許容される担体とを含み、劇症肝炎を予防・治療し、医薬・保健又は栄養添加用の組成物を提供することにある。
一実施態様において、精製物はｄＬＧＧであってもよい。

本発明のもう一つの目的は、生物活性成分として予防又は治療において、植物抽出物又はその精製物の有効量と、医薬・保健又は食品的に許容される担体とを含み、敗血症及びその適応症を予防・治療し、医薬・保健又は栄養添加用の組成物を提供することにある。

一実施態様において、精製物はｄＬＧＧであってもよい。
一実施態様において、適応症は、敗血症誘発急性腎障害であってもよいが、それに限定されない。

本発明の他の目的は、生物活性成分として予防又は治療において、植物抽出物又はその精製物の有効量と、医薬的，保健的又は食品的に許容される担体とを含み、美白用の組成物を提供することにある。
一実施態様において、精製物はｄＬＧＧであってもよい。

タカサゴサンシチソウにおけるガラクト脂質を豊富に含む溶出分（ＧＤＥ）のフィンガープリントクロマトグラムである。測定によって、ｄＬＧＧは、当該溶出分の主成分である。（Ａ）は、生物活性溶出分ＧＤＥのトータルイオンクロマトグラムである。（Ｂ）は、溶出分ＧＤＥにおいて、５つの主なモノガラクトピラノシルジアシルグリセロール化合物のＡＰＣＩ−ＭＳデータであり、シルジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及び脂肪酸基に対応するＮａ^＋付加物（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）及びイオンフラグメントのｍ／ｚを示す。（Ｃ）は、ＧＤＥにおけるモノガラクトピラノシルジアシルグリセロール成分（１−５）の化学構造を示す。マーダニアブラクテアタにおけるガラクト脂質を豊富に含む溶出分（ＭＢＥ）のフィンガープリントクロマトグラムである。測定によって、ｄＬＧＧは、当該溶出分の主成分である。（Ａ）は、生物活性溶出分ＭＢＥのトータルイオンクロマトグラムである。（Ｂ）は、溶出分BMEにおいて、５つの主なモノガラクトピラノシルジアシルグリセロール化合物のＡＰＣＩ−ＭＳデータであり、シルジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及び脂肪酸基に対応するＮａ^＋付加物（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）及びイオンフラグメントのｍ／ｚを示す。（Ｃ）は、ＭＢＥにおけるモノガラクトピラノシルジアシルグリセロール成分（１−７）の化学構造を示す。ベニバナボロギクの酢酸エチル溶出分（ＣＲ−ＥＡ）の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を示す。マーダニアブラクテアタ（ＭＢＥ）及びタカサゴサンシチソウ（ＧＤＥ）から抽出されたｄＬＧＧガラクト脂質を豊富に含む溶出分が、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによってマウスに肝不全及び急性劇症肝炎を誘発させることに対する有効性データを示す。実験事実から、マーダニアブラクテアタ（ＭＢＥ）及びタカサゴサンシチソウ（ＧＤＥ）から抽出されたｄＬＧＧガラクト脂質を豊富に含む溶出分は、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発させるマウスの肝不全及び急性劇症肝炎の緩和に有効性があることを確認した。（Ａ）は、左から右まで、それぞれ担体（ｖｅｈｉｃｌｅ、黒点「・」で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウス群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウスを肝臓保護薬ＳＭで治療する群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋、Ｐｏｓｔ−ＳＭ＋で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウスを植物抽出物ＧＤＥで治療する群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋、Ｐｏｓｔ−ＧＤＥ＋表示）において、血清中におけるアラニンアミノ基転移酵素(alanine aminotransferase，ALT)の含有量を表示する。各治療群のマウス６匹の試験結果の平均値±標準誤差でデータを表示する。異なるアルファベットで被験群の顕著な差異を呈する（Ｐ＜０．０５）。図には、符号＋はある特定の薬物が投与されることを表し、符号−はある特定の薬物が投与されないことを表す。（Ｂ）健康なマウスと未治療又は治療後マウスの肝臓切片のＨ＆Ｅ染色及び組織構造図と結果を示す。ｄＬＧＧを治療剤として、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発されたマウスの急性劇症肝炎に対する効果を示す。（Ａ）は、左から右まで、それぞれ担体（ｖｅｈｉｃｌｅ、−で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウス群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウスをＳＭで治療する群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋、Ｐｏｓｔ−ＳＭ＋で表している）、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激されたマウスをｄＬＧＧで治療する群（ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ＋、Ｐｏｓｔ−dLGG＋表示）において、血清中におけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素(aspartate aminotransferase, AST)及びALTの含有量を表示する。各治療群のマウス６匹の試験結果の平均値±標準誤差でデータを表示する。異なるアルファベットで被験群の顕著な差異を呈する（Ｐ＜０．０５）。（Ｂ）は、健康なマウスと未治療又は治療後マウスの肝臓切片のＨ＆Ｅ染色及び組織学を示す。（Ｃ）は、アポトーシス細胞（TUNEL）の検出結果を示す。それぞれ健康，損傷及び各治療群の代表画像を示す。褐色を呈する細胞は、TUNEL陽性アポトーシス細胞である。ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及びシンバスタチン(simvastatin, simva)がＬＰＳによって誘発されたマウスの炎症及び敗血症に対する予防及び治療効果を示す。異なる治療群において、血清中のＩＬ−６（Ａ）及びＴＮＦ−α（Ｂ）の含有量を示す。平均値±標準誤差で（ｎ＝４）データを表す。異なるアルファベットで被験群の顕著な差異を呈する（Ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）は、肝臓切片のマクロファージ（Ｆ４／８０）の免疫組織化学法による染色結果を示し、マクロファージ浸潤を呈する。Ｆ４／８０陽性細胞を測定した平均強度を、治療群と未治療群との定量的比較とする。図は、代表画像を呈する。ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及びシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ，ｓｉｍｖａ）がＬＰＳによって誘発されたマウスの炎症及び敗血症に対する予防及び治療効果を示す。異なる治療群において、血清中のＡＳＴ（Ａ）andＡＬＴ（Ｂ）の含有量を示す。平均値±標準誤差で（ｎ＝４）データを呈する。異なるアルファベットで被験群の顕著な差異を呈する（Ｐ＜０．０５，ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）は、Ｈ＆Ｅ染色法によって染色された肝臓切片を示し、異なる治療群において、正常マウスとＬＰＳによって刺激されたマウスとの肝臓組織学的結果及び赤血球と炎症細胞浸潤を呈する。図は、代表画像を呈する。ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及びシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ，ｓｉｍｖａ）がＬＰＳによって誘発されたマウスの炎症及び敗血症に対する予防及び治療効果を示す。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色法によって染色された腎臓切片を示し、異なる治療群において、正常マウスとＬＰＳによって刺激されたマウスとの腎臓組織学的結果を呈する。（Ｂ）は、腎臓切片のマクロファージ（Ｆ４／８０）の免疫組織化学法による染色結果を示し、腎臓のマクロファージ浸潤を呈する。Ｆ４／８０陽性細胞を測定した平均強度を、治療群と未治療群との定量的比較とする。図は、代表画像を呈する。ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及びシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ，ｓｉｍｖａ）はＬＰＳに起因するいくつかの肝臓組織のタンパク質過剰発現に緩和効果があることを示す。こられのタンパク質は、低酸素の誘発及び炎症の生成と敗血症に関連する脂質メディエーターと関係する。（Ａ）ＬＰＳに起因するＨＩＦ−１α（低酸素誘導因子−１α，hypoxia inducible factor-1α）の発見量増加は、ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及び対照群の薬物ｓｉｍｖａの治療によって緩和されることを示す。（Ｂ）ＣＲ−ＥＡ、ｄＬＧＧ及び対照群の薬物ｓｉｍｖａの治療によってＰＰＡＲ−δの発見量を低減することを確認した。（C）図示したＨＩＦ−１α及びＰＰＡＲ−δ発見量の平均強度を、治療群間の定量的比較とする。ベニバナボロギクＥＡ溶出分又はベニバナボロギクＥＡ溶出分から分離された単一化合物ｄＬＧＧによる色素除去効果を示す。（Ａ）は、コウジ酸（ＫＡ）５０μｇ／ｍＬ、トータル沸騰水粗抽出物（ＣＲ−Ｗ−ＥＡ）からのＥＡ溶出分２５μｇ／ｍＬ又はトータルエタノール粗抽出物（ＣＲ−Ｅｔ−ＥＡ）からのＥＡ溶出分５０μｇ／ｍＬでＢ１６メラノーマ細胞を７２時間処理した後の色を示す比較図である。（Ｂ）は、４５μM ｄＬＧＧでＢ１６メラノーマ細胞を１２−４８時間処理した後、色素除去効果の比較を示す。（Ｃ）は、ウェスタンブロット法で担体（対照群）又は４５μM ｄＬＧＧで処理した後、メラニンの生成に関与する小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＭＩＴＦ）及びチロシナーゼのＢ１６細胞におけるチロシナーゼの発見の分析を示す。

本願における「有効量、予防における有効量及び/または治療における有効量」は予め発生する特定効果、予防及び/または治療効果における需要活性成分（抽出物または化合物）の量（組成物内での占用重量パーセンテージ）を示す。本発明は当業者にとって理解すべきであり、該有効量は特定の効果、予防及び/または治療における疾病種類と投薬方式などの原因で異なる。一般的に言えば、活性成分の組成物での量は該組成物の重量で約1%〜100%を占め、好ましくは約30%〜100%を占める。

本願における「医薬、保健または食品上で許可される担体」はいかなる標準医薬、保健または食品担体を示す。いわゆる担体は固態または液態で、医薬、栄養添加または保健における組成物の必要とする剤型によって決められる。固態担体として、例えば乳糖、蔗糖、ゼラチンとアガールを含む。液態担体として、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、水、グリセリンとエタノールを含む。
本願における「純化物精製物」は素材または粗製物（例えば、本願の植物抽出物）をいかなる精製手順で精製された精製産物を示す。

本発明の実施形態は以下により説明されるがこれに制限されない。本発明の上記の説明及び他の目的、特徴及び利点は以下の説明及び図面により更に詳細に説明される。

１、材料及び方法
（１）試薬と抗体
シグマケミカル社（Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からＤ−ガラクトサミン N（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅＮ，略称はＤ−ＧａｌＮ）、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，略称はＬＰＳ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）、シンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、コウジ酸（ｋｏｊｉｃａｃｉｄ，略称はＫＡ）及びジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，略称はＤＭＳＯ）を購入した。染色済みのタンパク質標準液（Ｂｉｏｍａｎ社，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量標準溶液を評価した。本発明の実施例において、抗チロシナーゼ、メラニン生成に関与する小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＭＩＴＦ）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の一次抗体及びＦ４／８０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）も使用する。組換えマウスＴＮＦ−α及びマウスＴＮＦ−α及びＩＬ−６に用いるＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から由来する。ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＵＫ）から購入した市販キットを使用して、血清中におけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）の活性を測定した。他の化学物質及び溶剤について、全て試薬級又はＨＰＬＣ級のものを使用する。

（２）細胞培養
Ｂ１６メラノーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より入手した。Ｂ１６メラノーマ細胞株は、１０％の加熱により失活された牛胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で成長し、当該細胞株を、３７°Ｃ、湿度５％のＣＯ_２インキュベーターで培養した。

（３）脱色試験
Ｂ１６メラノーマ細胞を、上記細胞培養と同じ条件で、１０ｃｍ培養プレートに１ｘ１０^５細胞／ウェルの初期密度で播種した。１２時間播種した後、細胞を単体ＤＭＳＯ、コウジ酸（ＫＡ）、ＣＲの水抽出物及びエタノール粗抽出物の酢酸エチル（ＥＡ）溶出分（Ｈｏｕｅｔａｌ．，２００７）によって７２時間処理した後、遠心分離で細胞を回収し、かつ回収された細胞の色を目視で評価した。もう一つの実験において、単一化合物ｄＬＧＧの色素除去効果について、細胞を同じ手順で処理し、異なる時点で観察と評価を行った。

（４）動物
国立実験動物センター（台北，台湾）によって提供されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス又はＩＣＲ雄マウス（４週齢）を使用した。動物を１２時間明／暗の固定周期にて２２±２℃で飼育し、標準実験用飼料及び蒸留水を自由に摂取させた。本発明の実施例は、機関が定めた操作ガイドに基づいて行われるとともに、台湾中央研究院の動物管理使用委員会によって承認された。

（５）植物抽出物とｄＬＧＧの調製
Ｈｏｕｅｔａｌ（２００７）（ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ６７，６９０７−６９１５）より公開された操作方法に基づいて若干の修正を加えて、ベニバナボロギク（ＣＲ）、マーダニアブラクテアタ（ＭＢ）及びタカサゴサンシチソウ（ＧＤ）の抽出物を調製した。室温で重量比２−3倍の９５％エタノール９５％により約1５．０Ｋｇの新鮮な全草を抽出した。酢酸エチルによりトータルエタノール粗抽出物（Ｔｏｔａｌｅｔｈａｎｏｌｉｃｅｘｔｒａｃｔ）を分配し、酢酸エチル（ＥＡ）溶出分を生成した（ＧＤ：８．６ｋｇ；ＭＢ：８．９ｋｇ）。さらに、ジクロロメタン−メタノールによって溶出された（溶出割合は、タカサゴサンシチソウのメタノール／ジクロロメタンが１／９、マーダニアブラクテアタのメタノール／ジクロロメタンが１／１２、ベニバナボロギクのメタノール／ジクロロメタンが１／９である）シリカゲルカラムによってＧＤ及びＭＢのＥＡ溶出分を分離し、それぞれ１０群の亜分画（ｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎｓ）を生成した。ＧＤについて、スクリーニング試験後、９５％のエタノールによって溶出されたＤｉａｉｏｎＨＰ−２０のゲルカラムを使用して、亜分画７（８１７ｇ）をさらに精製し、モノガラクトピラノシルジアシルグリセロールを豊富に含む溶出分（ＧＤＥ，２５３．３ｇ）を得た。ＭＢについて、スクリーニング試験後、９５％のエタノールによって溶出されたＤｉａｉｏｎＨＰ−２０のゲルカラムを使用して、亜分画６（１．０６ｋｇ）をさらに精製した（ＭＢＥ，３６０．１ｇ）。

ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＡＰＣＩ−Ｍを使用して、上記溶出分を豊富に含むフィンガープリントクロマトグラムを測定した。ＢｒｕｋｅｒＡＤＶＡＮＣＥ５００ＡＶＮＭＲ分光計を使用して、^１Ｈ及び^１３Ｃの核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＮＭＲ）を行った。また、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ／ＬＣＱＡｄｖａｎｔａｇｅ（Ｗａｌｔｈａｍ）質量分析計を使用して、陽イオンモードで大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ／ＭＳ）を行うことによって、化合物構造の確認を行った。

そして、下記カラムと溶出条件で逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行うことによって、ベニバナボロギクの酢酸エチル溶出分（ＣＲ−ＥＡ）及びそのクロマトグラムを得た。ＲＰ−ＨＰＬＣセミ分取カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ５μｍ，Ｃ１８，２５０ｘ４．６ｍｍ）を、９８％メタノール、１ｍＬ／ｍｉｎ流速で定組成溶離（ｉｓｏｃｒａｔｉｃｅｌｕｔｉｏｎ）を行った。高性能液体クロマトグラフィーに呈しているｄＬＧＧを，生物活性ＥＡ溶出分中の標的化合物とする。
ＧＤＥ又はＭＢＥのガラクト脂質を豊富に含む溶出分を、同じ操作手順でＧＤＥ又はＭＢＥの高性能液体クロマトグラフィー（ジクロロメタンとメタノールとの比が約８／２〜９／１であるジクロロメタン−メタノール溶離液によって抽出した）を得た。

（６）ｄＬＧＧ又はｄＬＧＧを含む植物抽出物がＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発されたマウスの急性劇症肝炎に対する保護効果の試験
ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発された劇症肝炎中に、ベニバナボロギクから分離された化合物ｄＬＧＧによる生体内での肝臓保護効果を観察して、肝臓保護薬シリマリン（ＳＭ）と比較する。マウスを４群（各群ｎ＝６）に任意的に分けて、下記の試験を行う。４群のマウスに、それぞれ担体、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ、５０ｍｇ／ｋｇのシリマリン（Ｐｏｓｔ−ＳＭ５０）及び１０ｍｇ／ｋｇのｄＬＧＧ（ｐｏｓｔ−ｄＬＧＧ１０）の全てを、腹腔内に注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ，ｉ．ｐ．）する方法で行った。マウスに上記の５００ｎｇのＬＰＳ及び２５ｍｇのＤ−ＧａｌＮ含有の２５０μＬの食塩水によって１時間処理した後（Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，２０１２）、ｄＬＧＧ及びシリマリンを投与した。また、他の２群のマウスを、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって刺激する前に、ｄＬＧＧ又はＳＭで３日間連続処理し、ｄＬＧＧのＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発された劇症肝炎に対する予防効果を試験した。ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮを注射した８時間後、眼窩静脈叢採血法（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって血液サンプルを収集し、それから、全てのマウスを犠牲させて、血液サンプル及び肝臓組織を収集した。

（７）ｄＬＧＧ又はｄＬＧＧを含む植物抽出物のＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発されたマウスの敗血症に対する保護又は治療の試験
ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発された急性炎症及びＬＰＳによる敗血性ショックによって、ｄＬＧＧ又はｄＬＧＧを含有するベニバナボロギク抽出物の治療効果を評価し、かつシンバスタチン（ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ，ｓｉｍｖａ）を陽性対照群とする。マウスを、それぞれ、担体，１０ｍｇ／ｋｇＬＰＳ，１０ｍｇ／ｋｇシンバスタチン（Ｓｉｍｖａ１０），ベニバナボロギクＥＡ抽出物１０ｍｇ／ｋｇ（ＣＲ−ＥＡ１０），ベニバナボロギクＥＡ抽出物５０ｍｇ／ｋｇ（ＣＲ−ＥＡ５０），ｄＬＧＧ５ｍｇ／ｋｇ（ｄＬＧＧ５）及びｄＬＧＧ２５ｍｇ／ｋｇ（ｄＬＧＧ２５）の異なる処理群に任意的に分ける。植物成分又は対照群の薬物を、ＬＰＳの投与１時間前に注射処理した。もう１群の動物を単独に２５ｍｇ／ｋｇのｄＬＧＧ（ｄＬＧＧ２５ｏｎｌｙ）で処理した。２４時間後、全ての群を犠牲にさせた。犠牲にさせる直前に、眼窩静脈叢採血法（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌｂｌｅｅｄｉｎｇ）によって血液サンプルを収集し、かつ器官組織を直ちに収集した。

（８）組織学及び免疫組織化学
肝臓、肺臓及び腎臓組織を、１０％ホルマリン緩衝液中で固定してから、パラフィン中に包埋した。パラフィン包埋されたサンプルを片（８−μｍ）に切って、かつヘマトキシリン−エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ，略称はＨ＆Ｅ）で染色を行った。また、パラフィン包埋された肝臓と肺臓の片（厚さ４−μｍ）に切って加熱固定し、かつキシレンを用いてパラフィンを除去し、エタノールで再水和し、最後に蒸留水で洗浄した。最後、標的抗原賦活液を含む抗原賦活化装置ＤｅｃｌｏａｋｉｎｇＣｈａｍｂｅｒ（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）中で浸漬し、抗原賦活化を行った。

細胞レベル（ｉｎｓｉｔｕ）でのアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ）の検出方法は、供給業者の操作手順（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に基づいて行った。その原理は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を利用してヌクレオチド配列に作用することによって、デオキシアデノシン三リン酸に形成された断片を末端標識（ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ-ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）した。最後、標識されたＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を、ソフトＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）で分析した。

肝臓、肺及び腎臓組織の免疫組織化学染色の手順について、サンプルをＦ４／８０を含有する一次抗体溶液中で一晩放置した。次いで、洗浄後、蛍光標識二次抗体の反応液体中でサンプル組織を行った。マクロファージ浸潤（陽性染色細胞）は、ソフトＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎで蛍光画像を捕捉して分析した。

（９）ウェスタンブロット法
各マウス肝臓組織（０．１ｇ）に、ガラスビーズを適当量添加し、それをホモジナイザー（ＭＭ３０１，Ｒｅｔｓｃｈ，Ｈａａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって２分間均質化し、０．４ｍＬの細胞溶解緩衝液を添加して抽出し、かつ４℃、１５，０００×ｇで３０分間（Ｓｈｙｕｒｅｔａｌ．，２００８）遠心分離を行った。上清液を収集し、サンプルの総タンパク濃度を、ＤＣプロテインアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。タンパク質を５％−２０％グラディエントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離した後、電気泳動ブロッティングし、ブロッティング膜を、特定タンパク質を抵抗するモノクローナル抗体で免疫染色を行った。最後、強化化学発光試薬（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって発色させた。
細胞タンパク質は、従来の方法（Ｃｈｉａｎｇｅｔａｌ．，２００５）を参照して調製された。タンパク質含量をブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。

（１０）血清中のＡＳＴ及びＡＬＴ活性の測定
被験マウスの血液サンプルを、４℃、１，４００×ｇで１５分間遠心分離し、血清を分離した。ＲａｎｄｏｘＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ＵＫ）から購入した市販キットを用いて、血清中におけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）の活性を測定した。

（１１）血清中のＩＬ−６及びＴＮＦ−α活性の測定
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した市販キットを用いて、マウス血清のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ，ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ，ＴＮＦ−α）の含量を測定した。

（１２）統計学的分析
全てのデータは、平均値±標準誤差（同上）で表される。分散分析（ＡＮＯＶＡ）で差異を比較した。異なるアルファベットで被験群の顕著な差異を表す。Ｐ＜０．０５であれば、統計学的に顕著な差異があると考えられる。

２．結果
（１）タカサゴサンシチソウ、マーダニアブラクテアタ及びベニバナボロギク等３つの食用又は薬用植物のフィンガープリントクロマトグラム
ＲＰ−ＨＰＬＣ／大気圧化学イオン化質量分析計（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃｃｈｅｍｉｃａｌｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＡＣＰＩ−ＭＳ）を用いて、生物活性溶出分（ＧＤＥ及びＭＢＥ）のフィンガープリントクロマトグラムを確立し、かつＧＤＥ及びＭＢＥにおけるガラクト脂質を豊富に含む溶出分の全てのモノガラクトピラノシルジアシルグリセロール成分を鑑定した。１，２−ジ−Ｏ−α−リノレオイル−３−Ｏ−β−ガラクトピラノシル−ｓｎ−グリセロール（１，２，ｄｉ−Ｏ−α−ｌｉｎｏｌｅｎｏｙｌ−３−Ｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｄＬＧＧ）はタカサゴサンシチソウ（図１を参照）、マーダニアブラクテアタ（図２を参照）の主成分であることが鑑定された。ベニバナボロギクの酢酸エチル溶出分（ＣＲ−ＥＡ）のクロマトグラム（図３を参照）は、逆相ＨＰＬＣ法（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって得られた。高性能液体クロマトグラフィーに呈しているｄＬＧＧを，生物活性ＥＡ溶出分（ＣＲ−ＥＡ）中の標的化合物とする。

図１（Ａ）及び図２（Ａ）は、それぞれＧＤＥ及びＭＢＥのトータルイオンクロマトグラム（ｔｏｔａｌｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）中の化合物ピーク分布を示す。脂肪酸基を有するＧＤＥが５つのガラクト脂質を有し、その構成が１８：３／１８：３（ｄＬＧＧ）、１８：４／１８：４（１）、１８：４／１８：３（２）、１８：２／１８：３（４）、１６：０／１８：３（５）であることを識別した。また、ＭＢＥ中の７つのガラクト脂質の脂肪酸基は、その構成が１８：３／１８：３（ｄＬＧＧ）、１８：４／１８：４（１）、１８：４／１８：３（２）、１８：２／１８：３（４）、１６：０／１８：３（５）、１８：１／１８：３（６）以及１６：０／１８：２（７）であることを識別した。しかし、化合物２，４，５，６及び７の２つの脂肪酸基のｓｎ位置を更に確認していなかった。

図１（Ｂ）及び図２（Ｂ）は、ＡＣＰＩ−ＭＳにおいて、シルジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及び脂肪酸基に対応するＮａ^＋付加物（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）及びイオンフラグメントのｍ／ｚを示す表である。また、図１（Ｃ）及び図２（Ｃ）は、それぞれＧＤＥ及びＭＢＥにおけるモノガラクトピラノシルジアシルグリセロールの化学構造を示す。有効成分を有する主な化合物ｄＬＧＧ的含量は、それぞれ８８．１％（タカサゴサンシチソウ）及び７８．９％（マーダニアブラクテアタ）である。測定によって、ベニバナボロギクの生物活性溶出分におけるｄＬＧＧ的含量は６５．７％（Ｈｏｕｅｔａｌ．，２００７）である。本発明において、ｄＬＧＧを、３つの医学用植物抽出物から抽出されたガラクト脂質を豊富に含む溶出分の標的化合物とすることから開発されたフィンガープリントクロマトグラム方法は、バッチ調製において生物活性溶出分の一貫性の確保に用いられるとともに、品質を保証するためのルーチン操作手順に用いられる。

（２）ｄＬＧＧを、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発されたマウスの肝不全及び急性劇症肝炎に対する治療剤とする
劇症肝不全（Ｆｕｌｍｉｎａｎｔｈｅｐａｔｉｃｆａｉｌｕｒｅ，ＦＨＦ）は、急性肝不全の同義語であり、急激な肝機能に異常をもたらす肝疾患と関連し、壊滅的な結果（ＳａｓｓａｎｄＳｈａｋｉｌ，２００５）になる可能性が高く、命に脅威のある病気である。これまでに唯一の治療法（Ｒｕｓｓｏ＆Ｐａｒｏｌａ，２０１１）は肝移植である。

ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによってマウスに急性劇症肝炎を誘発させた動物モデルは、臨床的に観察されるＦＨＦ段階式反応を効果的にシミュレートすることができ、相関研究に広く用いられている（Ｋｏｓａｉｅｔａｌ，１９９９）。本発明は、このようなモデルでｄＬＧＧ（ベニバナボロギク、タカサゴサンシチソウ及びマーダニアブラクテアタから分離された生物活性成分である）、及びｄＬＧＧのガラクト脂質を豊富に含む溶出分ＧＤＥ及びＭＢＥが肝不全に用いる有効性をを評価した。

同時に、市販の肝臓保護薬シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ，ＳＭ）を対照群とする。マウスにＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮを注射して１時間経過した後、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）方法で担体対照群に０．５％ＤＭＳＯ、ｄＬＧＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＳＭ（５０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。血清中におけるアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＡＬＴ）肝不全又は機能異常の臨床的指標とした２つの活性を測定するように、異なる群のマウスの血清を収集した。

図４及び図５に示すように、ガラクト脂質を豊富に含む溶出分ＧＤＥ、ＭＢＥ及び精製物ｄＬＧＧからの活性の評価結果を示す。図４（Ａ）は、ＧＤＥ、ＭＢＥ及び肝臓保護薬ＳＭが、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによってマウスを刺激されることで２倍になった血清中でのＡＬＴ含有量を、効果的に減らすことを示す。
図４（Ｂ）に示すように、Ｈ＆Ｅ染色法で組織病理学による試験を行った結果により、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮ-によって刺激されるマウス体内に、肝小葉への炎症細胞の浸潤、組織破壊及び肝臓組織中における赤血球の流入（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｉｎｆｌｕｘ）などの現象が、処理群で顕著に減少されていることを観察した。

図５（Ａ）に示すように、誘発された劇症肝炎をｄＬＧＧで処理することは、肝臓保護薬ＳＭの効果を達成することができ、マウス体内のＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮにより誘発された血清中のＡＳＴ、ＡＬＴの増加量を明らかに抑制することができる（−２．４倍）。また、図５（Ｂ）に示すように、LPS/D-GalNにより刺激されたマウスの肝臓は、担体対照群に比べ、肝小葉への炎症細胞の浸潤、組織破壊及び肝臓組織中における赤血球の流入（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｉｎｆｌｕｘ）などの現象を呈し、こられの現象が２つのｄＬＧＧ及びＳＭの治療方法によって緩和される。なお、ｄＬＧＧの治療方法によって、LPS/D-GalNにより起因されるマウスの肝臓組織中におけるアポトーシス細胞（ＴＵＮＥＬ陽性染色細胞）の数も顕著に減少される。

一方、マウスにｄＬＧＧ（１又は１０ｍｇ／ｋｇ）で前処理を行った１時間後にＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって肝疾患を誘発されても、ｄＬＧＧによる保護効果も同様に顕著である（データが表されていない）。これらの結果から、ｄＬＧＧは、ＬＰＳ／Ｄ−ＧａｌＮによって誘発されたマウスの肝不全及び急性劇症肝炎に対する治療及び予防効果を有することが確認された。

（３）ガラクト脂質を豊富に含むベニバナボロギク抽出物とｄＬＧＧがＬＰＳによって誘発されたマウスの炎症及び敗血症に対する予防及び治療効果
急性炎症は、敗血症を含む、深刻な全身性の反応を引き起こすものである。敗血症は、急激な臓器不全から死に至る適応症である。急性腎障害(Acute kidney injury,AKI)は、命に脅威のある病気であり、過去３０年間の間に死亡率が約４５％である。２分の1を占める重症ＡＫＩ患者では、敗血症が原因になっている(Uchino et al., 2005; Yasuda et al., 2006)。

エンドトキシンは、グラム陰性菌の外膜成分であり、一連のリムルスカスケード反応を誘発することができ、かつ敗血症の病理メカニズムに関与することができる。ＬＰＳ点滴／注射によって構築した炎症モデルは、敗血症の研究に広く用いられている（Ｄｏｉｅｔａｌ．，２００９）。本発明の実施例において、ＬＰＳを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス中に急性炎症及び敗血性ショックを誘発し、肝臓、腎臓及び肺臓の病理生理によって、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）とＡＬＴ及びＡＳＴ（肝不全及び肝毒性の標的である）の血清での含量を比較し測定し、かつ処理群間に低酸素の誘発及び炎症の生成に関与する炎症性脂質メディエーターのたんぱく質である低酸素誘導因子−１α（ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ−１α，ＨＩＦ−１α）、及びペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ−ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒａｃｔｉｖａｔｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒ δ，ＰＰＡＲ−δ）の発見程度を比較して、ｄＬＧＧ（５及び２５ｍｇ／ｋｇ体重）及びＣＲ−ＥＡ（１０及び５０ｍｇ／ｋｇ体重）抽出物の治療及び予防効果を観察し評価した。

ＬＰＳを投与する１時間前に、対照群に０．５％ＤＭＳＯを、陽性対照群に１０ｍｇ／ｋｇシンバスタチン及びｄＬＧＧとＣＲ−ＥＡを投与した。臨床薬シンバスタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であり、臨床では心血管，脳血管及び急性と慢性腎臓病に対して有効である（Ｅｐｓｔｅｉｎｅｔａｌ．，２００５；Ｎｉｓｓｅｎｅｔａｌ．，２００５；Ａｌｍｏｇ，ｅｔａｌ．，２００４）。スタチン療法（Ｓｔａｔｉｎｔｈｅｒａｐｙ，ＳｔａｔｉｎはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤カテゴリであり、シンバスタチンはそのうちの一つ薬品である）は、人間と動物の敗血症及び敗血症の誘発の急性腎障害の予防にも効果がある（Ｙａｓｕｄａｅｔａｌ．，２００６）。また、１群のマウスは、ＬＰＳによる刺激がない場合、ｄＬＧＧ（２５ｍｇ／ｋｇ）のみを投与した。ＬＰＳで２４時間処理した後、全てのマウスを犠牲にさせ、マウス血清を収集し、ＩＬ−６とＴＮＦ−αの濃度、及びＡＳＴとＡＬＴの含量を測定し比較した。

図６（Ａ）と図６（Ｂ）及び図７（Ａ）と図７（Ｂ）は、高投与量のＣＲ−ＥＡ及びｄＬＧＧで処理され、更にＬＰＳにより刺激されたマウス群において、血清中で炎症誘発性サイトカインの含量が顕著に低減されることを示す。ＣＲ−ＥＡ及びｄＬＧＧで治療されることによって、ＩＬ−６は、それぞれ２．６倍及び３．５倍低減された。ＴＮＦ−αは、それぞれ２．０及び３．０倍低減された。ＡＬＴは、それぞれ１．７５倍及び２．３倍低減された。ＡＳＴは、それぞれ１．３倍及び１．８倍低減された。
図７（Ｃ）に示すように、異なる処理群間によるＨ＆Ｅ染色法で行った組織学的比較によれば、ＬＰＳによる刺激はマウスの肝臓中に誘発された炎症細胞又は赤血球の浸潤現状を示す。図８（Ａ）は、ＣＲ−ＥＡとｄＬＧＧ前処理によって敗血症誘発急性腎障害の予防効果を示す。Ｈ＆Ｅ染色結果から、腎皮質損傷、尿細管細胞の空胞変性及びマクロファージ浸潤の現象を観察した。シンバスタチンは、マウスに盲腸連結及び穿刺術を用いて敗血症誘発急性腎障害及び死亡に改善効果を有するという報告がある（Ｙａｓｕｄａｅｔａｌ．，２００６）。本発明の実施例において、図５（Ａ）に示すように、シンバスタチンがＬＰＳによって誘発されたマウスの炎症及び敗血症に対して予防できることが観察され、ＣＲ−ＥＡ又はｄＬＧＧ処理群において、同じの顕著効果が観察された。これらの効果は、担体対照群のマウスと類似な腎臓組織の染色結果がある場合のみを確認した。Ｆ４／８０の免疫組織化学法による染色結果は、担体対照群に比べ、ＣＲ−ＥＡ又はｄＬＧＧ処理がＬＰＳに起因される腎臓（図８（Ｃ））中にマクロファージ活性化と浸潤の現象を顕著に減少することを示す。陽性対照群（Ｓｉｍｖａ１０）とＣＲ−ＥＡ又はｄＬＧＧ処理群とを比較すると、類似な結果が示される。なお、ＬＰＳにより刺激された後、２５ｍｇ／ｋｇ投与量のｄＬＧＧで後治療を行っても、ＬＰＳによりマウスの肝臓、肺臓及び腎障害が起因される（データが表されていない）。

図９は、ＣＲ−ＥＡ及びｄＬＧＧで前処理すると、炎症性メディエーターの形成及び低酸素の誘発に関与する２つの主なタンパク質、ＰＰＡＲ−δ及びＨＩＦ−１αの発見を負制御することになる。これらの結果は、ＣＲ−ＥＡ及びｄＬＧＧが酸素消耗と無酸素環境による臓器障害を緩和し、炎症性脂質メディエーターを一定状態に維持するように調節できることを暗示している。

図６乃至図９に示すように、マウスを単にｄＬＧＧで処理すると、血清中におけるＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＡＳＴ及びＡＬＴの含量、臓器組織（例えば、肝臓や腎臓）の病理学的評価、及びいくつかのタンパク質標的発見量と担体処理群のマウスと比較した結果は類似であり、肺臓分析の結果と現象も同一である（結果が示されていない）。これらの結果は、ｄＬＧＧがマウスに悪影響を与えないことを示す。
上述により、これらの結果は、ベニバナボロギク抽出物及びｄＬＧＧがＬＰＳによって誘発された敗血症の予防用又は治療用の藥劑とされる可能性を示す。

（４）ｄＬＧＧ及びＣＲ−ＥＡ抽出物によってＢ１６細胞の色素除去作用を行う
皮膚は身体の最大の器官であり、常に内部と外部要因の影響を受けている。皮膚は、定期的又は内因性色素沈着パターン（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）によって、それらの刺激に反応している。メラニンは、色素であり、肌色を担当し、皮膚が環境又は他の要因（薬物や化学物質）によって誘発された皮膚の色素沈着又は損傷を予防している。メラニンは、メラニン細胞においてメラニン形成（ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって生成されている(Costin and Hearing, 2007)。酵素チロシナーゼは、哺乳類動物がメラニンを生成することに必要である（ＨｅａｒｉｎｇａｎｄＴｓｕｋａｍｏｔｏ，１９９１）。小眼球症関連転写因子（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，ＭＩＴＦ）は、メラニン細胞分化、色素沈着、増殖及び生存の制御に関与し、メラニン合成酵素又はタンパク質遺伝子（例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１およびタンパク質２）の転写を制御する主な関連転写因子である（Ｙａｓｕｍｏｔｏｅｔａｌ．，１９９７；Ｈａｓｅｇａｗａｅｔａｌ．，２０１０）。

色素の高いＢ１６メラノーマ細胞を用いて化合物による色素除去効果の実験モデルは、７０年代から始まった（Ｂａｎｇｅｔａｌ．，２０１３；Ｗｒａｔｈａｌｌｅｔａｌ．，１９７３）。本発明の実施れにおいて、ベニバナボロギクのトータル沸騰水粗抽出物（ＣＲ−Ｗ−ＥＡ）又はトータルエタノール粗抽出物（ＣＲ−Ｅｔ−ＥＡ）のＥＡ溶出分を用いて処理した後、Ｂ１６細胞に対する色素除去機能を直接観察した。ＫＡ及びＤＭＯＳを、それぞれ、陽性対照群及び担体対照群とする。

図１０（Ａ）は、担体対照群に比べ、ＣＲ−Ｅｔ−ＥＡがＢ１６メラノーマ細胞に対する色素除去作用は、投与量依存性（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の効果があることを示す。ＣＲ−Ｅｔ−ＥＡから精製された単一化合物ｄＬＧＧが異なる時点での色素除去効果をさらに評価した。図１０（Ｂ）は、担体対照群と比べ、ｄＬＧＧ（４５μＭ）は、時間依存的様式（ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ）でＢ１６メラノーマ細胞に対する顕著な色素除去活性を有することを示す。

さらに、ｄＬＧＧによる色素除去効果の分子作用メカニズムについて研究する。ｄＬＧＧがチロシナーゼとＭＩＴＦ発見に対する効果を試験するために、ウェスタンブロット法を行った。図１０（Ｃ）に示すように、dLGGは、メラニンによって関連タンパク質、ＭＩＦＦ及びチロシナーゼ発見を確実に阻害することができる。こられのデータは、dLGGがＭＩＦＦ及びチロシナーゼ発見を阻害することによって、Ｂ１６メラノーマ細胞中にメラニンの生成を抑止できることを示す。そのため、dLGGは次世代の皮膚用美白剤となることが確認された。

上記のように、本発明を各実施例によって詳しく説明したが、当業者が、本発明の実施例に対して為された簡単な修飾や変化の全ては、本発明の特許請求の範囲内に含まれるものとする。

Claims

ガラクト脂質を豊富に含む植物抽出物の製造方法であって、
前記植物抽出物は、植物サンプルを水または低級アルコール類で抽出し、更に低級エステルで分配抽出することによって低級エステルの抽出物を得ることができ、かつさらに、前記低級エステルの抽出物をアルコール溶離液で溶出することによって、ガラクト脂質を豊富に含む溶出分が得られ、
前記植物サンプルは、タカサゴサンシチソウ、及びマーダニアブラクテアタからなる群から選択され、
前記アルコール類溶離液におけるアルコール類は、前記溶離液に対する体積率が５〜２０％である、植物抽出物の製造方法。
前記低級アルコール類は、メタノールまたはエタノールである、請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。
前記低級エステルは、酢酸エチルである、請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。
前記アルコール類溶離液は、ジクロロメタンとメタノール、メタノールと水、メタノールとアセトニトリルまたはメタノールとアセトンを含む、請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。
前記メタノール溶離液におけるジクロロメタンとメタノールとの比が９：１である、請求項４に記載の植物抽出物の製造方法。
前記メタノール溶離液は、タカサゴサンシチソウから得られた低級エステルの抽出物を溶出することに用いられる、請求項５に記載の植物抽出物の製造方法。
前記メタノール溶離液におけるジクロロメタンとメタノールとの比が１２：１である、請求項４に記載の植物抽出物の製造方法。
前記メタノール溶離液は、マーダニアブラクテアタから得られた低級エステルの抽出物を溶出することに用いられる、請求項７に記載の植物抽出物の製造方法。
前記ガラクト脂質を豊富に含む溶出分は、さらに、逆相高性能液体クロマトグラフィー法(Reversed phase HPLC)によって精製されて、生物活性溶出分が得られる、請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。
前記ガラクト脂質を豊富に含む溶出分をアルコール溶離液によって溶出することによって、前記生物活性溶出分が得られ、前記アルコール類溶離液におけるアルコール類は、前記溶離液に対する体積率が７０％〜１００％である、請求項９に記載の植物抽出物の製造方
法。
前記ガラクト脂質を豊富に含む溶出分は、1,2-ジ-O-α-リノレオイル-3-O-β-ガラクトピラノシル-sn-グリセロール(1,2,di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol,dLGG)を含む溶出分である、請求項１に記載の植物抽出物の製造方法。
劇症肝炎の予防・治療用医薬を製造するための、
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の植物抽出物又はその精製物である予防又は治療における有効量の生物活性成分と、及び医薬・保健又は食品で許容される担体とを含有する組成物の使用。
前記精製物はｄＬＧＧである、請求項１２に記載の劇症肝炎の予防・治療用医薬を製造するための組成物の使用。
敗血症及びその適応症の予防・治療用医薬を製造するための、
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の植物抽出物又はその精製物である予防又は治療における有効量の生物活性成分と、及び医薬・保健又は食品で許容される担体とを含有する組成物の使用。
前記精製物はｄＬＧＧである、請求項１４に記載の敗血症及びその適応症の予防・治療用医薬を製造するための、組成物の使用。
前記適応症は、敗血症誘発急性腎障害である、請求項１４に記載の敗血症及びその適応症の予防・治療用医薬を製造するための、組成物の使用。
美白用剤を製造するための、
請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の植物抽出物又はその精製物である有効量の生物活性成分と、及び医薬・保健又は食品で許容される担体とを含有する組成物の使用。
前記精製物はｄＬＧＧである、請求項１７に記載の美白用剤を製造するための組成物の使用。