JPS58187198A - Ｓ−カルボキシメチル−ｌ−システインの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素反応を利用してβ−クロロアラニ／又はセ
リンとチオグリコール酸から８−カーＪＬ−ボキシメチ
ルーＬ−システィンを合成する方法ニ関し、特に、該反
応に於いて、酵素としてピリドキサ−ル・燐酸を補酵素
とする酵素であって且アミノ酸を基質とするとき、その
β−置換反応を促進する働きを有する酵素を用いること
を特徴とする方法に関する。

Ｓ−カルボキンメチル−Ｌ−システィンは喀痰剤などの
医薬品として、或いはビオチン等他の医薬品合成用の中
間体として有用な物質であり、その製造法としては従来
、例えば、システィンとモノクロル酢酸をアルカリ液で
処理する方法等、専ら化学的な合成法のみが知られてい
た。しかし、一般に化学的な合成法ではＳ−力ルボキシ
メチルーＬ−システィ／の如き不斉炭素原子を有する光
学的に活性な化合物を取得するためには１反応原料とし
て相応する光学活性化合物を用いるか或いは反応生成物
を光学分割することが不可避であり、このことがその経
済的な製造を目指す上で大きな障Ｗの１つとなっている
。

本発明者らは比較的入手が容易で経済的にも安価なβ−
クロロ−ＤＬ−アラニ／やＤＬ−セリンメチオグリコー
ル酸を原料とし、これから直接目的とするＳ−カルボキ
シメチル−Ｉ、−システィンを取得し得る方法を開発す
べく棟々検討を重ねた結果、成る種の酵素管用いた酵素
反応を利用することによって所期の目的を達成し得るこ
とを見出し、本発明の方法を完成するに至った。

即ち、本発明はピリドキサール・燐酸を補酵素とする酵
素であって且アミノ酸を基質とするとき、そのβ−置換
反応を促進する働きを有する酵素の存在下にβ−クロロ
アラニン又はセリンとチオグリコール酸を反応させるこ
と全特徴とするＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システィン
の製造法を提供せんとするものである。

以下１本発明の方法について更に詳しく説明する。

ピリドキサール・燐酸を補酵素とする酵素はビタミンＢ
６酵素とも呼ばれ、生体内に於けるアミノ酸の合成、分
解、相互変換などの反応に重要な役割を演じており、そ
の触媒する反応は基質アミン酸のα位の炭素原子を中心
に、脱炭酸、アミン基転移、ラセミ化、α−β脱離、β
−置換、Ｏ−０結合の開裂など極めて多種多様の反応が
含まれている。しかし、この酵素が生体中で触媒する反
応ア の多彩さに比べて、これを産業上有用なアミノ酸の製造
に利用せんとする試みは少なく、実用例としてはＬ−ア
スパラギン酸の脱炭酸反応によるＬ−アラニンの製造等
非常に限られたものしかないことが指摘されている（′
°微生物とその応用第２巻、生体触媒としての微生物″
、第６５頁〜第９２頁、共立出版株式会社；゛°ビタミ
ン″第５１巻第１１号、第４６３頁〜第４７６頁等）。

本発明者らは永年に亘シ、各種のビタミンＢ６酵素の酵
素的特性及びそれらを利用した多くの生理活性アミノ酸
やそれらの誘導体の酵素的合成法について研究を重ねて
きたが、数多くのビタミンＢ６酵素の中で基質アミノ酸
のβ−置換反応を促進する働きを有する一群の酵素がそ
れぞれ前記β−クロロアラニン又はセリンとチオグリコ
ール酸からの８−カルボキシメチル−Ｌ−システィンの
合成反応に特異的に働くことが見出された。該酵素につ
いて代表的なものを列挙すれば、例えば、β−チロシナ
ーゼ（Ｅ　Ｏ４，１，９９，２）、トリプトファナーゼ
（Ｅ　Ｏ４，１，９９，１）、トリプト７アンシンター
ゼ（ｚ　Ｏ４，２，１，２０）　、システィンデスルフ
ヒドラーゼ（Ｅ　Ｏ４，４，１，１）　、システィンシ
ンターゼ（Ｂ　０４，２．９９．８　　）　、　Ｓ−ア
ルキルシスティンリアーゼ（Ｂ　Ｏ４，４，１，６）　
、メチオニナーゼ（Ｅ　Ｏ４，４，１，１１）　、シス
メチオニン−β−シンターゼ（ＦＪｏ　４．２，１．２
２　）　　等があるが、括孤内にエンザイム・コミッテ
ィによる所定の酵素番号（ＥＣ）を明示した通り、これ
らはいずれも公知の酵素であり、その製造、入手に格別
困難はない。また、上記例示した以外の酵素であっても
、前述の通り、ビタミンＢ６酵素であって基質アミノ酸
のβ−置換反応を促進する働きを有する酵素であれば原
則として使用可能である。

伺１本発明の方法の実施にあたり、反応に供すべき酵素
は、その生産菌を培養した培養液をそのまま酵素液とし
て使用しても良く、また、培養液から分離した菌体又は
分離菌体を磨砕、音波処理、酵素消化等の方法で得た菌
体破砕液或いはこれらから遠心分離、塩析、溶剤沈澱等
の方法で得た酵素剤、適当な担体に担持した固定化酵素
剤等その他酵素反応手段として実施される方法であれば
、その態様については特に制限はない。

反応に供すべき酵素として微生物の培養液又は分離菌体
等を用いる場合には、例えば、エルビニア・ヘルビコー
ラ、エシェリヒア働インターメディア、バチルス寺アル
ベイ、フロテラス・レノトゲリイ、エシェリヒア・コリ
、バチルス・ズブチリス、エアロバクター・エアロゲネ
ス、サルモネラ・ティフィムリウム、シュードモナス・
クルジビニ、シュードモナス・プチダ（シュードモナス
・オパリス）、ノイロスポーラ・クラツプ、サツカロミ
セス・セレビシェ等やその他の前記酵素ヲ単独或いは複
数産生ずる能力を有する各種の微生物を適当な培地に培
養する。培地組成としては通常の天然培地か合成培地が
用いられ、炭素源としてグルコース、シェークロース、
澱粉又はその加水分解液、槍密、酢酸、エタノール等、
窒素源としてアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム或いは肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物、大豆粕、コーンスチーブリカー等、また、無機塩
類としてリン酸１カリウム、リン酸２カリウム、リン酸
２ソーダ、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第１
鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸コバルト等が適宜用いられ
る。尚、これらは単なる例示であり、必要に応じて上記
以外の物質を添加、使用し得ることは勿論であり、また
、誘導酵素の生産を目的としてその生産菌の培養を行う
ときは、その菌の特性に従って培地中に特定の基質とな
る物質を添加共存せしめることが必要である。

培養条件は上述の培地組成、添加物の必要性等と同様に
微生物の種類、特性に依り適宜定められるため、必ずし
も一律には規定し侍ないが、一般的な範囲を言えば、温
度２０〜５０℃、Ｐ　Ｈ５，０〜９．０、培養時間１０
〜１２０時間程度が適当であり、振盪培養、曝気培養な
どの好気性条件下に行われる。

本発明の酵素反応によるＳ−カルボキシメチル−Ｌ−シ
スティンの製造の態様については特に制限はないが、通
常は前述の如き酵素を含む反応液で に反応基質としてβ−クロロアラニン又はｌリンとチオ
グリコール酸が添加され、反応が進行する尚、原料とし
てのβ−クロロアラニンやセリンはＬ一体は勿論のこと
、ＤＬ一体をそのまま用いることができる。この際、向
応液中の基質の濃度が高過ぎるときは酵素の種類によっ
てはその酵素活性を阻害される恐れを生じたり、また、
β−クロロアラニンを基質とするとき、反応当初より高
皺度にて用いるとその分解反応を生じたりする恐れがあ
るため、一般に反応基質の液中濃度全０．５〜５重１１
％程度に保つことが適当である。そのため、反応基質特
にβ−クロロアラニンは全蓄を数次に分けて反応液に添
加するか、或いは小量づつ連続的に添加することが望ま
しい。原料モル比は化学量論量で良く、例えば、原料β
−クロロアラニンやセリンとしてＤＬ一体を用いる場合
にはチオグリコール酸１モルに対して２モル用いられ、
またＬ一体を用いるときは１：ｌで良い。しかし、必要
に応じて反応を阻害しない範囲でいずれか一方の原料を
過剰に用いることは別設差支えはない。

酵素の使用量（濃度）は少な過ぎる場合には酵素活性が
不充分であることは勿論であるが、多過ぎ１ても必ずし
も相応する効果が得られるも鍵ではな１く不経済である
と共に微生物の培養液をそのます酵素液として用いる等
の場合には、その種類によっては生成物や基質を分解し
たり、反応を阻害する物質が副生共存することもあり、
そのような場合には余り高＃度の酵素液を用いることは
避けなければならない。具体的には反応に供される酵素
の種類、態様、力価等に基づいて適宜定められ、必ずし
も一律には規定し得ないが、一般的な範囲を言えば反応
液１ｔあだ９１０〜１０，０００　単位（但し、１単位
とは生成物を１μｍｏｌ　／　ｍｉｎにて生成する酵素
量を意味する）程度が適当である。

反応液のＰＨは原則的には酵素の至適ＰＨに依るが一般
的に言って酵素の至適ＰＨはアルカリ側（ＰＨ８位）の
ものが多いが、ＰＨが高過るとβ−クロロアラニンを基
質としたときにはこのイし合物が不安定となり、一方、
酸性側ではβ−クロロアラニンの安定性は増すが、ＰＨ
が低過る場合には酵素が失活する恐れがある。従って、
通常は６〜９の範囲内で行われる。同、反応の進行に伴
って塩素イオンの遊離のため次第にＰＨが低下するため
、必要に応じて適宜アンモニア、苛性ソーダ等のアルカ
リを加えてＰＨを上記範囲内に調整することが望ましい
。反応温度についても酵素の至適温度に依るが、通常は
２０〜５０℃程度が適当である。反応時間は酵素の力価
、基質の濃度、その他回分反応であるか連続反応である
かによって異なる。

生成したＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システィンは反応
液より分離後イオン交換樹脂処理、加溶媒晶析、再結晶
等の手段により精製される。

以下、本発明の方法について代表的な例を示し、更に具
体的に説明する。賞、これらの例は本発明の理解を容易
にするための単なる例示であり、本発明の方法はこれら
のみに限定されないことは勿論のこと、これらによって
何ら制限されないことは言うまでもない。

実施例１ ■　酵素の精製 表−１に示した培地５００ｍ／！に含む２ｔ’Ｊフラス
コに、予めブイヨン培地にて前培養した工／エリヒアー
コリＡＴＣＯ−１５４９１を接種し、２８℃にて２４時
間振揺培養した。

表　　−１ グルコース　　　　　　　　　　５．０　　　？／ｌク
エン酸　　　　　　　　　　２０ カザアミノ酸　　　　　　　　　０５ に２ＨＰＯ４１Ｏ Ｎ　ａ　Ｎ　Ｈ４ＨＰ　Ｏ４３，５ Ｍ　ｙ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈ２００，２ インドール　　　　　　　　　　０．００５＃このよう
にして得られた培養液１００ｔを１０．００Ｏｒｐｍで
遠心後湿重量５５０２の菌体を得た。この菌体を５℃、
３０分間の超音波処理により破壊し、無細胞抽出液２．
２１を得た。この無細胞抽出液より、硫安分画、ＤＥＡ
Ｒ−セファデックスによるカラムクロマトグラフィー、
セファデックス０−２００によるゲル濾過などの常法に
より比活性が９．４単位／〜の純粋なトリプトファンシ
ンターゼ１０．６■を得た。

■　反応 このようにして得られた酵素３４単位を表−２に示した
組成の反応’ｆｔ　２００　ｍｌに加えて、３７℃に ばて１０時間反応を行った。

表　　−２ チオグリコール酸　　　　　　　　　４．６　ｆβ−ク
ロロ−ＤＬ−アラニン　　　１２．３７Ｆビリドキサル
りん酸　　　　　　　　　８．０ηＥＤＴＡ・２ナトリ
ウム　　　　　　１．５ｆＯ５２Ｍホウ酸ナトリウムバ
ッファー（ＰＨ８，０）　２５０　ｍｅ全液量　　　　
　　　　　　　　　　　１ｔ＊トリグトファン合成酵素
の１単位は、３７℃において１μｍｏｌ　／　ｍｉｎの
トリプトファンをセリンとインドールから合成する酵素
量とする。

反応開始後、３０分毎にβ−クロロ−ＤＬ−アラニン０
，６ｆを加え、その度に反応液のＰＨを２Ｎ　ＮａＯＨ
で８．０に調節する。また反応開始ｌＩ＆１時間毎にチ
オグリコール＠　０．２３　ｇｉ添加する。反応開始後
９時間目にこれら基負の添加は終了する。

反応終了後、６ＮＨＯ１ｆ４０−加え反応を停止し、反
応液を遠心分離し、上清のＳ−カルボキシメチルシステ
ィンの定量を行ったところ、２．３９生成蓄積していた
。

実施例２ 実施例１のようにして得た純粋なトリプトファン合成酵
素３４単位金用いて表−３に示した組成の反応＊　２　
Ｑ　Ｏｍｌに加えて３７℃で１０時間反応を行った。

表　　−３ チオグリコール酸　　　　　　　　　４．６ｔＬ−セリ
ン　　　　　　　　　　　　５３＃ビリドキサルシん酸
　　　　　　　　８０■ＥＤＴＡ・２ナトリウム　　　
　　　　１５２０．２Ｍホウ酸ナトリウムバッツ７−（
ＰＨ８，０）２５０ｍｌ全液量　　　　　　　　　　　
　　　　１を反応終了後６　Ｎ　ＨＯｔ’ｉｉ　４０−
加え反応を停止する。反応液を遠心分離し、上清の８−
力ルボキシメチルシスティンの定量を行ったところ３．
１２生成していた。

実施例３ ■　酵素の固定化 実施例１のようにして得た酵素標品１２．θ単位（ｘ、
ｚｓｑ）をＩＭりん酸カリウム緩衝液（ＰＨ７、４）　
２．　ｓ−に溶解した溶液をＯｘｇｒａｎ　Ａｃ４＋１
ｃＢｅａｄｓ　（商品名Ｅｕｐｅｒｇｉｔ　Ｏ＋　Ｒｏ
ｈｍ　Ｐｈａｒｍａ社製）６２５Ｈｉに加え、内径２５
ｃｒｎの平底のガラス容器中で２５℃にて２時間反応す
る。反応後、６−の０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（Ｐ
Ｈ７，８）（２−メルカプトエタノール１０ｍＭ１ビリ
ドキサールりん酸０．０２ｍＭ、ＥＤＴＡ４ｍＭを含む
）で、３回洗浄し、反応を停止する。洗液中には酵素活
性は検出できなかった。このようにして得た固定化酵素
は、固定化前の２６．９チの酵素活性を有していた。

■　反応 このようにして得た同定化酵素１２．３単位を表−２に
示した組成の反応ｙ　ｔ　ｏ　ｍｌに加え３７℃にて反
応を行った。反応開始後、時間を置いて０１−の反応液
をとりろ過により反応を停止し、ろ液のＳ−カルボキシ
メチルシスティンの定量を行ったところ、表４に示すよ
うな結果を侍た。

表−４固定化トリプトファン合成酵素によるＳ−カルボ
キシメチルシスティンの合 成 ネ応時間　　Ｓカルボキシメチル７ステイン生成量９／
１３０分　　　　　　１２ １時間　　　　　　　　１．７ ２　　ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
５３　　Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５４　　ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２７実施例４ ■　酵素液の調製 表−５に示した培地５００７’ｉ含む２を容フラスコ２
本に予めブイヨン培地にて前培養したバチルスズブチル
ス８Ｄ−９（微工研菌寄第１４８３号）を接種し、２８
℃で２４時間振揺培養した。

表　　−５ （ＮＨ４）２ｓｏ４　　　　　　２　　ｆ／１Ｋ２ＨＰ
Ｏ４１４ ＫＨ，、ＰＯ２６ クエン酸ソーダ　　　　　　　Ｉ ＭｙＳＯ４・７Ｈ２００，２１ グルコース　　　　　　　　２０ 培養液から菌体を遠心分離し、湿重量７ｔの菌体を得、
これを３５ｒｎｌの０．０２　Ｍりん酸緩衝液ＰＨ７，
５に懸濁した。この懸濁液を５℃で１５分間超音波処理
し、無細胞抽出液２８−を得た。この無細胞抽出液は９
．０単位のトリプトファン合成酵素を含んでいた。

この酵素液を用いて、実施例１の■と同じ方法でＳ−力
ルポキシメチルシステインの合成反応を行ったところ、
反応液の上清に０８．８ｖのＳ−カルボキシメチル−Ｌ
−システィンが生成蓄積していた。

実施例５ 表−６に示した培地５００　ｍｌ　ｋ含む２を容フラス
コ２本に予めブイヨン培地にて前培養したエルピニアへ
ルビコーラＡＴ００２１４３４’１ｉｌｌｉし、２８℃
にて２８時間振揺培養した。

表　　−６ Ｌ−チロシン　　　　　　　　２２／１ＫＨ２ＰＯ４１ Ｍ　ｙ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２００，５ フマール酸　　　　　　　　　７ グリセリン　　　　　　　　６ グリシン　　　　　　　　　　０５ ＤＬ−アラニア　　　　　　　３ ＤＬ−メチオニン　　　　　　１５ 酵母エキス　　　　　　　　１０ ピリドキシン Ｐ　Ｈ７，５ 遠心分離により湿重量２０２の菌体を得て、これを、０
．０１　Ｍりん酸カリ緩衝液（ｐ　Ｈｅ、　ｏ　）１０
０−に懸濁した。この懸濁液を５℃で３０分間超音波処
理し、無細胞抽出′ｅ７０−を得た。この無細胞抽出液
は、２２０単位のβ−チロンナーゼ活性を有していた。

このようにして調製した酵素４４単位を用いて、実施例
１の■のようにして反応を行ったところ、反応液の上清
に０６７の８−カルボキシンチル−Ｌ−システィンが生
成していた。

の ＊＊　β−チロシナーゼ４１単位は３０℃において１１
μｍｏｌ　／　ｍｉｎのピルビン酸を、Ｌ−；ロシ由か
ら生成する酵素量とする。

実施例６ 表−７に示した培地５００−を含む２を容フラスコ２本
に予めブイヨン培地にて前培養したエシェリヒアユリＡ
ＴＯＯ１０７９８を接種し、２８℃にて２０時間振揺培
養した。

表　　−７ Ｌ−１リプトフアン　　　　　６．ｏ？／ｌコーン・ス
テイブ奉りカー　６０ ツルポールＷ−２００４０ 酵母エキス　　　　　　　　　４１ Ｌ−システィン　　　　　　　０．６１ＤＬ−メチオニ
ン　　　　　　ｏ、ａｔ／ＬＬ−プロリン　　　　　　
　　　０．３１Ｌ−アルギニン　　　　　　　０．６１
コハク酸　　　　　　　　　　３ ＫＨ２Ｐ　Ｏ４３、ｚ Ｍ　ｙ　８０　ａ・７Ｈ２０３ ｐ　ｌ（７，０ 培養液から遠心分離により湿重量１０１・の菌体を得た
。これを５（ｌｄの０．　ＯＩ　Ｍりん酸カリウム緩衝
液Ｐ　Ｈ７，０に懸濁した。この懸濁液を５℃でた。こ
の無細胞抽出液は１０２単位のトリプトファナーゼ活性
を有していた。このようにして調整した酵素５１単位を
用いて実施例１の■のようにして反応を行ったところ１
反応液の上清に、０５２のＳ−カルボキシメチル−Ｌ−
システィンが生成蓄積していた。

＊＊＊トリプトファナーゼの１単位は、３０℃において
、１μｍｏｌ　／　ｍｉｎのピルビン＃ｔｆＬ−トリプ
゛トファンから生成する酵素量とする。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ピリドキサール・燐酸を補酵素とする酵素であって且ア
   ミノ酸を基質とするときそのβ−置換反応を促進する働
   きを有する酵素の存在下にＩ−りと ロロアラニン又はセリンｒチオグリコール酸を反応させ
   ることを特徴とするＳ−カルボキ７メチルーＬ−システ
   ィンの製造法。 ２）酵素がβ−チロシナーゼ、トリプトファナーゼ、ト
   リプトファンシンターゼ、ンステインデスルフヒドラー
   ゼ、システィン・／／ターゼ、Ｓ−アルキルシスティン
   リアーゼ、メチオニナーセ又ハンスタチオニンーβ−シ
   ンターゼから選ばれる少くとも一種である特許請求の範
   囲第１項のＳ−カルボキシメチル−Ｌ−システィンの製
   造法。