DE3613388A1 - Enzymatisches verfahren zur herstellung von schwefelhaltigen l-aminosaeuren - Google Patents
Enzymatisches verfahren zur herstellung von schwefelhaltigen l-aminosaeurenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und/oder L-Cystin durch umsetzen eines ß-substituierten
L-Alanins mit einem Metallsulfid, einem Metallhydrosulfid,
einem Metallpolysulfid, Ammoniumsulfid, Ammoniumhydrosulfid
oder einem Ammoniumpolysulfid in Gegenwart von Tryptophansynthase.
f L-Cystein und L-Cystin werden viel für kosmetische Anwendungen,
in der Nahrungsmittelindustrie als Zusatz und für andere Anwendungen, wie medizinische Anwendungen, zum Beispiel als
Bestandteil bei Transfusionen, eingesetzt.
Es sind verschiedene Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und L-Cystin bekannt:
(1) Die Gewinnung aus Naturprodukten, wie Haar,
(2) Chemische Synthesen, wie sie zum Beispiel in der JP-OS SHO 57-200356 beschrieben sind,
(3) Durch enzymatische 'Synthese aus DL-2-Aminothiazolin-4-carbonsäure,
wie in der JP-PS SHO 54-2272 beschrieben und
(4) Durch Umsetzung eines ß-substituierten Alanins mit einem Metallsulfid oder -hydrosulfid in Gegenwart von Cystein-Desulfhydrase,
wie in der JP-PS SHO 57-21311 beschrieben.
Diese bekannten Verfahren sind jedoch für eine industrielle Anwendung nicht notwendigerweise vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß L-Cystein und/oder L-Cystin zu geringen Kosten mit einem
neuen Verfahren hergestellt werden können, das auf einer Umsetzung eines ß-substituierten L-Alanins mit einem Metallsulfid,
einem Metallhydrosulfid, einem Metallpolysulfid,
Ammoniumsulfid, Ammoniumhydrosulfid oder einem Ammoniumpolysulfid in Gegenwart von Tryptophansynthase beruht.
Es ist bekannt, daß Tryptophansynthase in vielen Mikroorganismen, höheren Pflanzen und anderen vorhanden ist (siehe z.B.
"Bacteriological Reviews", Band 39, Nummer 2, Seiten 87-120 von 1975).
Die in der vorliegenden Erfindung benutzte Tryptophansynthase ist üblicherweise aus Mikroorganismen gewonnen, doch ist
man auf diese Enzymquelle nicht beschränkt. Stämme, die Tryptophansynthase erzeugen, schließen beispielsweise ein:
Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19), Escherichia coIi
MT-10242 (FERM BP-20), Neurospora crassa ATCC-14692 und
Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787.
Verfahren zum Gewinnen von Tryptophansynthase aus gezüchteten
Zellen sind bekannt und in "The Journal of Biological Chemistry", Band 249, Nummer 24, Seiten 7756-7763 (1974) für
E. coli; im gleichen Journal Band 250, Nummer 8, Seiten 2941-2946 (1975) für Neurospora crassa und im "European Journal
of Biochemistry", Band 102, Seiten 159-165 (1979) für Sacharomyces cerevisiae beschrieben.
_ 5 —
Die in der vorliegenden Erfindung benutzte Tryptophansynthase ist nicht notwendigerweise ein extrahiertes und gereinigtes
Enzym. In der vorliegenden Erfindung können als Enzymquelle Kulturen eines Tryptophansynthase erzeugenden Mikroorganismus,
durch Zentrifugieren oder ein ähnliches Verfahren aus den Kulturen gewonnene lebende Zellen, daraus erhaltene getrocknete
Zellen sowie daraus erhaltene Zelltrümmer benutzt werden, die durch Zerreiben, Ultraschall- oder andere Behandlung
oder durch Autolyse der Zellen erhalten wurden. Extrakte dieser Zellen und aus den Extrakten erhaltene Rohenzyme können
ebenfalls benutzt werden. Schließlich können auch immobilisierte Zellen oder Enzyme bei der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden.
Zum Züchten von Tryptophansynthase produzierenden Zellen kann jedes synthetische oder natürliche Medium benutzt werden,
vorausgesetzt es enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle,
Mineralien und gegebenenfalls eine geringe Menge untergeordneter Nährstoffe. Die Zugabe einer geringen Menge
von Tryptophan oder Indol zum Kulturmedium kann manchmal wirksam
sein. Die produzierte Menge an Tryptophansynthase kann man manchmal dadurch erhöhen, daß man eine geringe Menge Indolacrylsäure
zum Medium hinzugibt. Das Züchten erfolgt aerob durch Schütteln oder durch Bewegen der Kultur mittels Belüftung.
Die Temperatur liegt im Bereich von 20-400C,, gewöhnlich zwischen
25 und 370C. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt im
Bereich von 5 bis 8.
Es ist bekannt, daß Tryptophansythase ein multifunktionelles
Enzym ist, daß heißt, das Enzym katalysiert nicht nur die Synthese von L-Tryptophan aus Indol-3-glycerinphosphorsäure
und L-Serin, sondern auch viele andere Umsetzungen (vgl. z.B. "Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular
Biology", Band 49, Seiten 127-185 (1979).
Es wurde jedoch in der vorliegenden Erfindung zum ersten Male erkannt, daß auch die erfindungsgemäße Umsetzung durch
Tryptophansynthase katalysiert werden kann.
ß-substituierte L-Alanine, eines der Ausgangsprodukte für
die Umsetzung, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, schließen zum Beispiel ein: ß-Halogen-L-alanin,
wie ß-Chlor-L-alanin und ß-Brom-L-alanin; O-Alkyl-L-serine,
wie O-Methyl-L-serin und O-Ethyl-L-serin; S-Alkyl-L-cysteine,
wie S-Methyl-L-cystein und S-Ethyl-L-cystein; O-Acetyl-L-serin; O-Benzyl-L-serin; S-Benzyl-L-cystein;
L-Serin-O-sulfat; L-Serin und ähnliche.
Sulfide, Hydrosulfide oder Polysulfide, das andere Ausgangsprodukt,
die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, schließen zum Beispiel die folgenden ein: Metallsulfide,
wie Natriumsulfid, Kaliumsulfid und Lithiumsulfid; Metallhydrosulfide, wie Natriumhydrosulfid, Kaliumhydrosulfid
und Lithiumhydrosulfid; Metallpolysulfide, wie Natriumpolysulfide
und Kaliumpolysulfide; Ammoniumsulfid; Ammoniumhydrosulfid;
Ammoniumpolysulfide und ähnliche.
Gemäß der Erfindung werden das ß-substltuierte L-Alanin und
das Sulfid, Hydrosulfid oder Polysulfid üblicherweise in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 10 in Gegenwart
von Tryptophansynthase umgesetzt. Die Reaktionstemperatur wird geeigneterweise im Bereich von 20 bis 600C gehalten.
Die Reaktionszeit beträgt allgemein 1 bis 100 Stunden für eine ansatzweise Durchführung der Reaktion, obwohl sie in
Abhängigkeit vom Titer des Enzyms, den Konzentrationen der Ausgangsprodukte und anderen Bedingungen variieren kann.
Die Umsetzung wird stationär oder unter langsamem Rühren ausgeführt.
Die Konzentrationen der Ausgangsstoffe, des ß-substituierten
L-Alanins und des Sulfids, Hydrosulfids oder Polysulfide,
sind nicht besonders begrenzt, liegen jedoch üblicherweise im Bereich von etwa 0,1 bis 30 Gew.%. Die Ausgangsstoffe
können zu Beginn auf einmal hinzugegeben werden oder man kann sie portionsweise hinzufügen, während die Umsetzung
fortschreitet. Es ist erwünscht, daß, bezogen auf das ß-substituierte L-Alanin, das Sulfid, Hydrosulfid oder Polysulfid
in der Reaktionsmischung in einer äquimolaren Menge oder mehr vorhanden ist. Bei der Umsetzung ist es erwünscht, eine
geringe Menge eines Coenzyme, Pyridoxalphosphat, zu den Ausgangsstoffen
hinzuzugeben.
Werden Zellen oder Kulturmedien eines Mikroorganismus, der Tryptophansynthase erzeugen kann, als Enzymquelle benutzt,
— ft —
dann kann die Ausbeute dadurch erhöht werden, daß man zumindest eine der Verbindungen,ausgewählt aus Alkoholen, Estern,
Ketonen und oberflächenaktiven Mitteln zu der Reaktionsmischung hinzugibt. Die Alkohole, die benutzt werden können, schließen
folgende ein: Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol,
2-Butanol, Isobutylalkohol, Tertiärbutylalkohol, 1-Pentanol,
1-Octanol und ähnliche. Die Ester, die benutzt werden können,
schließen folgende ein: Ethylformiat, Propylformiat, Butylformiat,
Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat und ähnliche. Die Ketone, die benutzt werden können,
schließen die folgenden ein: Aceton, Methylethylketon, Methylisobutylketon und ähnliche. Die oberflächenaktiven Mittel,
die benutzt werden können, schließen die folgenden ein: Anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumdodecylsulfat
und Natriumdeoxycholat, nichtionische oberflächenaktive Mittel,
wie Octylphenylether, und andere oberflächenaktive Mittel.
Die Menge dieser Verbindungen, die zu der Reaktionmischung hinzugegeben wird, liegt üblicherweise im Bereich von 0,01
bis 5 Gew.%, obwohl die Menge in Abhängigkeit von den benutzten Verbindungen oder dem eingesetzten Stamm variieren kann.
Wird die Umsetzung so ausgeführt, dann enthält die Reaktionmischung
im allgemeinen eine Mischung von L-Cystein und L-Cystin, da das L-Cystein leicht oxidiert und in L-Cystin
umgewandelt wird. Die Menge an L-Cystin nimmt mit fortschreitender Umsetzung graduell zu. Das Verhältnis der Konzentration
von L-Cystein zu der von L-Cystin kann durch Steuern
der Reaktionsbedingungen variiert werden.
L-Cystein oder L-Cystin kann in irgendeiner üblichen Weise aus dem Reaktionsmedium gewonnen werden. So kann man zum
Beispiel L-Cystin, das schwierig in Wasser löslich ist, leicht dadurch isolieren, daß man die Reaktionsmischung belüftet,
um einen Hauptanteil des L-Cysteins zu L-Cystin zu oxidieren, nachdem die Umsetzung beendet ist. L-Cystein kann man erhalten,
indem man das so erhaltene L-Cystin einer elektrolytischen Reduktion unterwirft.
Die quantitative Bestimmung von L-Cystein und L-Cystin erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie. Eine Flüssigkeitschromatographie
unter Verwendung einer Säule zum Trennen der optischen Isomeren zeigte, daß sowohl Cystein als auch Cystin
in der L-Konfiguration erhalten waren.
Die erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert.
Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) wurde in ein flüssiges
Medium von einem Prozent Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH-PO., pH 7,0, geimpft und unter Schütteln
20 Stunden bei 30CC gezüchtet. Danach wurden die Zellen
durch Zentrifugieren gesammelt und das Enzym nach dem Verfahren
von 0. Adachi et al. "The Journal of Biological Chemistry", Band 249, Nummer 24, Seiten 7756-7763 (1974) gereinigt. Das
erhaltene Enzym Tryptophansynthase mit einer spezifischen Aktivität (Titer) von 9,2 Einheiten/mg wurde in der folgenden
Umsetzung verwendet. Die Enzymaktivität wurde nach dem Verfahren von C. Yanofsky et al., "Methods in Enzymology", Band
15, Seiten 801-807 (1962) bestimmt. Eine Einheit ist durch die Menge des Enzyms repräsentiert, die ein Mikromol/min
Tryptophan aus L-Serin und Indol bei 370C,* pH 7,8; erzeugt.
0,5 mg Tryptophansynthase wurden zu 10 ml eines Reaktionsmediums; pH 8,5; hinzugegeben, das 50 mM L-Serin, 100 mM
eines Sulfids, Hydrosulfids oder Polysulfids, wie in Tabelle
1 angegeben, und 0,1 mM Pyridoxalphosphat enthielt, und dann schüttelte man das Reaktionsmedium langsam 10 Stunden bei
35°C. Die Konzentrationen des erhaltenen L-Cysteins und L-Cystins und die Gesamtausbeuten, bezogen auf L-Serin, sind
in Tabelle 1 angegeben.
| Tabelle 1 | L-Cystin (mM) |
Ausbeute (Mol-%) |
|
| Art des Sulfids etc. | L-Cystein (mM) |
6.5 | 62 |
| Natriumsulfid | 18 | 5 | 52 |
| Natriumhydrosulfid | 16 | 3.5 | 36 |
| Kaliumsulfid | 11 | 1.5 | 22 |
| Ammoniumsulfid | 8 | 2 | 20 |
| Ammoniumhydrosulfid | 6 | 1.5 | 18 |
| Ammoniumtrisulfid | 6 | 3 | 34 |
| Natriumdisulfid | 11 | ||
Nach dem Verfahren von W.H. Matchett et al., "The Journal
of Biological Chemistry", Band 250, Nummer 8, Seiten 2941-2946 (1975), wurde Neurospora crassa ATCC-14962 gezüchtet
und das Enzym gereinigt. Das so erhaltene Enzym Tryptophansynthase hatte eine spezifische Aktivität von 1,3 Einheiten/mg.
Die Enzymflüssigkeit wurde in der folgenden Unseztung benutzt:
Ein Reaktionsmedium (pH 8,5,· 10ml), das 50 mM L-Serin, 100 mM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 1,3 Einheiten
Tryptophansynthase enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht geschüttelt. In dem Reaktionsmedium wurden 12 mM
L-Cystein und 4 mM L-Cystin gebildet.
Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787 wurde in ein flüssiges
Medium aus 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 2% Glucose und 0,01% Indolacrylsäure,- pH 6,0; geimpft und unter Schütteln 20 Stunden
bei 3O0C gezüchtet. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren
gesammelt. Das Enzym wurde nach dem Verfahren von M. Dettwiler et al., "European Journal of Biochemistry",
Band 102, Seiten 159-165 (1979) gereinigt. Es wurde Tryptophansynthase mit einer spezifischen Aktivität von 1,2 Einheiten/mg
erhalten.
Die Enzymflüssigkeit wurde benutzt, um die folgende Umsetzung
zu bewirken: Eine Reaktionsflüssigkeit (10ml) , die 50 mM L-Serin, 100 inM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat
und 1,2 Einheiten Tryptophansynthase; pH 8,5; enthielt, wurde 10 Stunden bei 350C leicht geschüttelt. Die erhaltene Reaktionsflüssigkeit
enthielt 11 mM L-Cystein und 3 mM L-Cystin.
Escherichia coli MT-10242 (FERM BP-20) wurde in ein flüssiges
Medium vom pH 7,0 geimpft, das 1% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH2PO4 enthielt, und dann schüttelte
man 20 Stunden bei 3O0C. Die Zellen wurden danach durch Zentrifugieren
gesammelt und als Enzymquelle von Tryptophansynthase benutzt. Die Naßzellen hatten eine spezifische Aktivität
von 12Q Einheiten/g.
Ein Reaktionsmedium (100ml), das 200 mM L-Serin, 300 mM Natriumsulfid,
0,1 mM Pyridoxalphosphat und 5g der nassen Zellen enthielt und mit HCl auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt
worden war, schüttelte man 24 Stunden bei 350C. Nach Abschluß
der Umsetzung wurde das in dem Reaktionsmedium vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert. Die Menge
des erzeugten L-Cysteins betrug 98 mM.
Nach Beispiel 1 erhaltene Tryptophansynthase wurde in der
folgenden Umsetzung benutzt:
Die Tryptophansynthase (500 Einheiten) wurde zu 100 ml einer Reaktionsflüssigkeit hinzugegeben, die 300 inM eines ß-substituierten
L-Alanins, wie in der Tabelle 2 angegeben, 600 mM
Natriumhydrosulfid, ImM Pyridoxalphosphat und 480 mM Trisaminomethan-HCl-Puffer;
pH 8,5; enthielt und 1 Stunde bei 35°C leicht geschüttelt. Nach Abschluß der Umsetzung wurde
das in der Reaktionsflüssigkeit vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert und die Menge des L-Cysteins
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
ß-substituiertes L-Alanin L-Cystein (mM)
ß-Chlor-L-alanin 82
O-Methyl-L-serin 116
O-Acetyl-L-serin 95
O-Benzyl-L-serin 24
S-Methyl-L-cystein 27
S-Ethyl-L-cystein 18
S-Benzyl-L-cystein 5
L-Serin-O-sulfat 37
L-Serin 123
Escherichia coli MT-10232 (FERM BP-19) wurde in ein flüssiges
Medium vom pH-Wert 7,0 geimpft, das 1% Fleischextrakt, 0,5%
Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH2PO4 enthielt und zum
Züchten wurde 20 Stunden bei 300C geschüttelt. Danach sammelte
man die Zellen durch Zentrifugieren und fror sie bei -200C
ein, um sie als Enzymquelle von Tryptophansynthase zu lagern. Die nassen Zellen hatten eine Tryptophansynthase-Aktivität
von 89 Einheiten/g. Die gelagerten Zellen wurden in der folgenden Umsetzung eingesetzt:
Ein Reaktionsmedium (100ml), das 200 inM L-Serin, 300 mM Natriumsulfid,
0,1 mM Pyridoxalphosphat, 100 mM Trisaminomethan-HCl-Puffer
(pH 8,5) und 5 g der nassen Zellen enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht geschüttelt. Nach Beendigung der
Umsetzung wurde das im Reaktionsmedium vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert. Man erhielt 114 mM
L-Cystein.
Die nach Beispiel 6 erhaltenen Naßzellen wurden in der folgenden Umsetzung benutzt:
Eine Reaktionsflüssigkeit (100ml) vom pH-Wert 8,0, die 200 mM
(2,1 g) L-Serin, 1000 mM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat
und 5 g der nassen Zellen enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht gerührt. L-Serin wurde nach 2 und nach 5
Stunden nach Beginn der Umsetzung jeweils in einer Menge von 2,1 g hinzugegeben. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert
der Reaktionsflüssigkeit durch Zugabe von 6normaler Phosphorsäure bei 8,0 gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung
hatten sich 4,3 g L-Cystein und 1,1 g L-Cystin in der Reaktionsflüssigkeit
gebildet.
Die nach Beispiel 4 erhaltenen Naßzellen wurden direkt als Enzymquelle von Tryptophansynthase in der folgenden Umsetzung
benutzt:
Ein Reaktionsmedium (100ml; pH 8,5) , das 200 inM L-Serin,
300 mM Natriumsulfid, 1 mM Pyridoxalphosphat, 5 g der nassen Zellen und eine Verbindung enthielt, die in der Tabelle 3
angegeben ist, wurde 5 Stunden bei 350C leicht geschüttelt.
Der pH-Wert wurde während der Umsetzung bei 8,5 ± 0,3 gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wurde das im Reaktionsmedium
vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert und die Menge des gebildeten L-Cysteins bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 3 gezeigt.
Zugegebene Verbindung (Konzentration g/l) Menge an L-Cystein (mM)
Kontrolle (0) 67,2
Ethanol (10) 99,6
1-Propanol (10) 119,4
2-Propanol (10) 105,6
1-Butanol (10) 140,0
2-Butanol (10) 128,7
Isobutylalkohol (5) 114,8
tert-Butylalkohol (5) 107,2
1-Pentanol (5) 106,5
1-Octanol (10) 128,7
Ethylformiat (5) 96,7
Propylformiat (5) 99,8
Butylformiat (5) 104,3
Methylacetat (5) 98,4
Ethylacetat (5) 108,9
Butylacetat (5) 162,5
Isobutylacetat (5) 129,1
Aceton (5) 96,5
Methylethylketon (5) 111,8
Methylisobutylketon (5) 167,0
Natriumdeoxycholat (1) 139,4
Natriumdodecylsulfat (1) 160,9
Triton X-100 (1) 160,7
Claims (2)
1. Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und/oder L-Cystin durch Umsetzen eines ß-substituierten L-Alanins
der allgemeinen Formel (I):
X-CH2-CHCOOH NH2
(D
worin X für ein Halogenatom oder eine -OR- oder -SR-Gruppe
steht, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Acetyl-, Benzyl- oder Sulfonsäure-Gruppe ist,
mit einem Metallsulfid, einem Metallhydrosulfid, einem Metallpolysulfid,
Ammoniumsulfid, Ammonxumhydrosulfid oder einem Ammoniumpolysulfid in Gegenwart von Tryptophansynthase.
2. Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und/oder L-Cystin nach Anspruch 1, bei dem die Umsetzung in Gegenwart
von 0,01 bis 5 Gew.% mindestens eines aus der Gruppe aus Alkoholen, Estern, Ketonen und oberflächenaktiven Mitteln
ausgeführt wird.
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