KR101671697B1

KR101671697B1 - 십전대보 십일가미탕의 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101671697B1
Application number: KR1020140179253A
Authority: KR
Inventors: 김성한; 손호용
Original assignee: 농업회사법인 대제한약 주식회사; 안동대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2016-11-09
Also published as: KR20160072327A

Abstract

본 발명은 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 사용하여 십전대보 십일가미탕의 추출물을 조제하고 이를 다양한 극성이 유기용매를 사용하여 순차적으로 조제하는 분획물 중 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

Description

십전대보 십일가미탕의 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE ETHYLACETATE FRACTION OF ORIENTAL MEDICINAL 21-DAEBOTANG FOR PREVENTION AND CONTROL OF THROMBOSIS}

본 발명은 십전대보 십일가미탕("21 대보탕"으로 명명되기도 함)의 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 십전대보 십일가미탕의 열수 추출물을 순차적 유기용매 분획하여 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물로 각각 조정제한 후 얻어지는 분획물 중, 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다. 그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있으며, 이러한 원인들은 개별적 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전생성을 야기한다. 혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 십전대보 십일가미탕은 동의보감에서 내려오는 십전대보탕에 11종류의 한방약재를 가미하여 제조한 한방탕제로서, 원기회복은 물론 마음을 진정시키고 심신을 평안하게 해주는 기능이 우수한 것으로 알려져 있다. 또한, 십전대보 십일가미탕은 기존의 쌍화탕보다 관능성이 우수하며, 인간 적혈구에 대한 급성 용혈독성이 전혀 없으며, 부분적인 항산화, 항혈전, 항균 활성을 나타냄을 확인한 바 있다(대한민국 등록특허: 10-1408814-0000호, 2014-06-11).

십전대보 십일가미탕의 제조방법은 이미 공지한 바와 같이, 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 각각 3.75 kg씩 취하고, 이에 약 500L의 물을 가해 105℃의 조건에서 열수 추출하며, 상기 열수 추출은 추출물의 브릭스가 7.5~8.5, pH가 5.5~6.0인 상태에서 완료하여 열수 추출액을 얻게 되며, 십전대보 십일가미탕의 분말은 최종적으로 얻어진 추출액을 통상의 방법으로 필터한 후, 감압분무건조 또는 동결건조하여 제조한다(대한민국 등록특허: 10-1408814-0000호, 2014-06-11).

상기의 십전대보 십일가미탕은 100mg/ml 농도에서 혈전 생성에 중추적인 인간 트롬빈의 활성을 미약하게 저해하며, 22.4초의 트롬빈 타임을 나타낸다(대한민국 등록특허: 10-1408814-0000호, 2014-06-11). 이는 용매 대조구인 물의 경우 18.5초의 트롬빈 타임을, 임상에서 항혈전제로 사용되는 아스피린의 경우 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임이 48.1초의 연장효과를 나타냄을 고려할 때, 십전대보 십일가미탕의 혈전 생성억제 활성은 무시할 정도이다.

이에 본 발명자들은 십전대보 십일가미탕의 순차적 유기용매 분획을 통한 활성물질 정제과정 중, 십전대보 십일가미탕의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획이 특이하게도 매우 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하고, 이의 인간 적혈구에 대한 급성 용혈 활성이 없음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR

10-1408814

B

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 항혈전 활성이 거의 없는 것으로 알려진 십전대보 십일가미탕의 추출물을 대상으로 순차적 유기용매 분획을 통해, 트롬빈 저해, 프로트롬빈 저해 및 혈액응고인자 저해활성이 매우 강력한 항혈전 에틸아세테이트 활성분획을 조제하고, 상기 활성분획이 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없음을 확인하여, 상기 에틸아세테이트 활성분획을 유효성분으로 함유하는 항혈전용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 십전대보 십일가미탕 추출물은 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신, 산조인, 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인 및 산사육으로 이루어지는 한약재를 열수 추출하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 십전대보 십일가미탕 추출물을 헥센과 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어지는 것이 바람직하다.

상기 유효성분은 혈액응고 저해 활성을 나타내는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 유효성분을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 혈액응고와 관련되는 트롬빈 및 프로트롬빈 효소 및 혈액 응고 인자의 강력한 저해를 통해 강력한 항혈전 활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 십전대보 십일가미탕의 에틸아세테이트 분획물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없어 안전하게 이용할 수 있으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 인간 혈장 내에서도 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 크림, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 제약산업 및 식품산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 함유하는 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 발명자는 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 열수로 추출하고, 이를 감압건조하여 십전대보 십일가미탕 추출물을 조제하였으며, 이를 멸균수에 재현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 유기용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 유기용매 분획물과 물 잔류물을 조제하고, 이들 각각의 혈액응고 효소 저해활성 및 혈액 응고인자 저해활성을 확인하였다. 상기의 분획물 중, 강력한 항혈전 활성을 나타내는 에틸아세테이트 분획은 약 80kg 한약재로부터 230g을 회수할 수 있으며, 인간 적혈구 용혈 활성이 나타나지 않아 급성 독성이 없음을 확인하였고, 우수한 열안전성 및 pH 2에서의 내산성, 혈장 안전성을 나타내어 기존의 항혈전제를 대치할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 21종 한약재로부터 추출물의 조제 단계(활성물질 추출단계); 순차적 유기용매 분획을 통한 활성성분의 정제 단계; 활성성분의 안정성 조사단계; 및 인간 적혈구 용혈활성 평가단계를 포함한다.

상기 "추출물"은 냉수, 열수, 에탄올 또는 이들의 혼합용액을 이용하여 추출된 추출물을 포함하며, 구체적인 추출방법은 본 발명의 기술분야에서 공지된 어떠한 방법을 사용하더라도 무방하나, 열수 추출물인 것이 가장 바람직하다.

상기의 열수 추출물은 선별, 수세하여 이물질이 제거된 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 취한 후, 물을 가하여 열수 추출하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는, 상기 한약재 각 성분 100중량부에 대하여 물 10,000~15,000중량부를 첨가하여 열수 추출할 수 있다.

바람직한 구체예로서, 상기 열수 추출물은 선별, 수세하여 이물질이 제거된 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 각각 3.75kg 취한 후, 물 500L를 가해 100~105℃의 조건에서 4시간 동안 열수 추출하고, 최종 추출액의 브릭스는 7.5~8.5, pH는 5.5~6.0의 상태가 되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조제된 추출물은 분말화된 후, 추가적으로 다양한 유기 용매로 분획물을 제조할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용한 순차적인 유기용매 분획물을 회수할 수 있으며, 상기 유기용매 분획물 및 분획 이후의 물 잔류물을 회수하여 본 발명의 혈액응고효소 및 응고인자의 저해활성을 평가하였다. 그 결과, 에틸아세테이트 분획물에서 강력한 항혈전 활성이 나타남을 확인하였다.

본 발명의 에틸아세테이트 분획물은 감압증류, 동결건조 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH 환경에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 용혈활성이 없으면서 강력한 항혈전 활성을 나타내는 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다. 본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효 성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 활성 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

< 실시예 >

실시예 1: 십전대보 십일가미탕(21 대보탕)의 열수 추출물 조제

선별, 수세하여 이물질이 제거된 백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신(백복령), 산조인(산대추), 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인, 산사육(산사자)의 총 21종의 한약재를 각각 3.75 kg을 취한 후 물 500L를 가해 105℃의 조건에서 4시간 동안 열수 추출하였다. 최종 추출액은 진한 갈색의 맑은 액체로 브릭스는 7.5, pH는 5.5이었다.

실시예 2: 십전대보 십일가미탕(21 대보탕)의 열수 추출물의 에틸아세테이트 활성분획물 조제

실시예 1에서 조제된 21대보탕 열수 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적 유기용매 분획을 실시하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 추출물 분말 중량대비 각각의 분획물의 수율과 성분 분석 결과는 표 2에 나타내었다. 이때 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고, 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이, 열수 추출물의 15.1%는 부탄올 분획물로, 80.5%는 물 잔류물로 이행되었으며, 헥센 및 에틸아세테이트 분획은 각각 0.5% 및 3.3%를 나타내어 열수 추출물의 대부분의 성분은 수용성 성분임을 알 수 있었다. 열수 추출물과 분획물의 총 폴리페놀 함량 분석 결과, 에틸아세테이트 > 부탄올 > 열수 추출물 > 헥센 분획 > 물 잔류물의 순으로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 에틸아세테이트 > 헥센 > 부탄올 분획 > 열수 추출물 순으로 나타났으며, 물 잔류물의 경우 검출되지 않았다. 반면, 총당의 경우 물 잔류물 > 부탄올 분획 > 에틸아세테이트 분획 > 열수 추출물 > 헥센 분획 순으로 나타났으며, 환원당 함량의 경우 부탄올 분획 > 물 잔류물 > 열수 추출물 > 에틸아세테이트 > 헥센 분획의 순으로 나타났다. 전체적으로 에틸아세테이트 분획물에서 가장 높은 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 나타내었으며, 21대보탕의 열수 추출물에 비해 폴리페놀 함량은 4배, 플라보노이드 함량은 22.6배 높음을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획물은 약 80kg 한약재로부터 230g을 회수할 수 있었다.

실시예 3: 십전대보 십일가미탕(21 대보탕)의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 항혈전 활성 평가

21대보탕의 열수 추출물 및 순차적 분획물을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 인간 혈장을 이용하여 트롬빈 타임(thrombin time), 프로트롬빈 타임(prothrombin time)과 에이피티 타임(aPTT)을 측정하였다. 각각의 항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였다(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928). 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Hemostasis, MD Pacific, 중국)를 구입하여 사용하였다. 각각의 혈액응고 저해활성 평가법은 다음과 같다.

트롬빈 타임( Thrombin Time )

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time )

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 먼저 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 양호한 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해를 나타내어 각각 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 2.0배, 1.7배 및 1.7배 연장시켰다. 21대보탕의 열수 추출물은 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정한 결과, 각각 1.6배, 1.2배 및 1.2배 연장시켰다. 열수 추출물의 분획물 중에서 헥센, 부탄올 분획 및 물 잔류물은 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임은 1.2~1.7배, 프로트롬빈 타임은 1.1~1.5배, 에이피티 타임은 1.0~1.1배의 연장효과를 나타내어 전체적으로 미미한 항혈전 활성을 나타내었다. 그러나, 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임 및 에이피티 타임은 15배 이상, 프로트롬빈 타임은 3.8배 이상 연장되었으며, 이러한 강력한 항혈전 활성은 농도의존적으로 증가되었다. 이러한 결과는 21대보탕에서는 미미했던 항혈전 활성이, 에틸아세테이트 분획물에서는 매우 강력하게 나타나, 에틸아세테이트 분획물이 다양한 경로의 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있으며, 위장 장애가 보고된 아스피린과 같은 기존의 항혈전제를 대치할 수 있음을 제시하고 있다.

실시예 4: 십전대보 십일가미탕(21 대보탕)의 에틸아세테이트 분획물의 인간 적혈구 용혈활성

실시예 2의 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 인간 적혈구의 용혈활성을 평가한 결과는 표 4에 나타내었다.

먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈활성이 없었으며, triton X-100은 0.1% 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 한편, 21대보탕의 열수 추출물 및 에틸아세테이트 분획을 포함한 다양한 분획물들은 0.5mg/ml 농도까지 적혈구 용혈현상이 나타나지 않아 급성독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다. 따라서, 21대보탕의 에틸아세테이트 분획물은 인간 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해에 의한 강력한 항혈전 효과를 나타내면서, 급성독성 등의 부작용이 없는 천연의 항혈전제로 개발이 유망하며, 기존의 임상에서 사용하는 부작용이 심한 아스피린보다 안전하여, 건강기능식품, 화장품, 의약품 산업에 항혈전제로 사용 가능하리라 판단된다.

실시예 5: 십전대보 십일가미탕(21 대보탕)의 에틸아세테이트 분획물의 산, 열, 혈장 안정성

상기 실시예 2의 21대보탕의 에틸아세테이트 분획물을 각각 100℃에서 30분 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장(Fetal bovine serum)에서 1시간 처리 후 잔존 트롬빈 저해활성을 평가한 결과, 상기의 처리시에 모두 초기 활성을 90% 이상 유지함을 확인하여, 21대보탕의 에틸아세테이트 분획물은 산, 열, 및 혈장 처리시 높은 안정성을 나타냄을 확인하였다.

Claims

백작약, 당귀, 숙지황, 천궁, 황기, 감초, 인삼, 백복신, 산조인, 대추, 산수유, 산약, 구기자, 오미자, 용안육, 내복자, 맥문동, 원지, 황금, 사인 및 산사육으로 이루어지는 한약재를 열수 추출하여 제조하는 십전대보 십일가미탕 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 십전대보 십일가미탕 추출물을 헥센과 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혈전증의 예방 또는 치료는 혈액응고 저해 활성에 의한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항, 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 유효성분을 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.