JPH02211887A - 酵素法によるｌ―スレオニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬品、食品添加物、飼料添加物として有用
なＬ−スレオニンの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来から種々の微生物がＬ−スレオニンアルドラーゼ（
Ｅ、Ｃ，４，１，５，５）産生能を有していることが知
られている。さらに、このＬ−スレオニンアルドラーゼ
を含有するブレビバクテリウム、コリネバクテリウム、
アグロバクテリウム、ブレビバクテリウム、クリプトコ
ツカス、ハンゼニアスボラ等の属を利用して、グリシン
とアセトアルデヒドを反応させて、Ｌ−スレオニンを製
造することも知られている。しかしながら、これらの微
生物を用いると低収率であるうえに、得られたＬ−スレ
オニンも生物学的に活性を有するスレオ体１重量部に対
して、不活性なアロ体が通常１，５〜５重量部の割合で
生成する。さらに、反応の平衡がＬスレオニン合成側に
なく、反応終了時において合成されたＬ−スレオニンに
対して過剰のグリシンが残存し、その後の精製プロセス
において大きな困難をもたらしている。

これを解決する手段として特開昭５６−１２１４９１号
にアリスロバクター属の微生物の存在下でグリシンとア
セトアルデヒドを反応させることを、特徴とするＬ−ス
レオニンの製造方法が提案されている、これにより、Ｌ
−スレオニンの収率が飛躍的に向上し、かつ、合成され
たＬ−スレオニン中のスレオ体とアロ体の比率も従来菌
を使用した場合と逆転する結果が得られている。しかし
、この方法においても、グリシンのＬ−スレオニンへの
転換率を考えた場合、５０％を越えることはなく、その
後の精製プロセスにおけるグリシンとＬ−スレオニンの
分離に大きな障害がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明はシェードモナス属の微生物の存在下でグリシン
とアセトアルデヒドを反応させる上で、Ｌ−スレオニン
合成量を増し、かつ残存グリシン量を減らし、さらには
、合成されたＬ−スレオニン中のスレオ体をアロ体に比
べて優位に合成させることを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はシュードモナス属の微生物の存在下でグリシ
ンとアセトアルデヒドを反応させる際、反応液の温度を
低温に保持することにより、アセトアルデヒドによる酵
素活性阻害を抑えることを見い出した。その結果、グリ
シンのモル数に対して過剰のアセトアルデヒドを添加す
ることが可能になり、最終的にＬ−スレオニンの蓄積量
を増し、かつ、グリシンのＬ−スレオニンへの転換率を
大幅に改善させることとなった。さらに、合成されたＬ
−スレオニン中のスレオ体の占める比率は、常温で反応
を行う場合より、増大していることを見い出し、本発明
に到達したものである。

これに加えて、反応系にマンガン、マグネシウム、カル
シウムの２価金属イオン、さらには、ハイドロサルファ
イドナトリウム、２−メルカプトエタノールの還元剤の
添加が効果的である事実を見い出し、本発明を完成した
。

即ち、本発明は、シュードモナス属の微生物または該微
生物が産生ずるスレオニンアルドラーゼの存在下でグリ
シンとアセトアルデヒドを反応させるＬ−スレオニンの
製造方法において、反応液の温度を０℃〜３０℃に保持
しかつ、反応液のｐ［Ｉを７〜９に保持することを特徴
とするＬ−スレオニンの製造方法を従供するものである
。

本発明において使用される微生物は、シュードモナス属
に属し、スレオニンアルドラーゼ産生能を有するもので
あって、例としてはＮ、Ｃ，１，８，１１０９７菌株を
挙げることができる。

以上の菌株の培養に必要な栄養物としては、特に限られ
るものではなく、公知の諸物質が使用できる０例えば、
炭素源としては、グルコース、スクロース、フラクトー
ス、キシロース、グリセロール、ソルビトール、マンド
ール、糖蜜、Ｓ粉加水分解物のような、使用菌の資化し
うる炭素源が広く利用される。窒素源としては、アンモ
ニア、塩化アンモニウム、硫化アンモニウム、炭酸アン
モニウム、酢酸アンモニウムなどの有機及び無機アンモ
ニウム塩類、コーンステイープリカー、酵母エキス、肉
エキス等が挙げられる。無機塩としては、リン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、食塩、炭酸
水素ナトリウム、炭酸ナトリウムなどが利用できる。

１自養温度は、２０℃〜４０℃で培養は５〜７２時間好
気的に行い、培養液のｐＨは、６〜１０、好ましくは６
．５〜８である。

こうして得られた菌株は、主として微生物の菌体内にス
レオニンアルドラーゼを保有しており、その分離、精製
については、超音波処理、硫安分別、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過などの公知の方法が適用できる
。特に本酵素は熱及びｐＨに対し安定性を示し、７０℃
で１時間の熱処理でも殆ど失活することがなく、この性
質を利用して菌体破砕液を７０℃で１時間処理すること
により精製効果を高めることができる。また本処理時に
マンガン等の金属イオンの存在させることにより、さら
に精製効果をあげることができる。得られた酵素は活性
発現には、ピリドキサールリン酸を必要としている。

該菌体の反応系への供試方法として、生菌体のほか、凍
結乾燥菌体又は、アセトン乾燥菌体として供試できる。

さらに菌体を公知の方法により破砕した菌体破砕物や、
菌体より菌体含有物を抽出した菌体抽出物などの菌体処
理物が利用できる。

また酵素としては粗酵素抽出液や生成した酵素または酵
素液を使用できる。

反応に際しての、アセトアルデヒド濃度は、酵素活性を
著しく阻害しない程度とするが、０．０１〜２モル、好
ましくは、０．０５〜１モルの範囲が好ましい、グリシ
ンは、アセトアルデヒドに対して、等モル以下の濃度で
存在させるとよい。

反応の初ＦＪＩｐＨは６〜１０に設定する。この範囲を
外れるとＬ−スレオニンの合成活性は著しく低下する。

特に７〜９が好ましい。

反応温度はＯ″Ｃ〜３０’Ｃの範囲で行う必要がある一
ｍにアルデヒド類は反応性が高く、特にアミノ酸と共存
した場合にはアミノ酸のアミノ基とシッフ塩基を形成し
、それが原因となってアルデヒドが縮合し、着色物質を
生成することは以前からよく知られている事実である０
本発明においても基質であるグリシンとアセトアルデヒ
ドにより、着色物質が形成され、経時的に褐変する現象
が観測される。こうした着色物質の形成は、原料基質減
少ならびに酵素反応阻害を引き起こすなど好ましからざ
る結果を招くことがある０反応液の温度が３０゛Ｃを越
えると、こうした着色が見られ、原料基質の減少並びに
酵素反応阻害をひきおこし、Ｌ−スレオニン蓄積量が上
がらないばかりか、後の精製プロセスでの脱色操作が必
要となってくる。

また３０°Ｃを越えると、Ｌ−スレオニン合成活性の安
定性が極端に悪くなる上に、合成されたＬ−スレオニン
中の、スレオ体／アロ体比も減少してしまう。

なお、本発明の反応を行う場合、補酵素としてピリドキ
サールリン酸を反応系に添加することにより、酵素活性
が一層高められる。

また、２価の金属イオンの中で、特にマンガン、カルシ
ウム、マグネシウムがＬ−スレオニンの合成活性を増大
させるだけでなく、アロ体に比してスレオ体を優位に合
成させる働きを有していることを見い出した。これらの
金属イオンは、通常塩酸塩、硫酸塩といった無機塩、あ
るいは、酢酸塩の如き有機酸塩の形で反応系に存在させ
ればよい、これらの添加濃度は、０．０１ｓ＋Ｍ〜２０
０ｍＭの範囲が好ましい。

また還元剤ハイドロサルファイドナトリウムを添加する
ことにより、酵素活性を著しく増大させることができる
。ハイドロサルファイドナトリウムの濃度範囲は３〜５
０ａ＋Ｍが好ましい。

さらに２−メルカプトエタノールを好ましくは１ｍＭ〜
１門添加することにより、著しく安定化させることがで
きる。

さらに本発明においては、反応系に種々の添加側を添加
することにより、反応を一層促進させることができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、飛躍的にＬ−スレオニン蓄積量を増し
、かつ合成されたＬ−スレオニン中のスレオ体をアロ体
に比して優位に合成することが達成された。さらには、
従来不可能であったＬ−スレを二：ｉ合成反応の平衡を
Ｌ−スレオニン側に傾け、グリシンのＬ−スレオニンへ
の転換率を９０％近くまで到達させることに成功した。

このことにより、その後のＬ−スレオニンの精製におい
て、残存グリシンとの分離における煩雑さがきわめて軽
減されることとなった。

〔実施例〕

以下に実施例で本発明の詳細な説明する。

なお、以下において％は特記する以外は重量基準である
。

下記の各実施例の残存グリシン量、生成Ｌ−スレオニン
量（スレオ体、アロ体）の測定は高速液体クロマトグラ
フィーにおいて光学分割カラムＥｎａｎｔｉｏ　Ｌｌ　
（東洋曹達株式会社製）を用いて行った。

実施例１ ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、食塩１％から
なる培地を水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調整した。

これを１２０°Ｃ１５分間加熱殺菌したあと、Ｎ、Ｃ，
１，８，１１０９７号菌株を無菌的に接種し、３０℃で
２０時間、好気的に培養した。

培養終了後、培養液５ｉをとって遠心分離し、得られた
菌体を０．０５ａＶＩピリドキサール−５°−リン酸及
び１０５Ｍ２−メルカプトエタノールを含むｐＨ７，０
の溶液０．７ｄに懸濁した。この菌体を超音波処理して
、粗酵素抽出液を得た。

下記に示す組成で各温度で３０分間反応を行い、Ｌ−ス
レオニンのスレオ体の合成活性、スレオ体／アロ体比を
求めた。

基！組成ニ ゲリシン アセトアルデヒド ハイドロサルファイ 硫酸マンガン ピリドキサール−５ 液量 ｐＨ ５０μモル ５０μモル トナトリウム　１０μモル １μモル リン酸　　　０．５μモル Ｉｄ ９．０ 第１表 ＊スレオ体合成活性の単位はｌａｇ蛋白当り、１分間に
１μモルスレオ体を合成する酵素活性とした。

実施例２ 実施例１と同様にして、Ｎ、Ｃ，１，８，１１０９７号
菌を培無して得た菌体を用い、粗酵素抽出液を得た。

実施例１と同様にして、各温度４時間反応を行った後、
反応液を０．０５ｍＭピリドキサール−５°−リン酸及
び１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを含むｐＨ７，０
の透析液にて４℃３時間透析を行い、生成し−スレオニ
ン及び基質を反応液から除去した。ここで、透析した酵
素を用いて新たに実施例１に示す組成で、再度２０℃３
０分間反応を行い、スレオ体の合成活性を測定した。

結果は、第２表の通りであった。同表において残存活性
は、第１回目の反応に供する前のスレオ体の合成活性を
１００％とし、それに対する比率で表した。

第２表 実施例３ 実施例！と同様にして、Ｎ、Ｃ，１，Ｂ、１１０９７号
菌を培無して得た菌体を用い、粗酵素抽出液を得た。

この粗酵素抽出液を６５℃、１時間熱処理後、硫安分別
を行い、その硫安濃度３５〜５０％の両分を分取した。

この画分をセファデックスＧ２００を用いたゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーによりさらに精製し、スレオニ
ンアルドラーゼ活性の高いフラクシッンを得た。

この酵素液を用い、下記に示す組成で各温度１５時間反
応を行い、Ｌ−スレオニンの生成量を求めた。結果は、
第３表の通りであった。

基質組成ニ ゲリシン　　　　　　　　　　　５００μモルアセトア
ルデヒド　　　　　　　５００μモルハイドロサルファ
イドナトリウム　１０μモル硫酸マンガン　　　　　　
　　　　１０ａモルピリドキサールー５”−リン酸　　
　０．５μモル２−メルカプトエタノール　　　５００
μモル蛋白量　　　　　　　　　　　０．２８■／Ｍ１
液量　　　　　　　　　　　　　！＋ｄｐＨ９，０ 第３表 第４表 実施例４ 実施例１と同様にして、Ｎ、Ｃ，１，８，１１０９７号
菌を培無して得た菌体を用い、粗酵素抽出液を得た。

実施例１と同様にして２０℃、３０分間反応を行い、ス
レオ体の合成活性を測定した。なお、その際、基質のｐ
Ｈを３〜１１に変化させた。

結果は第４表の通りであった。同表において相対活性は
ｐＨ９の場合を１００％とし、それに対する比率で表し
た。

実施例５ 実施例１と同様にして、Ｎ、Ｃ，１，８，１１０９７号
菌を培無して得た菌体を用い、粗酵素抽出液を得た。

この粗酵素抽出液を用い、かつ次に示す、各種金属イオ
ンを反応系に５μモルずつ添加して、下記に示す組成で
２０℃３０分間反応を行い、スレオ体の合成活性、スレ
オ体／アロ体比を求めた。結果は第５表の通りであった
。同表において相対活性は、金属イオン無添加の場合を 対する比率で表した。

基質組成ニ ゲリシン アセトアルデヒド ハイドロサルファイトナトリウム 各種金属塩 ピリドキサール−５−リン酸 液量 ｐＨ １００％とし、 第５表 それに ５０μモル ５０μモル １０μモル ５μモル ０．５μモル １Ｍ１ ９．０ 実施例６ 実施例１と同様にして、Ｎ、Ｃ，Ｉ、８．１１０９７号
菌を培無して得た菌体を用い、粗酵素抽出液を得た。

この粗酵素抽出液を用い、かつハイドロサルフィドナト
リウムを次に示す濃度で反応系に添加して、下記に示す
組成で、２０℃３０分間反応を行い、スレオ体の合成活
性を求めた。結果は第６表の通りであった。同表におい
て相対活性は、無添加の場。

合を１００％とし、それに対する比率で表した。

基質組成ニ ゲリシン　　　　　　　　　　　　５０μモルアセトア
ルデヒド　　　　　　　　５０μモルハイドロサルファ
イドナトリウム　各濃度硫酸マンガン　　　　　　　　
　　　１μモルピリドキサールー５−リン酸　　　０．
５μモル液ＩＩＭｉ ｐＨ９，０ 第６表 （添加する場合） 蛋白量 液量 Ｈ ０，０２７■／１１１ ｄ ７．０又は９．０ 第７表 実施例７ 実施例３で得た酵素液を用い、下記に示す組成で１０°
Ｃ１１５時間反応を行い、Ｌ−スレオニンの生成量を求
めた。

結果は第７表の通りであった。

基質組成ニ グリシン　　　　　　　　　　　１００μモルアセトア
ルデヒド　　　　　　　２００μモルハイドロサルファ
イドナトリウム　１０μモル硫酸マンガン　　　　　　
　　　　２μモルピリドキサールー５゛−リン酸　　　
０．５μモル２−メルカプトエタノール　　　　２００
μモル実施例８ 実施例３で得た酵素液を用い、下記に示す組成で、１０
°Ｃ１５時間反応を行ったところ、Ｌ−スレオニンの生
成量は、８３μモル／ｄでグリシンの残存量は１４μモ
ルであった。グリシンのＬ−スレオニンへの転換率は８
６％であった。また、スレオ体／アロ体比は１．７であ
った。

基質組成ニ グリシン アセトアルデヒド ハイドロサルファイトナトリウム 硫酸マンガン ピリドキサール−５−リン酸 ２−メルカプトエタノール 蛋白量 液量 Ｈ １００μモル ３００μモル １０μモル ２μモル ０．５μモル ２００μモル ０．１４■／Ｉｉ ｉ ９．０

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）シュードモナス属の微生物または該微生物が産生
   するスレオニンアルドラーゼの存在下でグリシンとアセ
   トアルデヒドを反応させるＬ−スレオニンの製造方法に
   おいて、反応液の温度を０℃〜３０℃に保持しかつ、反
   応液のｐＨを７〜９に保持することを特徴とするＬ−ス
   レオニンの製造方法。
2. （２）反応系にマンガン、マグネシウムおよびカルシウ
   ムから選ばれた１種または２種以上のイオンを添加する
   ことを特徴とする請求項１記載のＬ−スレオニンの製造
   方法。
3. （３）反応系にハイドロサルファイドナトリウム、２−
   メルカプトエタノールのいずれか、または両方を添加す
   ることを特徴とする請求項１または２記載のＬ−スレオ
   ニンの製造方法。