KR100772078B1 - 갈조류 지충이로부터 분리된 신규모노갈락토실디아실글리세롤 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갈조류 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물에 대한 것으로, 우리나라 연안에 널리 분포하고 있는 지충이로부터 신규한 모노갈락토실디아실글리세롤 (monogalactosyldiacylglycerol, MGDG) 화합물을 컬럼크로마토그라피와 역상 고성능 액체크로마토그라피를 사용하여 분리, 정제하여 이들의 구조를 고속원자충돌이온화가 장착된 탄뎀질량분석법, 적외선분광법, 핵자기공명분광법, 선광도 측정 및 지방산의 특정 효소 가수분해 반응을 사용해 확인하여 각각의 구조를 확인하는 것을 특징으로 한다.
갈조류, 지충이, 모노갈락토실디아실글리세롤
Description
도 1 - (a) NaI로 포화된 3-nitrobenzyl alcohol(3-NBA) 매트릭스와 섞은 화합물 ST-MGDG-A에 대해 양이온 고속원자충돌이온화(FAB)에 의해 생성된 [M+Na]+(m/z 821) 이온의 고에너지(7kV) 충돌유발분해반응(CID) 질량스펙트럼, (b) 두 지방산의 탄화수소 사슬을 따라서 일어난 절편분해반응을 통해 생성된 이온들의 피크들을 보여주는 CID 스펙트럼의 고질량 영역. 피크위의 등호는 이중결합 위치를 표시.
도 2 - ST-MGDG-A에 대한 CID 스펙트럼에서 관측된 이온들의 분해반응 경로와 표지
도 3 - (a) NaI로 포화된 3-NBA 매트릭스와 섞은 화합물 ST-MGDG-B에 대해 양이온 FAB에 의해 생성된 [M+Na]+(m/z 795) 이온의 고에너지(7kV) CID 스펙트럼, (b) 두 지방산의 탄화수소 사슬을 따라서 일어난 절편분해반응을 통해 생성된 이온들의 피크들을 보여주는 CID 스펙트럼의 고질량 영역
도 4 - ST-MGDG-B에 대한 CID 스펙트럼에서 관측된 이온들의 분해반응 경로와 표지
본 발명은 갈조류 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물인 (2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3-O-β-D-칼락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z -eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]과 (2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]에 대한 것이다.
갈조식물(Phaeophyta) 모자반과(Sargassaceae)에 속하는 지충이(Sargassum thunbergii)는 우리나라 전 연안에서 흔히 볼 수 있는 해조류로서 조간대 하부에서 뚜렷한 군락을 이루고 있다. 이러한 갈조류로부터 항암 효과가 있는 다당류, 혈액내 콜레스테롤 수치를 감소시키는 요오도아미노산, 칼슘결합 화합물 그리고 퍼옥시나이트라이트 스캔빈저(peroxynitrite scavenger) 등과 같은 생리활성물질들이 보고되었다. 한편, 이외에도 식물, 조류 그리고 여러 광합성 박테리아의 광합성 막내에 주요 지질 성분으로 글리세롤 당지질이 차지하고 있다. 이들은 항암, 항염증, 그리고 항바이러스 성질을 포함한 여러 생리활성을 지니고 있으며, 또한 HIV-1 바이러스의 역전사효소에 대한 억제효과를 가지고 있다.
본 발명의 발명자들은 해조류로부터 새로운 생리활성 물질을 탐색하는 과정에서 서해 앞바다에서 채집한 갈조류 지충이로부터 2개의 새로운 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물을 분리, 정제하여 그들의 구조를 처음으로 규명하였다.
본 발명의 목적은 갈조류 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물인 (2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3-O-β-D-칼락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]과 (2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]을 제공하는데 있다.
본 발명은 갈조류 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤(monogalactosyldiacylglycerol, MGDG) 화합물을 제공하는 것으로, 상세하게는 우리나라 연안에 널리 분포하고 있는 지충이로부터 컬럼크로마토그래피와 역상 고성능 액체크로마토그라피를 사용하여 신규한 모노갈락토실디아실글리세롤인 (2S)- 1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl -sn-glycerol]과 (2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]을 분리 및 정제하는 것이다.
이하, 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물에 대한 것으로, 화학식 1의 (2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3-O-β-D-칼락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]과 화학식 2의 (2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]을 갈조류 지충이로부터 분리하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1 또는 2로 표시되는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물은 갈조류 지충이로부터 분리되는 것으로,
1) 절단된 갈조류 지충이와 메탄올을 1:1~1:3의 중량비로 혼합하여 48~72시간동안 방치 후 여과 및 감압농축하여 지충이 추출물을 수득하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 수득된 지충이 추출물에 부탄올과 물을 1:1의 부피비로 혼합한 용액을 가하는 단계;
3) 상기 2)의 부탄올 층의 용매를 감압농축하고, 메탄올과 물을 15:85의 중량비로 혼합한 용액과 노말헥산을 가하는 단계; 및
4) 상기 3)단계의 메탄올 층의 용매를 감압농축하고, 역상실리카 플래쉬 크로마토그래피를 통해 분리하는 단계;
로 분리되는 것을 특징으로 한다.
상기 1) 단계에서 사용되는 갈조류 지충이는 습식상태로 사용하며, 칼로 6~8cm의 길이로 절단하여 사용한다. 또한 절단된 갈조류 지충이와 메탄올을 1:1~1:3의 중량비로 혼합하여 48~72시간동안 방치한 후 여과하는 단계를 2~4회 반복하여 지충이 추출물을 수득한다.
상기 2) 단계에서는 1) 단계에서 수득된 지충이 추출물에 부탄올과 물을 1:1의 부피비로 혼합한 부탄올과 물의 혼합용액을 가하여 각종 염과 극성 화합물을 함유하는 물 층과 유기물질을 함유하는 부탄올 층으로 분획한다.
상기 3) 단계에서는 상기 2) 단계의 유기물질을 함유하는 부탄올 층만을 감압 농축하고 메탄올과 물을 15:85의 부피비로 혼합한 메탄올과 물의 혼합용액과 노말헥산을 첨가하여 유기물질의 재분배를 실시한다.
상기 4) 단계에서는 3) 단계의 많은 유기물질로 혼합되어 있는 메탄올 층의 분획을 감압농축하여 역상실리카 플래쉬 크로마토그래피를 수행하고, 이때 고정상으로는 역상 실리카 C-18을 사용하고, 용리액으로는 높은 극성에서 낮은 극성의 용매 순으로 사용하며, 바람직하게는 부피비 50:50~10:90의 물과 메탄올의 혼합용액, 메탄올 및 아세톤의 순서로 사용한다. 상기 용리액으로 사용되는 물, 메탄올 및 아세톤의 각각의 층에 포함되어 있는 물질에 대하여 수소 핵자기 공명 분광기로 스펙 트럼을 측정하여 불포화도가 많은 글라이코리피드 물질이 아세톤 층에 다량 함유되어 있는 것을 알 수 있었다.
상기 아세톤 층에 함유되어 있는 글라이코리피드를 분리하기 위하여 감압증류기로 아세톤 용매를 제거한 후 역상 반분취 액체크로마토그라피로 글라이코리피드를 분리하는 단계를 더 포함한다.
상기 역상실리카 플래쉬 크로마토그래피 및 역상 반분취 고성능 액체 크로마토그라피로 분리한 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물의 구조를 확인하기 위하여 고속원자충돌이온화가 장착된 탄뎀질량분석법, 적외선분광법, 자기공명분광법, 선광도 측정 및 지방산의 특정 효소 가수분해 반응을 사용하여 구조를 규명한다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
분리 및 정제
갈조류 지충이(Sagassum thunbergii) 1.5Kg(습식중량)을 칼로 8cm 길이로 절단하여 메탄올 3.0 ℓ를 가하고 48시간 동안 방치한 후 그 용액을 여과하였다. 상 기 과정을 2회 반복하여 메탄올 여과액을 감압 농축하여 지충이 추출물 20g을 수득하였다. 상기 지충이 추출물에 대하여 부탄올과 물의 혼합 용액(부피비 1:1) 1.5ℓ를 가하여 각종 염과 극성을 지닌 화합물을 가진 물 층과 유기 물질을 가진 부탄올 층으로 분획하였다. 부탄올 층의 용매를 감압 농축기로 제거한 후 얻어진 분획에 대하여 메탄올과 물로 이루어진 혼합 용액(부피비 85:15) 500㎖과 노르말 헥산 500㎖을 첨가하여 재분배를 실시하고, 메탄올 층의 분획을 역상 실리카 플래쉬 크로마토크래피를 수행하였다. 이 때 고정상은 역상 실리카 C-18을 사용하였고 용리액은 50% 물/50% 메탄올, 40% 물/60% 메탄올, 30% 물/70% 메탄올, 20% 물/80% 메탄올, 10% 물/90% 메탄올, 100% 메탄올, 100% 아세톤 순서로 사용하였다. 물, 메탄올 및 아세톤의 각 층에 해당되는 물질에 대하여 수소 핵자기 공명 분광기로 스펙트럼을 측정 분석한 결과, 100% 아세톤 층에 불포화도가 많은 글라이코리피드 물질들이 함유된 것을 확인할 수 있었다.
아세톤 층에 존재하는 글라이코리피드를 분리하기 위하여 감압증류기로 아세톤 용매를 제거한 후 역상 반분취 액체크로마토그라피를 수행하여 주성분인 글라이코리피드를 네 종류 분리하였다.
이 때 사용된 액체크로마토그라피 조건은 다음과 같다. 컬럼은 YMC ODS-C18, 입자 직경은 5㎛, 컬럼의 크기는 250 × 10㎜(길이 × 직경), 용출 속도는 2.0 ㎖/min, 사용된 검출기는 굴절율 검출기이며 용리액은 100% 메탄올을 사용하였다.
그 결과 머무름 시간 33분, 34분, 39분 그리고 41분에 용출된 반고형 성분들이 글라이코리피드임을 확인할 수 있었다. 이 중 머무름 시간이 33분과 41분에서 용출된 두 글라이코리피드는 이미 밝혀진 화합물인 반면, 머무름 시간이 39분에서 5.6㎎과 34분에서 4.2㎎으로 분리된 두 화합물은 신규 화합물로 확인되었다.
따라서 머무름 시간 39분에서 얻어진 반고형 성분은 ST-MGDG-A라 명명하였고 또 다른 머무름 시간 34분에서 얻어진 무색의 반고형 성분을 ST-MGDG-B라 명명하였다.
Sn
-2 아실 리소갈락토리피드 제조
분리한 두 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물 0.2mg과 lipase XI (Rhizopus arrhizus) 1000 unit을 Triton X-100 0.25 ㎎이 들어 있는 boric acid-borax 완충용액 (pH 7.7) 65 ㎕에 녹여 37℃에서 6시간동안 저으면서 반응시켰다. 상기 반응용액을 아세트산으로 pH 4에 맞추고, 클로르포름/메탄올 (2:1, v/v) 0.2 ㎖를 가하고 반응을 종료시켰다. 추출된 유기용액 층을 0.2M H3PO4/1M KCl 0.1 ㎖로 세척한 후 그 수용액 층을 클로르포름으로 재추출하여 이전의 유기용액 추출물에 더해 건조시켜 농축하였다.
상기 농축물을 리소갈락토리피드(lysogalactolipid)와 지방산으로 분리하기 위해 실리카겔 판을 이용한 TLC를 클로르포름/메탄올/물 (65:25:4, v/v/v) 용액으로 전개하였다. 0.01 % primuline이 포함된 아세톤/물 (4:1, v/v) 용액을 분사한 후 자외선을 쬐여 확인한 결과 TLC 판의 가장 낮은 부분에 sn-2 아실 리소갈락토리피드(sn-2 acyl lysogalactolipid)가 위치하고 있었다.
CD
/
ORD
,
IR
,
NMR
및 질량분석법
실험에 사용된 편광기는 일본 JASCO사의 디지털 DIP-1000을 이용하였으며, 적외선 스펙트럼은 Matton사의 Galaxy 기기를 사용하였다. 구조 분석에 활용된 핵자기공명분광기는 미국 Varian사의 UNITY500을 사용하였으며, 24℃에서 용매 메탄올-d4를 사용하고, 수소 스펙트럼에서 용매 신호는 3.3ppm에 기준을 두고, 탄소 스펙트럼에서 용매 신호는 49ppm에 기준을 두었다. 수소와 탄소 위치의 지정은 COSY, 그레이언트 HSQC, 그레이언트 HMBC 및 ROESY 실험을 조합하여 결정되었으며, 이중 COSY와 HMBC는 인접한 수소 신호의 해상도를 위하여 데이터를 각각 256(t1)× 1024(t2)로 하였다.
모든 질량분석스펙트럼은 4개의 부채꼴형 분석관이 결합된 탄뎀질량분석기(JMS-HX110/110A, JEOL)을 사용해 얻어졌다. 양이온 모드에서 10 kV의 가속전압이 가해진 이온원에서 이온들은 이온총에서 만들어지고 22 kV로 가속된 세슘 이온빔을 사용해 고속원자충돌이온화 과정을 통해 생성되었다. 이때 사용된 시료는 클로로포름/메탄올(2:1, v/v)에 녹인후 1 ㎕를 취해 NaI로 포화된 3-니트로벤질알콜(3-nitrobenzyl alcohol) 1 ㎕와 혼합하여 FAB probe에 로딩(loading)하였다. 탄뎀질량분석기의 첫 번째 질량분석기에 의해 선택된 전구이온의 충돌유발분해반응(CID)은 첫 번째 자기장 분석관과 두 번째 전기장 분석관 사이에 위치하고, 3.0 kV 전압이 걸린 충돌실에서 일어났다. 충돌실 내의 헬륨 가스의 압력은 전구이온의 감도가 70% 가량 감소하도록 조절하였다. 충돌과정에서 생성된 이온들은 두 번째 질량분석기의 B/E 주사를 통해 분석하였다.
화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 구조 분석 결과-2차원
화합물 ST-MGDG-A 는 무정형 반고형으로 추출되었으며, 고분해능 고속원자충돌이온화(FAB) 질량분석 결과 m/z 821.5179 (이론치, 891.5179, △ -0.0 mmu)에서 관측된 [M+Na]+이온 피크로부터 분자식이 C47H74O10으로 확인되었다.
상기 화합물 ST-MGDG-A 의 적외선 흡수스펙트럼은 히드록시 작용기에 해당되는 흡수선(3375cm-1)과 에스터 작용기(1734cm-1)에 해당되는 흡수선을 보여주었다.
수소 및 탄소 자기공명 스펙트럼으로부터 화합물 ST-MGDG-A 은 이중결합을 많이 함유한 탄소 사슬 성분, 한 개의 당 성분 및 두 개의 카르복실기를 가지고 있다는 사실을 확인할 수 있었으며, 이를 하기 표 1에 나타내었으며, 상기의 데이터를 종합해 볼 때 화합물 ST-MGDG-A 은 하기 화학식 1로 표시되는 모노갈락토실다이아실글리세롤임을 확인할 수 있었다.
[화학식 1]
[표 1]
일반적으로 글리세롤 지질은 나트륨 결합 분자이온의 고에너지 충돌유발분해반응 질량스펙트럼을 통해 머리구조 뿐만 아니라, 지방산 및 두개의 지방산 결합을 포함한 구조적 분석을 완벽하게 수행할 수 있다. 특히 전하 위치에서 조정되어 탄화수소 사슬을 따라 일어나는 절편 반응으로부터 심지어 여러 개의 불포화 결합을 가진 지방산의 이중결합 위치를 정확히 결정할 수 있다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 텐뎀질량스펙트럼 패턴은 이미 보고된 다른 지방산 조성을 가진 모노갈락토실디아실글리세롤의 것과 매우 유사하였다. 텐뎀질량스펙트럼에서 관측된 분해반응 경로와 표지된 생성이온을 도 2에 나타내었다. m/z 157, 169, 185 및 201에서 관측된 A, B’, B 및 C-2H 이온들로부터 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 머리구조가 단당류임을 확인하였다. 또한 화합물 내의 지방산 조성은 각 지방산 그룹으로부터 프리(free) 지방산의 상실 반응을 통해 얻어진 한 쌍의 G 이온들인 [M+Na-C19H29COOH]+ (m/z 519) 및 [M+Na-C17H29COOH]+ (m/z 543)로부터 각각 탄소원자 수:이중결합의 수가 C20:5 및 C18:3인 지방산 조성을 확인했다.
지방산 사슬내의 이중결합의 위치는 도 1(b)에 나타낸 바와 같이, CID 스펙트럼의 고질량 영역에서 관측되는 사슬 절편 분해반응 이온들로부터 결정할 수 있었다. 각 지방산 사슬을 따라서 일어나는 일련의 CnH2n+2기의 상실반응에 의해 생성 된 이온들은 이웃 이온들의 질량차이가 14 Da에 해당되며, 사슬내 이중결합이 있을 경우엔 질량차이가 12 Da으로 줄어드는 것으로부터 두 지방산 사슬 절편반응을 통해 생성된 동족이온들은 공통적으로 같은 질량에서 관측되는 m/z 805, 791 779 (=, =는 이중결합 위치를 나타냄), 765, 751, 739 (=), 725, 711, 699 (=), 685 및 671을 제외하고 두 그룹으로 나눌 수 있었다. m/z 657, 643, 629 및 615 (3I2)에서 관측된 이온들은 9,12,15-옥타데카트리엔오익 산(octadecatrienoic acid) 그룹에 속하며 한편 m/z 659 (=), 645, 631, 619 (=) 605 및 591 (3I1)에서 관측된 이온들은 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔오익 산(eicosapentaenoic acid, EPA)에 기인하는 것을 알 수 있었다.
화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)에 있는 두 개의 지방산과 글리세롤의 연결위치는 핵자기공명법중에서 HMBC와 수소 핵 COSY 실험을 통해 밝혀졌다. 먼저 C20:5 사슬 내에 있는 H-2', 3' 및 4'에 해당되는 메틸렌 수소들의 위치는 수소 자기공명 스펙트럼(표 1)에서 명확히 식별되었으며, HMBC 자기공명실험에서 H-3'의 수소는 같은 탄소 사슬 내에 있는 C-1'의 카르복실 탄소와 상관관계가 있음이 확인되었다. 또한 자기공명 신호가 확인된 C-1'은 같은 실험법으로 글라이세롤의 sn-1 위치에 있는 수소와의 상관관계를 보였다.
또 한편으로는 C18:3 사슬에 있는 H-3"의 수소는 HMBC 실험에서 같은 탄소 사슬내 카르복실 탄소 C-1"과 상관관계를 가지고 있었다.
상기의 HMBC 자기공명실험을 통하여 C20:5 지방산 사슬은 글리세롤의 sn-1 탄소 위치에 연결되어 있고, C18:3 지방산 사슬은 글리세롤의 sn-2 위치에 각각 연결되어 있음이 확인되었다.
또한 상기의 지방산 사슬과 글리세롤 간의 연결성은 글리세롤 골격에 붙은 두 지방산 중 sn-1 위치의 지방산 그룹과 글리세롤 골격 사이의 에스테르 결합을 선택적으로 절단하는 특이적 효소인 리파제 XI(lipase XI) 가수분해반응을 통하여 검증할 수도 있었다. 상기 가수분해 반응으로 sn-2 위치에만 결합된 지방산을 가진 리소갈락토리피드(lysogalactolipid)를 얻을 수 있었으며, FAB 질량분석 스펙트럼 결과는 sn-2 위치에 알파 -리놀레익 산(α-linolenic acid)을 가진 이온 피크가 m/z 537에 나타났다.
또한 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)에 있는 당 성분은 HMBC실험으로부터 아노메릭(anomeric) 수소와 글리세롤의 3번 위치에 있는 탄소와의 상관관계를 보여 sn-3 위치에 연결되어 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)에 있는 당의 종류는 당에 있는 각 수소들과의 짝결합 상수 값과 핵 오우버하우스 효과(NOE)로부터 베타-갈락토피라노즈(β-galactopyranose)라는 것이 밝혀졌다( H-1″′/ H-2″′, J = 7.6Hz ; H-2″′/ H-3″′, J = 9.7 Hz ; H-3″′/H-4″′, J = 3.2 Hz ; H-1″′ 와 H-3″′의 NOE 그리고 H-1″′ 와 H-5″′ 사이 NOE).
화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 구조 분석 결과-입체구조
상기에서 규명된 2차원적 화합물 구조에서 글리세롤 sn-2 위치의 입체 구조와 고도불포화 지방산의 입체구조를 확인하기 위하여 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1) 3㎎ 을 메탄올 용매 1㎖에 15% NaOMe/MeOH 1㎖ 를 넣고 반응시킨 후 글리세릴 갈락토사이드와 두 개의 메틸 에스터로 분리하여 글리세릴 갈락토사이드에 대하여 선광도를 측정하였다.
측정결과 값이 -6.0 (c 0.15 H2O)로 나타났으며, 문헌(Oshima, Y., Yamada, S-H., Matsunaga, K., Moriya, T., and Ohizumi,Y., (1994) A Monogalactosyl Diacylglycerol from a cultures Marine Dinoflagellate, Scrippsiella trochoidea, J. Nat. Prod. 57, 534-536.)에 알려진 (2R) -1-O-글라이세릴 갈락토사이드[ -9.0, (c=0.2, H2O)]와 비교한 결과 매우 유사하였다.
따라서 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 글리세롤 sn-2 위치의 탄소는 (R) 형태를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이중 결합 옆의 아릴릭 탄소의 화학적 이동값으로부터 지방산 내 많은 이중 결합은 Z 형태를 가지고 있음을 알 수 있었다.
상기에서 규명된 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)의 구조는 (2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3- O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]임을 밝혀냈다.
화합물
ST
-
MGDG
-B (화학식 2)의 구조 분석 결과-2차원
화합물 ST-MGDG-B 는 무정형 반고형으로 추출되었으며, 고분해능 팹(FAB) 질량분석 결과 m/z 795.5018 (이론치, 795.5023, △ -0.5 mmu)에서 관측된 [M+Na]+이온 피크로부터 분자식이 C45H72O10으로 확인되었다.
상기 화합물 ST-MGDG-B 의 적외선 흡수스펙트럼은 히드록시 작용기에 해당되는 흡수선(3380cm-1)과 에스터 작용기(1735cm-1)에 해당되는 흡수선을 보여주었으며, 이는 화합물 ST-MGDG-A와 유사하였다. 또한 수소 및 탄소 자기공명 스펙트럼(표 2)으로부터 화합물 ST-MGDG-A와 유사하게 이중결합을 많이 함유한 탄소 사슬 성분, 한 개의 당 성분 및 두 개의 카르복실기를 가지고 있다는 사실을 확인할 수 있었으며, 화합물 ST-MGDG-B 은 하기 화학식 2로 표시되는 모노갈락토실디아실글리세롤임을 확인할 수 있었다.
[화학식 2]
[표 2]
도 3에 나타낸 바와 같이, 화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)의 텐뎀질량스펙트럼 패턴은 상기 화합물 ST-MGDG-A(화학식 1)의 텐뎀질량스펙트럼과 매우 유사하였다. 텐뎀질량스펙트럼에서 관측된 분해반응 경로와 표지된 생성이온을 도 4에 나타내었다. m/z 157, 169, 185 및 201에서 관측된 A, B’, B 및 C-2H 이온들로부터 화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)의 머리구조가 단당류임을 확인하였다. 또한 화합물 내의 지방산 조성은 각 지방산 그룹으로부터 프리(free) 지방산의 상실 반응을 통해 얻어진 한 쌍의 G 이온들인 [M+Na-C17H29COOH]+ (m/z 517) 및 [M+Na-C17H27COOH]+ (m/z 519)로부터 각각 C탄소원자 수:이중결합의 수가 C18:3 및 C18:4의 지방산 조성을 확인했다.
지방산 사슬내의 이중결합의 위치는 도 2(b)에 나타낸 바와 같이, CID 스펙트럼의 고질량 영역에서 관측되는 사슬 절편 분해반응 이온들로부터 결정할 수 있었다. 각 지방산 사슬을 따라서 일어나는 일련의 CnH2n +2기의 상실반응에 의해 생성된 이온들은 이웃 이온들의 질량차이가 14 Da에 해당되며, 사슬내 이중결합이 있을 경우엔 질량차이가 12 Da으로 줄어드는 것으로부터 두 지방산 사슬 절편반응을 통해 생성된 동족이온들은 공통적으로 같은 질량에서 관측되는 m/z 779, 765, 753 (=, =는 이중결합 위치를 나타냄), 739, 725, 713(=), 699, 685, 673(=), 659 및 645를 제외하고 두 그룹으로 나눌 수 있었다. m/z 633(=), 619, 605 및 591 (3I2)에서 관측된 이온들은 6,9,12,15-옥타데카테트라엔오익 산(6, 9,12,15-octadecatetraenoic acid) 그룹에 속하며 한편 m/z 631, 617, 603, 및 589 (3I1)에서 관측된 이온들은 9,12,15-옥타데카트리엔오익 산(octadecatrienoic acid)에 기인하는 것을 알 수 있었다.
화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)에 있는 두 개의 지방산과 글리세롤의 연결위치는 상기 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)와 같이 핵자기공명법중에서 HMBC와 수소 핵 COSY 실험을 통해 밝혔다. 먼저 C18:3 사슬 내에 있는 H-3'의 메틸렌 수소는 동일 사슬 내 있는 카르복실 탄소 C-1'과 상호관계를 찾을 수 있었으며, 상기 자기공명 신호가 확인된 C-1' 탄소는 다시 글라이세롤 sn-1 위치에 있는 수소와의 상관관계를 보여 주었다.
상기의 HMBC 자기공명실험을 통하여 C18:3 지방산 사슬은 글리세롤의 sn-1 탄소 위치에 연결되어 있고, C18:4 지방산 사슬은 글리세롤의 sn-2 위치에 각각 연결되어 있음이 확인되었다.
또한 상기의 지방산 사슬과 글리세롤 간의 연결성은 글리세롤 골격에 붙은 두 지방산 중 sn-1 위치의 지방산 그룹과 글리세롤 골격 사이의 에스테르 결합을 선택적으로 절단하는 특이적 효소인 리파제 XI(lipase XI) 가수분해반응을 통하여 검증하였다. 상기 가수분해 반응으로 sn-2 위치에만 결합된 지방산을 가진 리소갈락토리피드(lysogalactolipid)를 얻을 수 있었으며, FAB 질량분석 스펙트럼 결과는 sn-2 위치에 6,9,12,15-옥타데카테트라엔오익 산(6, 9,12,15-octadecatetraenoic acid)을 가진 이온 피크가 m/z 535에 나타났다. 또한 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)과 동일한 방법으로 당의 종류가 베타-갈락토피라노즈(β-galactopyranose)임을 밝혔다.
화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)의 구조 분석 결과-입체구조
상기에서 규명된 2차원적 화합물 구조에서 글리세롤 sn-2 위치의 입체 구조와 고도불포화 지방산의 입체구조를 확인하기 위하여 화합물 ST-MGDG-A (화학식 1)과 동일한 방법으로 선광도를 측정한 결과 -6.5(c 0.9, H2O)로 나타났다.
따라서 화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)의 글리세롤 sn-2 위치의 탄소는 (R) 형태를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이중 결합 옆의 아릴릭 탄소의 화학적 이동값으로부터 지방산 내 많은 이중 결합은 Z 형태를 가지고 있음을 알 수 있었다.
상기에서 규명된 화합물 ST-MGDG-B (화학식 2)의 구조는 (2S)-1-O- (9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]임을 밝혀냈다.
본 발명에 따라 갈조류 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물은 각각의 화합물 내에 알파-리놀레인산과 에이코사펜타엔오익산을 동시에 함유하고 있는 신규 물질로 디스크 확산법으로 Candida albicane에 대하여 항진균 검사를 한 결과 (2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-에이코사펜타엔오일)-2-O-(9Z,12Z,15Z-옥타데카트리엔오일)-3-O-β-D-칼락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-eicosapentaenoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]과 (2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-옥타테카트리엔오일)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-옥타데카테트라엔오일)-3-O-β-D-갈락토피라노실-sn-글리세롤[(2S)-1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-2-O-(6Z,9Z,12Z,15Z-octadecatetraenoyl)-3-O-β-D-galactopyranosyl-sn-glycerol]에 있어서 각 화합물을 1.0㎎/㎖의 농도를 조제한 후 이 용액의 20㎕에 대하여 항진균 효능을 보여 주었다.
한편, 해양 조류는 일반적으로 n-3과 n-6 계열의 고도 불포화 지방산을 많이 함유하고 있다. 특히 알파-리놀레익, 아라키도닉, 에이코사펜타엔오익 산 등은 인 간과 동물에서 필요한 성분 뿐만아니라, 생합성의 전구체로 활용되고 있으므로, 본 발명에 따라 지충이로부터 분리된 신규 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물은 여러 가지 효능을 보여줄 수 있는 가능성을 가지고 있다.
Claims (5)
- 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물.[화학식 1]
[화학식 2]
- 제 1항에 있어서,상기 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물은 갈조류 지충이로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물.
- 제 2항에 있어서,상기 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물은1) 절단된 갈조류 지충이와 메탄올을 1:1~1:3의 중량비로 혼합하여 48~72시간동안 방치 후 여과하는 단계;2) 메탄올 여과액을 감압농축하고, 부탄올과 물을 1:1의 중량비로 혼합한 용액을 가하는 단계;3) 상기 2)의 부탄올 층의 용매를 감압농축하고, 메탄올과 물을 15:85의 중량비로 혼합한 용액과 노말헥산을 가하는 단계; 및4) 상기 3)단계의 메탄올 층의 용매를 감압농축하고, 역상실리카 플래쉬 크로마토그래피를 통해 분리하는 단계;로 갈조류 지충이로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물.
- 제 3항에 있어서,상기 4) 단계에서 용리액으로 부피비 50:50~10:90의 물과 메탄올의 혼합용액, 메탄올 및 아세톤을 사용하는 것을 특징으로 하는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물.
- 제 4항에 있어서,6) 아세톤 층의 용매를 감압놓축하고, 역상반분취 고성능 액체 크로마토그라피로 글라이코리피드를 분리하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 모노갈락토실디아실글리세롤 화합물.
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