CN104328069B - 一种新型枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种新型枯草芽孢杆菌及其应用。所述菌株筛选自啤酒厂排污口的污泥，保藏编号为CCTCC NO：M2014396，能以酵母细胞壁为营养物质进行生长和增殖。所述菌株通过与酵母细胞进行混合发酵，能在发酵过程中实现对酵母细胞的破壁处理，取得了意料不到的技术效果，应用前景广阔。

Description

一种新型枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种新型枯草芽孢杆菌及其应用。

技术背景

酵母菌，尤其是啤酒酵母和面包酵母，是具有重要经济价值的单细胞真核微生物。酵母细胞质含有丰富的营养物质，如蛋白质、核糖核酸、B族维生素以及丰富的氨基酸等，其中的呈味核苷酸已经被大量用于食品调味品和保健品原料，也被大量用于动物养殖的诱食剂。酵母细胞壁中的β-1,3葡聚糖能增强哺乳动物的免疫活力、降低胆固醇和血脂、促进伤口愈合等，是一种良好的生物效应调节剂。由于酵母细胞壁很厚，没有经过破壁的完整酵母细胞，上述物质无法释放出来发挥作用，因此，如何高效地、低成本地将酵母细胞破壁是各种酵母副产品深加工工艺要解决的首要问题。

酵母细胞壁厚度约为0.1-0.3μm，结构坚韧，从外向内分三层，主要成分有葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质、几丁质、脂类等。其中葡聚糖和甘露聚糖的含量分别占到细胞壁干重的30%左右。常用的酵母细胞破壁方法有：酸碱水解破壁法、化学破壁法、机械法、自溶破壁法、酶促水解法等。

①酸碱水解法破壁是在酵母菌体中添加酸或碱后加水分解法，常用的酸、碱为盐酸、硫酸、NaOH等，这种方法价格低廉，氨基酸收率高，但是水解后的产品微量营养成分损失大，口味差，色泽不好，环境污染大，在对食品的安全要求越来越高、环保压力越来越的今天，这种方法逐渐淘汰。

②化学破壁法：以甲苯破壁效果最好，但毒性大，而氯仿、乙酸乙酯、对羟基苯甲酸酯等破壁效果一般，且存在化学有毒物质残留的问题。

③机械法：包括高压匀浆、珠磨法、超声波法等，其破壁效率可达90%以上，但对设备条件要求高，且要在低温下操作，以防剪切发热而使蛋白质变性，影响酶解效率，仅适合于实验室操作。

④自溶破壁法：利用酵母菌体本身含有的各种酶（各种蛋白质、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等）的综合作用分解细胞壁的方法。由于酶的发挥作用需要一定条件，而且菌体内的酶多数处于酶原状态，如果不将酶原激活的话，则酶也很难发挥作用。完全靠自溶需要较低的温度和较长的时间，约需3-7天，生产过程易染菌，严重影响产生质量。

⑤酶促破壁法：通过外加酶进行细胞壁分解。有资料表明，当β-1,3葡聚糖酶和木瓜蛋白酶结合使用时，93%的细胞壁被酶解。其中，β-1,3葡聚糖酶主要作用于细胞壁的葡聚糖，导致细胞破裂，木瓜蛋白酶主要用于加速蛋白的水解。酶法破壁必须注意添加酶的种类、比例和顺序，才能实现好的酶解效果。

在目前的实际生产中，以自溶破壁结合酶促破壁法应用最广，但这类方法仍然存在诸多缺陷，如酶用量大、酶成本高，工艺过程复杂等，大大限制了酵母副产品的大规模生产和应用。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌筛选自啤酒厂排污口的污泥，能以酵母细胞壁为营养物质进行生长和增殖。所述菌株通过与酵母细胞进行混合发酵，能在发酵过程中实现对酵母细胞的破壁处理，效果显著。

本发明一方面提供了一种枯草芽孢杆菌K1（Bacillus subtilis K1），已于2014年9月3日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014396。

本发明另一方面提供了一种微生物制剂，其包含上述枯草芽孢杆菌。

所述微生物制剂为液体制剂或菌粉。

有益效果

本发明筛选到的枯草芽孢杆菌K1能以酵母细胞壁为营养物质进行生长和增殖。通过将枯草芽孢杆菌K1和酵母细胞混合发酵，能有效破除酵母细胞壁，48h后，添加枯草芽孢杆菌K1的发酵罐中酵母细胞的破壁率达到95%以上，取得了意料不到的技术效果，应用前景广阔。

具体实施方式

实施例1 以酵母细胞壁为营养物质的菌株的筛选

1、培养基

1）固体选择性培养基：酵母细胞壁粉1%（w/v），酵母膏0.05%（w/v），磷酸二氢氨0.1%（w/v），硫酸氨0.1%（w/v），氯化铁0.01%（w/v），硫酸镁0.01%（w/v），琼脂1%（w/v）。

按比例称取上述组分，用自来水溶解，调节pH值6-7，121℃灭菌20min，制作固体培养平皿备用。

2）液体选择性培养基：酵母细胞壁粉1%（w/v），酵母膏0.05%（w/v），磷酸二氢氨0.1%（w/v），硫酸氨0.1%（w/v），氯化铁0.01%（w/v），硫酸镁0.01%（w/v）。

按比例称取上述组分，用自来水溶解，调节pH值6-7，121℃灭菌20min。

、筛选

样品：山东省青岛市 青岛啤酒厂排污口的污泥。

1）富集培养：取样品10g，加入250mL液体选择性培养基，250rpm，55℃，恒温振荡培养3-5天；

2）选择培养：取上述富集培养后得到的培养液0.1mL，涂布固体选择性培养基，55℃培养48小时。根据菌落大小，共筛选出8株优势菌株，分别命名为K1，K2，K3，……，K8。

实施例2 破壁菌株的筛选

1）将取自青岛啤酒厂的酵母泥100目纱娟过滤除杂，测定水分含量，调节水分获得含水70%-95%的酵母悬液。显微镜下检测酵母细胞情况，结果显示酵母悬液中99%以上的酵母细胞很完整，未破壁。

2）将K1，K2，K3，……，K8菌株分别接种于100mL液体选择培养基中，250rpm，55℃恒温振荡培养48小时；然后加入上述酵母悬液50mL，250rpm，55℃恒温振荡培养48小时，每8小时取少量培养液，在显微镜下观察酵母细胞的破壁情况，计算酵母细胞的破壁率。同时设置空白对照组，即100mL液体选择培养基和酵母悬液50mL，不添加任何菌株。具体结果见表1。

表1 48h内不同菌株对酵母细胞破壁率的影响

菌株	8h	16h	24h	32h	40h	48h
							空白对照	0	0	3.1%	5.3%	6.2%	6.8%
K1	6.5%	18.2%	30.5%	45%	70.6%	85.2%
							K2	1.5%	6%	19.4%	36.1%	44%	45.8%
K3	0	1.2%	7.5%	15.1%	34.2%	40.7%
							K4	7.2%	16.5%	28.4%	40%	52.5	69.6%
K5	3.4%	10.2%	21%	32.5%	38.2%	44.1%
							K6	3.1%	18.3%	35.5%	50.2%	61.9%	70.3%
K7	0	1.5%	10.4%	17.2%	25.5%	29.3%
							K8	0	2.2%	12.8%	19.5%	24.3%	26.8%

从表1的数据可以看出，在不添加任何菌株的情况下，空白对照组的酵母细胞自溶破壁的效率很低，48小时内破壁率才达到6.8%；而通过分别添加K1，K2，K3，……，K8菌株与酵母细胞混合培养，能使酵母细胞的破壁率普遍提高20%-80%，其中又以添加K1菌株混合培养后酵母细胞的破壁率最高，达到85.2%。

实施例3 破壁菌株K1的鉴定

1）K1菌株的生理和生化特性：

菌落扁平，表面粗糙不透明，污白色，芽孢大小0.6-0.9×1.0-1.5μm，椭圆形或柱状，中生或近中生；革兰氏阳性，V-P试验阳性，淀粉水解试验阳性，吲哚试验阳性，可利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇，生长温度范围20-45℃，pH范围5-9。

2）K1菌株的分子生物学鉴定：

采用分子生物学的方法对上述筛选得到的K1菌株进行鉴定，测得其16s rDNA序列，并在GenBank核酸数据库中进行blast比对。结合K1的生物学特性和16srDNA比对结果，申请人确认K1菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），命名为枯草芽孢杆菌K1（Bacillus subtilis K1）。

申请人已于2014年9月3日将上述枯草芽孢杆菌K1（Bacillus subtilis K1）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2014396。

实施例4 酵母水解物的制备

4.1 菌株活化

取冷冻保存的枯草芽孢杆菌K1；无菌条件下吸取100μL枯草芽孢杆菌K1，接种于100mL营养肉汤培养基(pH7.2)中，30℃-60℃，150-300rpm摇床培养15-24h，当OD₆₀₀=0.4即停止培养，得活化菌种。

酵母细胞破壁

酵母泥：取自青岛啤酒厂的啤酒酵母泥。

用100目纱娟对酵母泥进行过滤除杂，加水调节，使其水分含量在70%-95%范围内，即得酵母悬液。显微镜下检测酵母细胞情况，结果显示酵母悬液中99%以上的酵母细胞很完整，未破壁。

将上述酵母悬液移入发酵罐中，然后分别加入已灭菌的硫酸氨溶液、磷酸氢二氨溶液、葡萄糖溶液，使酵母悬液中的总还原糖浓度为2.5%-5%，氨氮的终浓度为0.5-1.5%；再按5-10%的体积比加入活化后的枯草芽孢杆菌K1，50℃发酵36h-48h，发酵过程中控制搅拌速度和通风量。每隔8h取样，分别在显微镜下检测酵母细胞破壁情况。

检测结果显示，发酵48h后，添加枯草芽孢杆菌K1的发酵罐中酵母细胞的破壁率达到95%以上，从而说明将本发明筛选到的枯草芽孢杆菌K1与酵母细胞混合发酵，能有效提高酵母细胞的破壁率，取得了意料不到的技术效果。

酵母水解物的制备

将上述酵母破壁液升温至沸腾，维持10-20h，使水分蒸发；当酵母破壁液浓缩至水分含量约为55%左右，即获得酵母水解膏。取少量酵母水解膏，分别检测其总氮、核苷酸、氨基酸的含量，具体结果见表2；

或者进一步将酵母破壁液浓缩至水分含量约为40%-50%后，进行喷雾干燥（进风温度120-180℃，出风温度70-100℃），即获得酵母水解粉。取少量酵母水解粉，分别测定其中的总氮、核苷酸、氨基酸含量，具体结果见下表3。

表2 酵母水解膏检测结果

表3 酵母水解粉检测结果

从表2和表3的数据可以看出，本发明制备得到的酵母水解膏或酵母水解粉中氨基酸、核苷酸等胞内营养物质含量高，进一步证实了本发明所述方法对酵母细胞的破壁效果好。所述方法通过将枯草芽孢杆菌K1与酵母细胞混合发酵，实现酵母细胞的有效破壁，使胞内营养物质全部释放出来，取得意料不到的技术效果。

本发明直接将枯草芽孢杆菌K1与酵母细胞混合发酵，对酵母细胞壁进行破壁处理，大大缩短了工艺过程，减少生产成本，且破壁效果显著，应用前景广阔。

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CCTCC NO: M 2014396。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在制备微生物制剂中的应用。

3.一种微生物制剂，包含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌。