NL8600984A - Werkwijze voor de enzymatische bereiding van l-cysteine en/of l-cystine. - Google Patents

Description

’ 1 « Wï -1- 25508/Vk/mvl

Korte aanduiding: Werkwijze voor de enzymatische bereiding van L-cysteïne en/of L-cystine.

5 De uitvinding heeft betrekking op een w.erkwijze voor de enzymatische bereiding van L-cysteine en/of L-cystine.

L-cysteïne en L-cystine worden op grote schaal toegepast voor cosmetische toepassingen, in de voedingsmiddelenindustrie als toevoegstof voor voedingsmiddelen en voor andere toepassingen evenals voor 10 medisch gebruik, bijvoorbeeld als bestanddeel voor transfusies.

Er zijn diverse werkwijzen bekend voor de bereiding van L-cysteïne en L-cystine zoals 1) de extractie uit natuurlijke materialen zoals haar, 2) chemische synthese zoals bijvoorbeeld vermeld in de Japanse octrooiaanvrage SHO 57-200356, 3) een enzymatische synthese uit 15 DL-2-aminothiazoline-A-carbonzuur zoals vermeld in de Japanse octrooiaanvrage SHO 54-2272, en 4) een reactie van een 3-gesubstitueerd alanine met een metaalsulfide of hydrosulfide in aanwezigheid van cysteïnedesulf-hydrase zoals vermeld in de Japanse octrooiaanvrage SHO 57-21311. Deze werkwijzen zijn echter geen werkwijzen die met goed gevolg kunnen worden 20 toegepast als industriële procédé's.

In het kader van de gedane onderzoekingen zijn deze bekende werkwijzen bestudeerd en is een nieuwe werkwijze ontwikkeld voor de bereiding van L-cysteïne en/of L-cystine, welke werkwijze hierdoor wordt gekenmerkt, dat een β-gesubstitueerd L-alanine, weergegeven door 25 algemene formule

X-CHo-CHC00H 2 I

m2 waarbij X de betekenis heeft van een halogeenatoom of 30 een -OR- of -SR-groep waarbij R een waterstofatoom of een alkyl-, acetyl-, benzyl- of sufonzure groep is in reactie wordt gebracht met een metaalsulfide, een metaalhydrosulfide, een metaalpolysulfide, ammoniumsulfide, ammoniumhydrosulfide of een ammoniumpolysulfide in aanwezigheid van tryptofansynthase.

35 Van tryptofansynthase is bekend dat dit op grote schaal voorkomt in micro-organismen, hogere plantensoorten en andere materialen zoals bijvoorbeeld vermeld in Bacteriological Reviews, Band 39» nr. 2, biz. 87-120 (1975).

; · . * · 4 f\ , i -2- 25508/Vk/mvl

Volgens de uitvinding wordt tryptofansynthase afgeleid uit micro-organismen en gewoonlijk toegepast, maar de enzymbron is hiertoe niet beperkt. Stammen die tryptofansynthase produceren omvatten bijvoorbeeld Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coli 5 MT-.10242 (FERM BP-20), Neurospora crassa ATCC-14692 en Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787.

De extractie van tryptofansynthase uit gekweekte cellen is bekend zoals beschreven in The Journal of Biological Chemistry,

Band 249, nr. 24, biz. 7756-7763 (1974) voor E^ coli; ibid., Band 250, 10 nr. 8, biz. 2941-2946 (1975), voor Neurospora crassa en European Journal of Biochemistry, Band 102, biz. 159-165 (1979) voor Saccharomyces cerevisiae.

Tryptofansynthase toegepast volgens de uitvinding is niet noodzakelijkerwijs een geëxtraheerd en gezuiverd enzym. Kweken van een tryptofansynthase producerend micro-organisme, levende cellen, ver-15 zameld uit kweken door centrifugeren of een vergelijkbare methode, gedroogde cellen hiervan en fijngemaakt celmateriaal verkregen door malen, ultrasoon fijnmaken of andere behandelingen van de cellen of door auto-lyse hiervan kan worden toegepast als bron voor het enzymmateriaal volgens de uitvinding. Extracten van deze cellen en ruwe enzymen verkregen 20 uit de extracten kunnen ook worden toegepast. Verder kunnen geïmmobiliseerde cellen of enzymen natuurlijk worden gebruikt bij de werkwijze volgens de uitvinding. *

Elk synthetisch of natuurlijk medium kan worden gebruikt voor het kweken van tryptofansynthase producerende cellen mits dit 25 een koolstofbron, een stikstofbron, mineralen en eventueel een kleine hoeveelheid van de kleinere hoeveelheden aan voedingsstoffen bevat. De toevoeging van een kleine hoeveelheid tryptofan of indool aan het kweek-medium kan soms effectief zijn. Ook kan de hoeveelheid geproduceerd tryptofansynthase soms worden vergroot door de toevoeging van een kleine hoe-30 veelheid indoolacrylzuur aan het medium.

Het kweken wordt aëroob uitgevoerd door de kweek ónder roeren te schudden of te beluchten. De temperatuur is in het gebied van 20 tot 40 °C gewoonlijk van 25 tot 37 °C. De pH van het kweekmedium bedraagt 5 tot 8.

35 Het is algemeen bekend dat tryptofansynthase een multifunktioneel enzym is waarbij het enzym niet alleen de synthese katalyseert van L-tryptofan uit indool-3-glycerolfosforzuur en L-serine maar - . V” h -3- 25508/Vk/mvl /, \ ook veel andere reacties waarbij bijvoorbeeld wordt verwezen naar Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, Band 49, biz. 127-185 (1979).

De uitvinders hebben in het kader van het gedane onder-5 zoek echter voor het eerst gevonden dat de reactie volgens de uitvinding kan worden gekatalyseerd door tryptofansynthase.

β-Gesubstitueerde L-alanines, een van de substraten voor de reactie, die kunnen worden toegepast volgens de uitvinding omvatten bijvoorbeeld β-halogeen-L-alanine zoals β-chloor-L-alanine en β-broom-10 L-alanine; O-alkyl-L-serines zoals O-methyl-L-serine en O-ethyl-L-serine; S-alkyl-L-cysteïnes zoals S-methyl-L-cysteïne en S-ethyl-L-cysteïnej O-acetyl-L-serine; O-benzyl-L-serine; S-benzyl-L-cysteïne; L-serine-O-sulfaat; L-serine en dergelijke.

Sulfiden, hydrosulfiden of polysulfiden, hetgeen de 15 andere substraten zijn die kunnen worden toegepast volgens de uitvinding omvatten bijvoorbeeld metaalsulfiden zoals natriumsulfide, kaliumsulfide en lithiumsulfide, metaalhydrosulfiden zoals natriumhydrosulfide, kalium-hydrosulfide en lithiumhydrosulfide; metaalpolysulfiden zoals natrium-polysulfiden en kaliumpolysulfiden; ammoniumsulfide; ammoniumhydrosulfide; 20 ammoniumpolysulfiden en dergelijke.

Volgens de uitvinding, worden het β-gesubstitueerde L-alanine en het sulfide, hydrosulfide of polysulfide gewoonlijk in reactie gebracht in een waterig medium bij een pH van 6 tot 10 in aanwezigheid van tryptofansynthase. De reactietemperatuur wordt gewoonlijk 25 gekozen in het gebied van 20 tot 60 °C. De reactieduur is in het algemeen 1 tot 10Q uren voor een batchgewijze reactie, hoewel dit kan variëren in afhankelijkheid van de zuiverheid van het enzym, de concentraties van de toegepaste substraten en de andere omstandigheden. De reactie wordt stationair uitgevoerd of onder langzaam roeren.

30 De concentraties van de substraten, het β-gesubstitu- eerde L-alanine en het sulfide, hydrosulfide of polysulfide zijn niet op een bepaalde wijze beperkt, maar gewoonlijk liggen deze in het gebied van ongeveer 0,1 tot 30 gew.%. De substraten kunnen als geheel in een keer worden toegevoegd wanneer de reactie wordt gestart of anderzijds 35 kunnen ze gedeeltelijk worden toegevoegd bij het voortduren van de reactie.

Het is gewenst dat het sulfide, hydrosulfide of polysulfide aanwezig is in het reactiemedium bij een equimolaire hoeveelheid of meer, gebaseerd op -—v -v * -4- 25508/Vk/mvl nr »r ψ- ~ het β-gesubstitueerde L-alanine. Bij de reactie is het gewenst een kleine hoeveelheid van een co-enzym, pyridoxaalfosfaat toe te voegen naast de substraten.

Wanneer cellen of kweekmedia van een micro-organisme 5 in staat tot de'bereiding van tryptofansynthase worden toegepast als bron voor het enzym, kan de opbrengst worden vergroot door toevoeging van ten minste een verbinding gekozen uit alcoholen, esters, ketonen en oppervlakte-actieve stoffen aan het reactiemedium. De alcoholen die kunnen worden toegepast bevatten ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 10 2-butanol, isobutylalcohol, tert.butylalcohol, 1-pentanol, 1-octanol en dergelijke. De esters die kunnen worden toegepast omvatten ethylformiaat, propylformiaat, butylformiaat, ethylacetaat, propylacetaat, butylacetaat, isobutylacetaat en dergelijke. De ketonen die kunnen worden toegepast omvatten aceton, methylethylketon, methylisobutylketon en dergelijke. De 15 oppervlakte-actieve stoffen die kunnen worden toegepast omvatten anionische oppervlakte-actieve stoffen zoals natriumdodecylsulfaat en natriumdeoxycholaat, niet-ionisch oppervlakte-actieve stoffen zoals octylfenylethers en andere oppervlakte-actieve stoffen. De hoeveelheden van deze verbindingen die worden toegevoegd aan het reactiemedium variëren 20 gewoonlijk in het trajekt van 0,01 tot 5 gew.%, hoewel deze hoeveelheid kan variëren in afhankelijkheid van het type van de toegepaste verbindingen of de toegepaste stam.

Wanneer de reactie op deze wijze wordt uitgevoerd zal het reactiemedium in het algemeen een mengsel bevatten van L-cysteïne 25 en L-cystine omdat L-cysteïne, dat daarbij wordt bereid, makkelijk wordt geoxideerd en wordt omgezet tot L-cystine. De hoeveelheid L-cystine neemt geleidelijk aan toe wanneer de reactie voortduurt. De verhouding van de concentratie van L-cysteïne tot die van L-cystine kan worden gevarieerd door het regelen van de reactie-omstandigheden.

30 L-cysteïne of L-cystine kan worden gewonnen uit het reactiemedium volgens een op zich bekende wijze. Zo kan bijvoorbeeld L-cystine dat moeilijk oplosbaar is in water makkelijk worden afgescheiden door het reactiemengsel te beluchten waarbij het grootste deel van L-cysteine wordt omgezet tot L-cystine na het beëindigen van de reactie.

35 L-cysteïne kan worden verkregen door het aldus verkregen L-cystine te onderwerpen aan elektrolytische reductie.

Een kwantitatieve meting van L-cysteïne en L-cystine Λ *· r / . -5- 25508/Vk/mvl werd uitgevoerd door vloeistofchromatografie. Vloeistofchromatografie waarbij een kolom werd gebruikt voor het scheiden van de optische isomeren toonde verder aan dat zowel cysteine als cystine, dat op deze wijze werd bereid, de L-configuratie had.

5 De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld I

Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) werd geënt in een vloeibaar medium van 1% vleesextract, 0,5% pepton, 0,1% gistextract, 10 0,2% KHgPO^, bij een pH van 7,0 en gekweekt onder schudden gedurende 20 uren bij 30 °C. Na de kweek werden de cellen verzameld door centrifugeren en het enzym werd gezuiverd volgens de methode van 0. Adachi et al,, The Journal of Biological Chemistry, Band 249, nr. 24, biz. 7756-7763 (1974). Het aldus verkregen enzym, tryptofansynthase, met een specifieke 15 activiteit-(titer) van 9,2 eenheden per mg werd gebruikt bij de volgende ______________—reactie. De enzymactiviteit werd bepaald volgens de methode van C. Yanofsky et al., Methods in Enzymology, Band 15, blz. 801-807 (1962). Een eenheid wordt weergegeven door de hoeveelheid enzym die 1 pmol/minuut tryptofan bereidt uit L-serine en indool bij 37 °C en een pH van 7,8.

20 Tryptofansynthase werd in een hoeveelheid van 0,5 mg toegevoegd aan 10 ml reactiemedium bij een pH van 8,5 dat 50 mmol L-serine bevatte, 100 mmol sulfide, hydrosulfide of polysulfide zoals aangegeven in tabel A en 0,1 mmol pyridoxaalfosfaat en langzaam geschud bij 35 °C gedurende 10 uren. De concentraties van L-oysteïne en L-cystine 25 die daarbij zijn verkregen en de opbrengsten van het totaal zijn gebaseerd op L-serine zoals weergegeven in tabel A.

TABEL A

. . L-cysteïne L-cystine opbrengst soort sulfiden (Lol) (Lol) (mol*) 30---- natriumsulfide 18 6,5 62 natriumhydrosulfide 16 5 52 kaliumsulfide 11 3,5 36 ammoniumsulfide 8 1,5 22 35 ammoniumhydrosulfide 6 2 20 ammoniumtrisulfide 6 1,5 18 natriumdisulfide 11 3 34 V» * -6- 25508/Vk/mvl

Voorbeeld II

Volgens de methode van W.H. Matchett et al., The Journal of Biological Chemistry, Band 250, nr. 8, biz. 2941-2946 (1975) werd Neurospora crassa ATCC-14692 gekweekt en het enzym werd gezuiverd.

5 Het aldus verkregen enzym tryptofansynthase had een specifieke activiteit van 1,3 eenheid per mg.

De enzymvloeistof werd gebruikt bij de volgende reactie. Een reactiemedium (pH : 8,5, 10 ml) met 50 mmol L-serine, 100 mmol natriumhydrosulfide, 0,1 mmol pyridoxaalfosfaat en 1,3 eenheid trypto-10 fansynthase werd langzaam geschud bij 35 °C gedurende 10 uren. In het reactiemedium werd 12 mmol L-cysteïne en 4 mmol L-cystine bereid.

Voorbeeld III

Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787 werd geënt in een vloeibaar medium van 1% pepton, 0,5% gistextract, 2% glucose en 0,01% 15 indoolacrylzuur bij een pH van 6,0 en geschud onder roeren bij 30 °C gedurende 20 uren. Daarna werden de gekweekte cellen verzameld door centrifugeren. Het enzym werd gezuiverd volgens de methode van M. Dettwiler et al., European Journal of Biochemistry, Band 102, blz. 159-165 (1979). Zodoende werd tryptofansynthase verkregen met een specifieke activiteit 20 van 1,2 eenheid per mg.

De enzymvloeistof werd gebruikt om de volgende reactie te bewerkstelligen. Een reactievloeistof (10 ml) die 50 mmol L-serine, 100 mmol natriumhydrosulfide, 0,1 mmol pyridoxaalfosfaat en 1,2 eenheid tryptofansynthase bevatte bij een pH van 8,5 werd zacht geschud bij 35 °C 25 gedurende 10 uren. De verkregen reactievloeistof bevatte 11 mmol L-cysteïne en 3 mmol L-cystine.

Voorbeeld IV

Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) werd geënt in een vloeibaar medium met een pH van 7,0 die 1% vleesextract, 0,5% pepton, 30 0,1% gistextract en 0,2% ΚΗ-,ΡΟ^ bevatte en werd gedurende 20 uren geschud bij 30 °C. Na het kweken werden de cellen verzameld door centrifugeren en toegepast als enzymbron voor het tryptofansynthase. De natte cellen hadden een specifieke activiteit van 120 eenheden per g.

Een reactiemedium (100 ml) dat 200 mmol L-serine, 35 300 mmol natriumsulfide, 0,1 mmol pyridoxaalfosfaat en 5 g natte cellen bevatte en ingesteld op een pH van 8,5 met HC1 werd gedurende 24 uren geschud bij 35 °C. Nadat de reactie was beëindigd werd de hoeveelheid -7- 25508/Vk/mvl

S 4, V

L-cystine aanwezig in het reactiemengsel gereduceerd tot L-cysteïne door dithiothreïtol. De hoeveelheid bereid L-cysteïne was 98 mmol.

Voorbeeld V

Tryptofansynthase verkregen in voorbeeld I werd ge-5 bruikt bij de volgende reactie.

Het tryptofansynthase (500 eenheden) werd toegevoegd aan 100 ml van een reactievloeistof die 300 mmol β-gesubstitueerd L-alanine bevatte vermeld in tabel B, 600 mmol natriumhydrosulfide, 1 mmol pyridoxaalfosfaat en 480 mmol tris-aminomethaan-HCl-buffer bij een pH 10 van 8,5 en langzaam geschud bij 35 °C gedurende 1 uur. Nadat de reactie was beëindigd werd L-cystine aanwezig in de reactievloeistof gereduceerd tot L-cysteïne met dithiothreïtol en daarna werd de hoeveelheid L-cysteïne bepaald. De resultaten zijn weergegeven in tabel B.

TABEL B

15 ---j ^-gesubstitueerd L-alanine L-cysteïne (mmol) β-chloor-L-alanine 82 0-methyl-L-serine 116 O-acetyl-L-serine 95 20 O-benzyl-L-serine 24 S-methyl-L-cysteïne 27 S-ethyl-L-cysteïne 18 S-benzyl-L-cysteïne 5 L-serine-O-sulfaat 37 25 L-serine 123

Voorbeeld VI

Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19) werd geënt in een vloeibaar medium bij een pH van 7,0 dat 1% vleesextract, 0,5% pepton, 30 0,1% gistextract en 0,2% bevatte en geschud om het te kweken bij 30 °C gedurende 20 uren. Na het kweken werden de cellen verzameld door centrifugeren en gevriesdroogd bij -20 °C om ze op te slaan als enzym-bron voor tryptofansynthase. De natte cellen hadden een tryptofansynthase-activiteit van 89 eenheden per g. De opgeslagen cellen werden gebruikt 35 bij de volgende reactie.

Een reactiemedium (100 ml) dat 200 mmol L-serine, 300 mmol natriumsulfide, 0,1 mmol pyridoxaalfosfaat, 100 mmol trisamino- -8- 25508/Vk/mvl

r .. -V

methaan-HCl-buffer (pH = 8,5) en 5 g natte cellen bevatte werd langzaam geschud bij 35 °C gedurende 10 uren. Nadat de reactie was beëindigd werd L-cystine aanwezig in het reactiemengsel gereduceerd tot L-cysteïne door dithiothreitol en de hoeveelheid L-cysteïne die daarbij werd bereid, werd 5 vervolgens gemeten. De hoeveelheid bedroeg 114 mmol.

Voorbeeld VII

De natte cellen verkregen in voorbeeld VI werden gebruikt bij de volgende reactie.

Een reactievloeistof (100 ml) met een pH van 8,0, die 10 200 mmol (2,1 g) L-serine, 1000 mmol natriumhydrosulfide, 0,1 mmol pyri- dixaalfosfaat en 5 g natte cellen bevatte, werd samen geroerd bij 35 °C gedurende 10 uren. L-serine werd verder toegevoegd op een tijdstip van 2 uren en 5 uren nadat de reactie was begonnen, elk in een hoeveelheid van 2,1 g. Tijdens de reactie werd de pH van de reactievloeistof gehouden 15 op 8,0 door toevoeging van 6 N fosforzuur. Toen de reactie was beëindigd werd 4,3 g L-cysteïne en 1,1 g L-cystine verzameld in de reactievloeistof.

Voorbeeld VIII

De natte cellen verkregen in voorbeeld IV werden direkt 20 gebruikt als enzymbron van tryptofansynthase bij de volgende reactie.

Een reactiemedium (100 ml) bij een pH van 8,5, dat 200 mmol L-serine, 300 mmol natriumsulfide, 1 mmol pyridoxaalfosfaat, 5 g natte cellen en een verbinding bevatte aangegeven in tabel C, werd zacht geschud bij 35 °G gedurende 5 uren. De pH van het medium werd ge-25 regeld op 8,5 0,3 tijdens de reactie. Nadat de reactie was beëindigd werd L-cystine aanwezig in het reactiemedium gereduceerd tot L-cysteïne door dithiothreitol en de hoeveelheid L-cysteïne die daarbij werd verkregen, werd gemeten. De resultaten zijn vermeld in tabel C.

' P

· · > "'· -9- 25508/Vk/mvl

TABEL C

toegevoegde verbinding concentratie (g/1) hoeveelheid _ '_ L-cysteine (mmol) blanco 0 67,2 5 ethanol 10 99>6' 1- propanol 10 119,4 2- propanol 10 105,6 1- butanol 10 140,0 2- butanol 10 128,7 10 isobutylalcohol 5 114,8 tert.butylalcohol 5 107,2 1-pentanol 5 106,5 1-octanol 10 128,7 ethylformiaat 5 96,7 15 propylformiaat 5 99,8 butylformiaat 5 104,3 methylacetaat 5 98,4 ethylacetaat 5 108,9 butylacetaat 5 162,5 20 isobutylacetaat 5 129,1 aceton 5 96,5 methylethylketon 5 111,8 methylisobutylketon 5 167,0 natriumdeoxycholaat 1 139,4 25 natriuradodecylsulfaat 1 160,9

Triton X-100 1 160,7 - — ·

Claims (2)

0*' %e vv. -¾ -10- 25508/Vk/ravl

1. Werkwijze voor de bereiding van L-cystelne en/of L-cystine, met het kenmerk, dat een β-gesubstitueerd L-alaine weergegeven 5 door algemene formule X-CH.-CHC00H 2 I NH2 waarbij X de betekenis heeft van een halogeenatoom of 10 een -OR- of -SR-groep, waarbij R een waterstofatoom of een alkyl-, acetyl-, benzyl- of sulfonzure groep is in reactie wordt gebracht met een metaalsulfide, een metaalhydrosulfide, een metaalpolysulfide, ammonium-sulfide, ammoniumhydrosulfide of een ammoniumpolysulfide in aanwezigheid van tryptofansynthase.

2. Werkwijze voor de bereiding van L-cysteïne en/of L-cystine volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de reactie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van ten minste een stof in een hoeveelheid van 0,01 tot 5 gew.% gekozen uit de groep bestaande uit alcoholen, esters, ketonenen oppervlakte-actieve stoffen. Eindhoven, april 1986 . 'N * i Ui · f i...i Af ·. ·«/ J