JPS62215396A - 酵素法によるｌ−含硫アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トリプトファンシンターゼの存在下にＬ−セ
リンを、金属硫化物、金属水硫化物、金属多硫化物、硫
化アンモニウム、水硫化アンモニウムまたは多硫化アン
モニウムと反応させ、Ｌ−システインおよび／またはＬ
−シスチンを製造する方法に関する。

し−システインおよび／またはし一シスチンは、輸液の
成分などの医薬用途のほか、化粧品用、食品添加剤など
として広く使用されている。

（従来の技術） 従来、Ｌ−システインおよびし一シスチンの代表的製法
としては、（１）毛髪などの天然物から抽出する方法、
（２）化学合成法（たとえば、特開昭５７−２００３５
６　）　、（３）ＯＬ−２−アミノチアゾリン−４−カ
ルボン酸から酵素的に合成する方法（特公昭５４−２２
７２）、（４）β−置換アラニンをシステインデスルフ
ヒドラーゼの存在下、金属硫化物または金属水硫化物と
反応させる方法（特公昭５７−２１３１１）などが知ら
れているが、工業的な製法としては必ずしも有利な方゛
法ではないい。

（発明が解決しようとする問題点） このような状況のもとで、本発明者らは、安価なＬ−シ
ステインおよび／またはＬ−シスチンの新しい製造法に
関して研究を重ねた結果、トリプトファンシンターゼの
存在下にＬ−セリンを、金属硫化物、金属水硫化物、金
属多硫化物、硫化アンモニウム、水硫化アンモニウムま
たは多硫化アンモニウムと反応させることにより、Ｌ−
システインおよび／またはＬ−シスチンが、生成するこ
とを見出した。

本発明者らは、この方法の改良を更に研究を重ねた結果
、反応液のｐＨを反応液に硫化水素を供給することによ
り一定に保ちながら反応することにより、Ｌ−システイ
ンおよび／またはＬ−シスチンの収量が著しく高まると
ともに、反応液への金属硫化物、金属水硫化物、金属多
硫化物、硫化アンモニウム、水硫化アンモニウムまたは
多硫化アンモニウムの添加量を減少させ得ることも見出
した。

本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

（問題を解決するための手段） トリプトファンシンターゼは、微生物、高等植物などに
広く存在していることが知られており（例えば、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｔｍｓ、Ｖｏｌ
、３９＋Ｎｏ、２＋ｐ、８７−１２０（１９７５）、本
発明においても酵素源は特に限定されないが、通常は微
生物起源のものが好適に用いられる。

トリプトファンシンターゼを生産する菌株としては、た
とえば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
９）、エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−２０）　、ノイロスポラ・クラッテ（Ｎｅｕｒ
ｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）ＡＴＣＣ−１４６９２−
、サツカロミセス９セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｒｅｖｉｓ−ｉａｅ）ＡＴＣＣ−２６７８７
などがある。

エシェリヒア・コリの培養菌体からのトリプトファンシ
ンターゼの抽出法については、　　ＴｈｅＪｏｕｒｎａ
ｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２４９゜Ｎｏ、２４．　ｐ、７７５
６−７７６３（１９７４年）、ノイロスポラ・クラ７す
の培養菌体からの抽出法については、同Ｖｏｌ　、２５
０．　Ｎｏ、８．　ｐ、２９４１−２９４６（１９７５
年）、サツカロミセス・セレビシェの培養菌体からの抽
出法については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋Ｖｏｌ。

１０２、　ｐ、　１５９−１６５　（１９７９年）に記
載され知られている。

しかし、本発明に使用されるトリプトファンシンターゼ
は、必ずしも抽出された純粋な物である必要はない。す
なわち、トリプトファンシンターゼ生産菌の培養物、培
養物から遠心分離などの方法によって採取した生菌体、
その乾燥菌体あるいは菌体を磨砕、自己消化、超音波処
理などをすることによって得られる菌体処理物、更には
、これらの菌体よりの抽出物並びに該抽出物より得られ
る酵素の粗製物であっても利用できる。もちろんこれら
の固定化物でもよい。

トリプトファンシンターゼ生産菌を培養するための培地
としては、炭酸源、窒素源、無機物および必要に応じて
少量の微量栄養素を含むものであれば、合成培地または
天然培地の何れも使用可能である。

培地へ微量のトリプトファンまたはインドールを添加す
ることが有効なこともある。また、培地へ微量のインド
ールアクリル酸を添加することによりトリプトファンシ
ンターゼ生産量が高まることもある。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は２０〜４０℃、通常は２５〜３
７℃の範囲である。培養液のｐＨは５〜８である。

トリプトファンシンターゼは、インドール−３−グリセ
ロ燐酸とＬ−セリンからし一トリプトファンを合成する
反応の他に種々の反応を触媒する多機能酵素であること
は良く知られている〔例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ａ
ｒｅａｓ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、
、Ｖｏｌ、４９．ｐ、１２７−１８５（１９７９））。

なお、トリプトファンシンターゼによりシスティンを生
成する反応は、本発明者らが初めて見出したものである
。

基質である硫化物、水硫化物などとしては、例えば硫化
ナトリウム、硫化カリウム、硫化リチウムなどの金属硫
化物、水硫化ナトリウム、水硫化カリウム、水硫化リチ
ウムなどの金属水硫化物、多硫化ナトリウム、多硫化カ
リウムなどの金属多硫化物、硫化アンモニウム、水硫化
アンモニウム、多硫化アンモニウムなどを用いることが
できる。

本発明においては、トリプトファンシンターゼの存在下
、通常ｐＨ６〜１０好ましくは７〜９の水性媒質中で、
Ｌ−セリンと硫化物、水硫化物または多硫化物と反応さ
せる。

反応温度は２０〜６０℃が適当である。反応時間は、酵
素力価、基質濃度、その他の条件により異なるが、回分
反応では通常１〜１００時間である。

反応は、静置またはゆるやかな攪拌下に行われる。

基質であるし一セリンと硫化物、水硫化物または多硫化
物の濃度は特に制限はないが、通常は０．１〜３０重量
％程度である。基質は反応開始時に全量を反応液に添加
しても良いし、反応の進行にともない分割添加すること
も可能である。

反応液中には硫化物、水硫化物または多硫化物がＬ−セ
リンに対して当モル以上存在することが望ましい。

反応に際しては、基質の他に補酵素であるビリドキサル
燐酸を微量添加することが望ましい。

反応の進行にともない反応液中には金属水酸化物（例え
ば、水硫化物として水硫化ナトリウムを使用した場合に
は水酸化ナトリウム）または水酸化アンモニウムが生成
し、反応液のｐＨが上昇するので、本発明では反応液に
硫化水素を供給して反応液のｐＨを一定に保つ。

反応液に供給した硫化水素は反応液中の金属水酸化物ま
たは水酸化アンモニウムと反応し、反応基質として利用
可能な硫化物または水硫化物となるので、反応開始時ま
たは進行にともない反応液に添加する硫化物、水硫化物
の量を減少することも可能である。

反応液のｐ）Ｉは、塩酸、硫酸などの鉱酸や酢酸などの
有機酸を添加することによっても一定に保ことは可能で
あるが、Ｌ−システインおよび／またはＬ−シスチンの
収量は硫化水素を使用した場合に比べ低くなるので適当
でなく本発明ではこのようにはしない。

Ｌ−システインは一５Ｈ基を有するため、その生成にと
もない反応液のｐＨを低下させる働きをするため、反応
の進行にともない反応液にアルカリを添加することが有
効なこともある。

また、酵素源としてトリプトファンシンターゼ生産能を
有する微生物の培養液または菌体を用いる場合には、反
応液にアルコール類、エステル類、ケトン類または界面
活性性化合物の１種以上を添加することにより、収率が
高まることがある。

このようにして反応を行うと、反応液中にはＬ−システ
インが生成するが、Ｌ−システインは酸化されてし一シ
スチンに変化しやすいので、反応の進行とともに反応液
中には通常、Ｌ−システインとＬ−シスチンが共存し、
徐々にＬ−シスチンの量が増大する。

しかしながら、反応条件を制御することによりＬ−シス
テインとＬ−シスチンの濃度比を変えることも可能であ
る。

反応液からＬ−システインまたはし一シスチンを採取す
るためには通常の方法を用いることができる。

例えば、反応終了後反応液に通気して大部分のＬ−シス
テインをＬ−シスチンに酸化すれば、Ｌ−シスチンは水
に難溶なので容易に単離できる。またこのようにして得
られたし一シスチンを電解還元すればＬ−システインを
得ることができる。

Ｌ−システインとＬ−シスチンの定量は、液体クロマト
グラフィーで行った。生成したシスティンとシスチンが
Ｌ一体であることは、光学異性体分離用カラムを用いた
液体クロマトグラフィーにより確認した。

（実施例） 以下、実施例と比較例により本発明を具体的に説明する
。

実施例１および比較例１ 肉エキス１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．１χ
、ＫＨｚＰＯ＊　０．２％、９１（７，０の液体培地に
エリシエリヒア・コリｈτ−１０２４２（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−２０＞を接種し、３０℃にて２０時間振盪培養した
。

培養終了後、遠心分離して菌体を集め、Ｏ，Ａｄａ−ｃ
ｈｉ　らの方法（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２
４９．ｐ、７７５６−７７６３　（１９７４年）に従っ
て精製操作を行い、比活性が９．２単位／ｍｇの力価の
トリプトファンシンターゼを取得し、この酵素を用いて
以下の反応を行った。

トリプトファンシンターゼの活性は、Ｃ，Ｙａｎｏｆ−
ｓｋｙらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　Ｖｏ１５＋ｐ、８０１−８０７（１９６２
））により測定し、ｐＨ７，８，３７℃において１μｍ
ｏｌ／ｍｉｎのトリプトファンをＬ−セリンとインドー
ルから合成する酵素量を１単位とした。

Ｌ−セリン４００ｍＭ、硫化ナトリウム１１０００１１
Ｉ、ピリドキサール燐酸０．１ｍＭを含むｐ）Ｉ　ｓ、
ｓの反応液１００ｍ１にトリプトファンシンターゼを２
５０単位添加し、３５℃で１０時間ゆるやかに攪拌した
。

反応中は、反応液に硫化水素を供給することにより反応
液のｐＨを８．５に維持した。

反応終了後の反応液中には、３．２５ｇのＬ−システイ
ンと０．６１ｇのし一シスチンが蓄積していた。

一方、硫化水素の代わりに６規定の塩酸により反応液の
ｐＨを８．５に維持したところ反応終了後の反応液中に
は、２．２３ｇのＬ−システインと０．５５ｇのし一シ
スチンが蓄積していた。

実施例２および比較例２ 肉エキス１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．１χ
、ＫＨｚＰＯ＊　０．２χ、ｐＨ７，０の液体培地にエ
シェリヒア・コリＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
１９）を接種し、３０℃にて２０時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離して菌体を集め、−２０℃にて凍
結保存したものをトプトファンシンターゼの酵素源とし
て用いた。

この湿菌体１ｇ当たりのトリプトファンシンターゼ活性
は、８９単位であった。

Ｌ−セリン２００ｍＭ、水硫化ナトリウム３００ｍＭ、
ピリドキサールリン酸０．１ｍＭ、湿菌体２ｇを含むｐ
Ｈ８，３の反応液１００ｍ１を、３５℃で１０時間ゆる
やかに攪拌した。

反応終了後の反応液中には、１．８５　ｇのＬ−システ
インと０．２２ｇのし一シスチンが蓄積していた。

一方、硫化水素の代わりに１規定の塩酸により反応液の
ｐＨを８．３に維持した方は反応終了後の反応液中には
、０．９ｇのＬ−システインと０．２８ｇのし一シスチ
ンが蓄積していた。

実施例３ 肉エキス１％、ペプトン０．５χ、酵母エキス０．１χ
、ＫＨｚＰＣｈ　Ｏ，２χ、ｐＨ７，０の液体培地にエ
シェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
２０）を接種し、３０℃にて２０時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離して菌体を集め、この湿菌体１ｇ
当たりのトリプトファンシンターゼ活性は、１２０単位
であった。

Ｌ−セリン２００　ｍＭ（２，１ｇ）　、水硫化ナトリ
ウム５００ｍＭ、ヒリドキサールリン酸０．１　ｍＭ　
、湿菌体５ｇ、酢酸ブチル０．３　ｇを含むｐＨ８，５
の反応液１００ｍ１を、３５℃で攪拌した。反応開始後
、２時間毎に２Ｍのし一セリン溶液（Ｎａｉｌ（により
ｐＨを９．５に調整）を５ｍｌずつ反応液に添加した。

反応中は、反応液に硫化水素を供給することにより反応
液のｐＨを８．５に維持した。

反応は１５時間継続し、この間に反応液には３５ｍ　１
（Ｌ−セリンとして７．３５ｇ）のし−セリン溶液を添
加した。

反応終了後の反応液中には、７．８ｇのＬ−システイン
と１．４ｇのし一シスチンが蓄積していた。

実施例４および比較例３ 実施例２において取得した菌体を用いて以下の反応を行
った。

Ｌ−セリン２００ｍＭ、後の表に示した硫化物、水硫化
物または多硫化物４００ｍＭ、ピリドキサールリン酸０
、Ｉｎ＋Ｍ　、湿菌体２ｇを含むｐＨ８，５の反応液１
００ｍ１を、３５℃で１０時間ゆるやかに攪拌した。

反応中は、反応液に硫化水素を供給することにより反応
液のｐＨを８．５に維持した。

反応終了後、反応液中のし一シスチンをジチオスレイト
ールによりＬ−システインに還元してからＬ−システイ
ンの生成量を液体クロマトグラフィーにより測定した。

結果は次の頁の表に示した。

一方、硫化水素の代わりに１規定の塩酸により反応液の
ｐＨを８．５に維持した場合の結果も表に併せて示した
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. トリプトファンシンターゼの存在下にＬ−セリンを、金
   属硫化物、金属水硫化物、金属多硫化物、硫化アンモニ
   ウム、水硫化アンモニウムまたは多硫化アンモニウムと
   反応させることによりＬ−システインおよび／またはＬ
   −シスチンを製造する方法において、反応液のｐＨを反
   応液に硫化水素を供給することにより一定に保ちながら
   反応させることを特徴とするＬ−システインおよび／ま
   たはＬ−シスチンの製造方法。