FR2580667A1

FR2580667A1 - Procede de preparation enzymatique de l-amino acides renfermant du soufre

Info

Publication number: FR2580667A1
Application number: FR8605758A
Authority: FR
Inventors: Masao Shimada; Takeshi Nakamura; Kenichi Ishiwata; Nobuyoshi Makiguchi; Masami Uemura
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-22
Publication date: 1986-10-24
Also published as: CH666695A5; AU562772B2; KR860008273A; JPS61242589A; CA1299127C; GB2174390B; KR890004021B1; JPH0527389B2; DE3613388A1; GB8609015D0; GB2174390A; FR2580667B1; IT1190275B; DE3613388C2; IT8647912A0; NL8600984A; AU5634886A

Abstract

PROCEDE DE PREPARATION ENZYMATIQUE DE L-CYSTINE ET DE L-CYSTEINE. IL CONSISTE A FAIRE REAGIR UNE L-ALANINE B-SUBSTITUEE AVEC UN SULFURE, SULFHYDRATE OU POLYSULFURE, DE METAL OU D'AMMONIUM, EN PRESENCE DE TRYPTOPHANE SYNTHASE. CE PROCEDE PERMET D'OBTENIR, AVEC UN FAIBLE COUT, A L'ECHELLE INDUSTRIELLE, DES PRODUITS INTERESSANTS NOTAMMENT EN COSMETOLOGIE, EN ALIMENTATION ET EN MEDECINE.

Description

La présente invention se rapporte à un procédé

de préparation de L-cystéine et/ou de L-cystine, par ré-

action d'une L-alanine >-substituée avec un sulfure, un sulfhydrate ou un polysulfure métallique, ou bien avec un sulfure, un sulfhydrate ou un polysulfure d'ammonium,

en présence de tryptophane synthase.

La L-cystéine et la L-cystine sont largement

utilisées pour des applications cosmétiques, dans l'indus-

trie alimentaire comme additifs et pour d'autres applica-

tions, y compris des applications médicales, par exemple

comme constituants de produits de perfusions.

On connaît à ce jour différents procédés de

préparation de L-cystéine et de L-cystine: les plus uti-

lisés sont (1) l'extraction à partir de substances natu-

relles comme les cheveux, (2) des synthèses chimiques com-

me par exemple celle qui est décrite dans la demande de brevet japonais publiée N SHO 57-200356, (3) une synthèse

enzymatique à partir d'acide DL-amino-2 thiazoline carbo-

xylique-4, décrite dans le brevet japonais publié N SHO 54-2272, et (4) une réaction d'une alanine a -substituée avec un sulfure ou un sulfhydrate métallique, en présence

d'une cystéine désulfhydrase, décrite dans le brevet japo-

nais publié N SHO 57-21311. Toutefois, ces procédés ne

s'avèrent pas forcément avantageux à l'échelle industriel-

le.

La présente invention permet d'éviter cet in-

convénient de l'art antérieur, et d'obtenir de la L-cystéi-

ne et/ou de la L-cystine, à faible coût.

Le nouveau procédé selon l'invention consiste à faire réagir une Lalanine -substituée avec un sulfure, un sulfhydrate ou un polysulfure métallique, ou bien un sulfure, un sulfhydrate ou un polysulfure d'ammonium, en

présence de tryptophane synthase.

La tryptophane synthase est connue pour être largement répandue, notamment dans les micro-organismes et les végétaux supérieurs (Voir par exemple Bacteriological

Reviews, Vol. 39, N02, pp.87-120 (1975)>.

Conformément à l'invention, on utilise habi-

tuellement de la tryptophane synthase provenant de micro-

organismes, mais la source d'enzyme n'est pas limitée à ceux-ci. Les souches productrices de tryptophane synthase comprennent, par exemple, Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20), Neurospora

- crassa ATCC-14692 et Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787.

Les procédés d'extraction de la tryptophane synthase à partir des cellules cultivées sont connus et décrits respectivement dans The Journal of Biological Chemistry, Vol. 249, N 24, pp. 7756-7763 (1974) pour E. Coli; The Journal of Biological Chemistry, Vol. 250, N8, pp.2941-2946 (1975) pour Neurospora crassa; et European Journal of Biochemistry, Vol. 102, pp.159-165

(1979) pour Saccharomyces cerevisiae.

La tryptophane synthase, utilisée conformément à l'invention, n'est pas forcément une enzyme extraite et

purifiée. On peut utiliser des cultures de micro-organis-

mes producteurs de tryptophane synthase, des cellules vi-

vantes recueillies par centrifugation ou procédé similaire à partir de cultures, des cellules séchées de même origine, et des débris de cellules obtenus par broyage, traitement aux ultrasons ou autres traitements de ces cellules, ainsi que par autolyse. On peut également utiliser des extraits de ces cellules, et des enzymes brutes provenant de ces extraits. En outre, peuvent être naturellement utilisées conformément à l'invention, des enzymes ou des cellules

imobilisées.

Convient tout milieu synthétique ou naturel, pour la culture des cellules productrices de tryptophane synthase, pourvu qu'il renferme une source de carbone, une source d'azote, des sels minéraux, et, éventuellement une petite quantité de substance nutritive mineure. Il peut être parfois efficace d'ajouter une petite quantité de tryptophane ou d'indole au milieu de culture. La quantité

de tryptophane synthase produite peut être aussi quelque-

fois accrue par l'addition au milieu d'une faible quantité d'acide indole acrylique. La culture se déroule en aérobie avec aération par agitation ou secouage. La température est comprise dans l'intervalle de 20 à 40 C, habituellement entre 25

et 37 C. Le pH du milieu de culture varie de 5 à 8.

Il est bien connu que la tryptophane synthase est une enzyme multifonctionnelle, c'est-à-dite une enzyme qui ne catalyse pas seulement la synthèse du L-tryptophane à partir de l'acide indole glycérophosphorique-3 et de la L-sérine, mais qui catalyse également beaucoup d autres réactions (Voir, par exemple Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, Vol. 49, pp.127-185 (1979)). Cependant, on constate pour la première fois que

la réaction selon la présente invention pouvait être ca-

talysée par cette enzyme.

Les L-alanines -substituées, l'un des sub-

strats de la réaction, pouvant être utilisées conformément à l'invention, comprennent notamment - des <-halogéno

L-alanines, comme -chloro L-alanine et ( -bromo L-alani-

ne; des O-alkyl L-sérines, comme O-méthyl L-sérine et O-éthyl L-sérine; des S-alkyl L-cystéines comme S-méthyl L-cystéine et S-éthyl L-cystéine; lO-acétyl L-sérine; l'O-benzyl L-sérine; S-benzyl L-cystéine; le O-sulfate

de L-sérine; la L-sérine; et similaires.

Conviennent comme sulfures, sulfhydrates ou

polysulfures, l'autre substrat de la réaction selon l'in-

vention, par exemple des sulfures métalliques comme sul-

fure de sodium, de potassium ou de lithium; des sulfhy-

drates métalliques comme sulfhydrate de sodium, de potas-

sium ou de lithium; des polysulfures métalliques comme

polysulfure de sodium ou de potassium; du sulfure, du sul-

fhydrate ou un polysulfure d'ammonium; et produits si-

milaires.

Conformément à l'invention, la L-alanine --sub-

stituée et le sulfure, sulfhydrate ou polysulfure, sont habituellement mis à réagir dans un milieu aqueux, à un pH de 6 à 10, en présence de tryptophane synthase. La température de réaction est convenablement choisie dans l'intervalle de 20 à 60 C. La durée de la réaction est généralement de 1 à 100 heures par opération, bien qu'elle

puisse varier en fonction du titre de l'enzyme, des con-

centrations des substrats utilisés, et des autres condi-

tions. On opère au repos ou sous légère agitation.

Les concentrations des substrats, la L-alanine -substituée et le sulfure, sulfhydrate ou polysulfure,

ne sont pas particulièrement limitées, mais sont habituel-

lement comprises dans l'intervalle de 0,1 à 30% en poids.

Les substrats peuvent être introduits en totalité, en une fois, au départ de la réaction, ou bien par portions, à mesure que se déroule la réaction. Il est souhaitable que

la quantitéde sulfure, sulfhydrate ou polysulfure, présen-

te dans le milieu de réaction, soit, en quantité molaire,

égale ou supérieure à la quantité du dérivé de L-alanine.

Au cours de la réaction, il est souhaitable d'ajouter une

petite quantité d'une co-enzyme, le phosphate de pyridoxal.

Lorsqu'on utilise comme source d'enzyme des cellules, ou des milieux de culture, d'un micro-organisme

capable de produire de la ttyptophane synthase, le rende-

ment peut être accru par l'addition d'au moins l'un des composés suivants au milieu réactionnel: alcools, esters, cétones et produits tensio-actifs. Conviennent, en tant qu'alcools, éthanol, propanol-1, propanol-2, butanol-1, butanol-2, alcool isobutylique, alcool tert-butylique, pentanol-1, octanol-1 et similaires. Les esters pouvant être utilisés comprennent le formate d'éthyle, de propyle ou de butyle, l'acétate d'éthyle, de propyle, de butyle ou d'isobutyle, et similaires. Comme cétones on peut utiliser notamment l'acétone, la méthyl éthyl cétone, la méthyl isobutyl cétone, et similaires. Conviennent en particulier comme produits tensio-actifs, des produits anioniques comme sulfate sodique de dodécyle et désoxy- cholate de sodium; des produits non ioniques comme les

éthers d'octyle phényle, et d'autres produits tensio-

actifs. La quantité de ces composés, introduits dans le milieu réactionnel, est généralement comprise entre 0,01 et 5% en poids, bien que cela puisse varier selon le type

de composés ou de souche utilisé. -

Lorsque la réaction se déroule de cette ma-

nière, le mélange de réaction contient en général un mé-

lange de L-cystéine et de L-cystine, car la L-cystéine

produite est facilement oxydée et convertie en L-cystine.

Au fur et à mesure que la réaction se développe, la quantité de L-cystine augmente progressivement. Cependant, on peut faire varier le taux de concentration en L-cystéine par rapport à celui de L-cystine, en réglant les conditions

de réaction. La L-cystéine, ou la L-cystine, peut être ré-

cupérée à partir du milieu de réaction par tout moyen clas-

sique. Par exemple, la L-cystine, qui est difficilement

soluble dans l'eau, peut être facilement isolée par aéra-

tion du milieu réactionnel afin d'oxyder une proportion majeure de Lcystéine en L-cystine, après l'achèvement de

la réaction. La L-cystéine peut être obtenue par soumis-

sion de la L-cystine ainsi obtenue à une réduction électro-

lytique. La mesure quantitative de la L-cystéine et de la L-cystine s'effectue par chromatographie liquide. De

plus, la chromatographie liquide sur colonne, pour sépa-

rer les isomères optiques, montre que la cystéine et la cystine produites ont toutes les deux la configuration L. L'invention est illustrée plus en détail dans

les exemples non limitatifs suivants.

EXEMPLE 1

On ensemence Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) dans un milieu liquide renfermant 1% d'extrait de viande, 0,5% de peptone, 0,1% d'extrait de levure et 0,2% de KH2PO4, à pH 7, et l'on cultive avec agitation

à 30 C pendant 20 heures. Puis, les cellules sont recueil-

lies par centrifugation et l'enzyme est purifiée selon le procédé de O. Adachi et coll., The Journal of Biological

Chemistry, Vol. 249, N 24, pp.7756-7763 (1974). La tryp-

tophane synthase ainsi obtenue, ayant une activité spé-

cifique (titre) de 9,2 unités/mg, est utilisée dans la réaction suivante. L'activité enzymatique est dosée par le procédé de C. Yanofsky et coll., Methods in Enzymology, Vol. 15, pp.801-807 (1962). L'unité est représentée par

la quantité de l'enzyme produisant 1 gmol/minute de tryp-

tophane à partir de L-sérine et d'indole, à 37DC et pH 7,8.

On introduit 0,5 mg de tryptophane synthase dans 10 ml de milieu de réaction, à pH 8,5, renfermant 50 mM de L-sérine, mM d'un sulfure, sulfhydrate ou polysulfure indiqué dans le tableau 1, et 0,1 mM de phosphate de pyridoxal, et

l'on agite légèrement à 35 C pendant 10 heures. Les concen-

trations de L-cystéine et de L-cystine produites, ainsi

que le rendement total rapporté à la L-sérine, sont repor-

tés dans le tableau 1.

TABLEAU 1

Sorte de sulfure L-cystéine L-cystine Rendement ou similaire (mM} (mM) (mole%) Sulfure de sodium 18 6,5 62 Sulfhydrate de sodium 16 5 52 Sulfure de potassium 11 3,5 36 Sulfure d'ammonium 8 1,5 22 Sulfhydrate d'ammonium 6 2 20 Trisulfure d'ammonium 6 1,5 18 Disulfure de sodium 11 3 34

EXEMPLE 2

On cultive Neurospora crassa ATCC-14692 selon le procédé de W.H.Matchett et coll., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 250, N 8, pp.29412946 (1975), et l'enzyme obtenue est purifiée. Cette tryptophane syn-

thase a une acticité spécifique de 1,3 unités par mg.

Cette enzyme liquide est utilisée dans la réaction suivan-

te. 10 ml de milieu réactionnel (pH 8,5) renfermant 50 mM de L-sérine, 100 mM de sulfhydrate de sodium, 0,1 mM de

phosphate de pyridoxal et 1,3 unités de tryptophane syn-

thase, est doucement secoué à 35 C pendant 10 heures. Il

y a production dans le milieu de réaction de 12 mM de L-

cystéine et de 4 mM de L-cystine.

EXEMPLE 3

On ensemence avec Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787, un milieu liquide renfermant 1% de peptone, 0,5% d'extrait de levure, 2% de glucose et 0, 01% d'acide indole acrylique, pH 6, et l'on cultive sous agitation à C pendant 20 heures. Puis on recueille les cellules de la culture par centrifugation. L'enzyme est purifiée selon le procédé de M.Dettwiler et coll., European Journal of Biochemistry, Vol. 102, pp.159-165 (1979). On obtient ainsi une tryptophane synthase ayant une activité spécifique de

1,2 unités par mg.

Cette enzyme liquide est utilisée pour effectuer la réac-

tion suivante. 10 ml de'liquide réactionnel renfermant mM de L-sérine, 100 mM de sulfhydrate de sodium, 0,1 mM de phosphate de pyridoxal et 1,2 unité de tryptophane synthase, pH 8,5, sont doucement secoués à 35 C pendant

10 heures. Le liquide résultant contient 11 mM de L-cys-

téine et 3 mM de L-cystine.

EXEMPLE 4

Un milieu liquide à pH 7, renfermant 1% d'ex-

trait de viande, 0,5% de peptone, 0,1% d'extrait de levu-

re et 0,2% de KH2PO4, est ensemencé avec Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20), et l'on secoue à 30 C pendant 20 heures. Puis on recueille les cellules par centrifugation

et on les utilise comme source de tryptophane synthase.

Les cellules humides ont une activité spécifique de 120 unités/gramme.

Un milieu de réaction (100 ml) renfermant 200 mM de L-

sérine, 300 mM de sulfure de sodium, 0,1 mM de phosphate de pyridoxal et 5 g de cellules humides, ajusté à pH 8,5 avec HCl, est secoué à 35 C pendant 24 heures. Lorsque la réaction est achevée, la L-cystine présente dans le milieu

de réaction est réduite en L-cystéine au moyen de dithio-

thréitol. La quantité de L-cystéine produite est de 98 mM.

EXEMPLE 5

On utilise dans la réaction suivante la tryp-

tophane synthase obtenue dans l'exemple 1.

500 unités de tryptophane synthase sont introduites dans ml d'un liquide de réaction renfermant 300 mM d'un L-alanine >-substituée indiquée dans le tableau 2, 600 mM de sulfhydrate de sodium, 1 mM de phosphate de pyridoxal et 480 mM de tampon trisaminométhane-HCl, pH 8,5, et l'on agite doucement à 35 C pendant 1 heure. Lorsque la réaction

est achevée, la L-cystine présente dans le liquide réac-

tionnel est réduite en L-cystéine au moyen de dithiothréi-

tol, puis l'on mesure la quantité de L-cystéine. Les résul-

tats sont représentés dans le tableau 2.

TABLEAU 2

L-alanine ( -substituée L-cystéine (mM) C-chloro L-alanine 82 0-méthyl Lsérine 116 O-acétyl L-sérine 95 O-benzyl L-sérine 24 S-méthyl L-cystéine 27 S-éthyl L-cystéine 18 S-benzyl L-cystéine 5 O-sulfate de L-sérine 37 Lsérine 123

EXEMPLE 6

On ensemence avec Escherichia coli MT-10232

(FERM BP-19) un milieu liquide à pH 7, renfermant 1% d'ex-

trait de viande, 0,5% de peptone, 0,1% d'extrait de levu-

re et 0,2% de KH2PO4, et l'on secoue la culture à 30 C pen- dant 20 heures. Puis les cellules sont recueillies par

centrifugation et sont congelées à -20 C pour être conser-

vées comme source de tryptophane synthase. Ces cellules humides ont une activité de tryptophane synthase de 89 unités/gramme. Dans la réaction suivante on utilise ces

cellules conservées. 100 ml d'un milieu de réaction ren-

fermant 200 mM de L-sérine, 300 mM de sulfure de sodium,

0,1 mM de phosphate de pyridoxal, 100 mM de tampon tri-

saminométhane-HCl (pH 8,5) et 5 g de cellules humides, sont doucement secoués à 35 C pendant 10 heures. Lorsque la réaction est terminée, la Lcystine présente dans le milieu réactionnel est réduite au moyen de dithiothréitol et l'on mesure la quantité de L-cystéine produite. Cette

quantité est de 114 mM.

EXEMPLE 7

On utilise les cellules humides obtenues dans

l'exemple 6. 100 ml d'un liquide réactionnel à pH 8, ren-

fermant 200 mM (2,1 g) de L-sérine, 1000 mM de sulfhydrate de sodium, 0,1 mM de phosphate de pyridoxal et 5 g de cellules humides, sont doucement agités à 35 C pendant 10

heures. On ajoute encore de la L-sérine au bout de 2 heu-

res, et de 5 heures, après le début de la réaction, à rai-

son de 2,1 g chaque fois. Au cours de la réaction, le pH

du liquide réactionnel est maintenu à 8 par addition d'a-

cide phosphorique 6N. Lorsque la réaction est achevée, il s'est accumulé dans ce liquide 4,3 g de L-cystéine et

1,1 g de L-cystine.

EXEMPLE 8

On utilise, comme source de tryptophane syn-

thase, directement les cellules humides obtenues dans 1-

l'exemple 4.

ml d'un milieu réactionnel à pH 8,5, renfermant 200

mM de L-sérine, 300 mM de sulfure de sodium, 1 mM de phos-

phate de pyridoxal, 5 g de cellules humides et un composé indiqué dans le tableau 3, sont doucement agités à 35 C pendant 5 heures. Le pH du milieu est réglé pendant la réaction à 8,5 - 0,3. Lorsque la réaction est terminée,

la L-cystine présente dans le milieu réactionnel est ré-

duite en L-cystéine au moyen de dithiothréitol, et la quantité de Lcystéine produite est alors mesurée. Les

résultats sont indiqués dans le tableau 3.

TABLEAU 3

Composé ajouté (concentration en g/l) Quantité de L-cystéine (mM) Témoin (0) 67,2 Ethanol (10) 99,6 Propanol-1 (10) 119,4 Propanol-2 (10) 105,6 Butanol-1 (10) 140,0 Butanol-2 (10) 128,7 Alcool.isobutylique (5) 114,8 Alcool tert-butylique (5) 107,2 Pentanol-1 (5) 106,5 Octanol-1 (10) 128,7 Formiate d'éthyle (5) 96,7 Formiate de propyle (5) 99,8 Formiate de butyle (5) 104,3 Acétate de méthyle (5) 98,4 Acétate d'éthyle (5) 108,9 Acétate de butyle (5) 162,5 Acétate d'isobutyle ( 5) 129,1 Acétone (5) 96, 5 Méthyl éthyl cétone (5) 111,8 Méthyl isobutyl cétone (5) 167,0 Désoxycholate de sodium (1) 139,4 Sulfate sodique de dodécyle (1) 160,9 Triton X-100 (1) 160,7

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de L-cystine et de

L-cystéine à partir d'une L-alanine C -substituée, ca-

ractérisé en ce qu'on fait réagir ce composé avec un sul-

fure, sulfhydrate ou polysulfure, de métal ou d'ammonium, en présence de tryptophane synthase.

2. Procédé selon la revendication 1, carac-

térisé en ce que la L-alanine >-substituée est représen-

tée par la formule:

X-CH -CH-COOH

2 1

NH2

dans laquelle X est un atome d'halogène, de préférence chlore ou brome, ou un groupement -OR ou -SR, R étant un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle, acétyle, benzyle

ou acide sulfonique.

3. Procédé selon une des revendications 1 ou

2, caractérisé en ce que le métal du sulfure, sulfhydrate

ou polysulfure, est sodium, potassium ou lithium.

4. Procédé selon une des revendications 1 à 3,

caractérisé en ce que la quantité molaire de sulfure, sulfhydrate ou polysulfure, est égale ou supérieure à

celle de L-alanine b-substituée.

5. Procédé selon une des revendications 1 à

4, caractérisé en ce qu'on opère en présence d'une faible

quantité de phosphate de pyridoxal, en tant que co-enzyme.

6. Procédé selon une des revendications 1 à

, caractérisé en ce que la réaction se déroule en présence d'au moins 0, 01 à 5% en poids d'un alcool, d'un ester,

d'une cétone ou d'un agent tensio-actif.