DE3613388C2

DE3613388C2 -

Info

Publication number: DE3613388C2
Application number: DE3613388A
Authority: DE
Inventors: Masao Yamato Kanagawa Jp Shimada; Takeshi Zushi Kanagawa Jp Nakamura; Kenichi Yokohama Kanagawa Jp Ishiwata; Nobuyoshi Fujisawa Kanagawa Jp Makiguchi; Masami Yokohama Kanagawa Jp Uemura
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1987-07-23
Also published as: CA1299127C; AU562772B2; CH666695A5; JPS61242589A; NL8600984A; AU5634886A; KR860008273A; GB8609015D0; FR2580667A1; GB2174390A; IT8647912A0; IT1190275B; GB2174390B; KR890004021B1; JPH0527389B2; FR2580667B1; DE3613388A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und/oder L-Cystin gemäß Oberbegriff des Hauptanspruchs.

L-Cystein und L-Cystin werden viel für kosmetische Anwendungen, in der Nahrungsmittelindustrie als Zusatz und für andere Zwecke, u. a. in der Medizin z. B. als Bestandteil bei Transfusionen eingesetzt.

Es sind verschiedene Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und L-Cystin bekannt:

(1) Gewinnung aus Naturprodukten, z. B. Haar;
(2) Chemische Synthesen, z. B. gemäß DE-PS 32 63 099;
(3) Enzymatische Synthese aus DL-2-Aminothiazolin-4-carbonsäure gemäß DE-OS 25 49 924;
(4) Umsetzung eines β-substituierten Alanins mit einem Metallsulfid oder -hydrosulfid in Gegenwart von L-Cystein-Desulfhydrase gemäß DE-PS 25 20 772.

Diese Verfahren sind in der technisch-industriellen Anwendung nicht vollauf befriedigend.

Die Aufgabe der Erfindung liegt daher in der Schaffung eines mit geringem Aufwand durchführbaren Herstellungsverfahren für L-Cystein und/oder L-Cystin bei guten Ausbeuten und vorteilhaften Reinheits graden.

Nach der Erfindung erreicht man dies mit Hilfe des Verfahrens gemäß Hauptanspruch. Eine vorteilhafte Ausgestaltung ist aus dem Unter anspruch ersichtlich.

Erfindungsgemäß können L-Cystein und/oder L-Cystin bei geringen Kosten dadurch hergestellt werden, daß β-substituiertes L-Alanin mit einem Metallsulfid, einem Metallhydrosulfid, einem Metallpoly sulfid, Ammoniumsulfid, Ammoniumhydrosulfid oder einem Ammoniumpoly sulfid in Gegenwart von Tryptophansynthase umgesetzt wird.

Tryptophansynthase ist in vielen Mikroorganismen, höheren Pflanzen et al. vorhanden (vgl. "Bacteriological Reviews", Band 39, 1975, No. 2, Seiten 87-120).

Tryptophansynthase wird üblicherweise aus Mikroorganismen gewonnen; jedoch ist man hierbei nicht beschränkt. Stämme, die Tryptophansynthase erzeugen, sind z. B. Escherichia coli MT-10232 FERM BP-19, Escherichia coli MT-10242 FERM BP-20, Neurospora crassa ATCC 14692 und Sacharomyces cerevisiae ATCC 26787.

Verfahren zum Gewinnen von Tryptophansynthase aus gezüchteten Zellen sind bekannt und in "The Journal of Biological Chemistry", Band 249, Nummer 24, Seiten 7756-7763 (1974) für E. coli, dsgl. Band 250, Nummer 8, Seiten 2941-2946 (1975) für Neurospora crassa und im "European Journal of Biochemistry", Band 102, Seiten 159-165 (1979) für Sacharomyces cerevisiae beschrieben.

Die erfindungsgemäß eingesetzte Tryptophansynthase ist nicht notwendigerweise ein extrahiertes und gereinigtes Enzym. Es können als Enzymquelle Kulturen eines Tryptophansynthase erzeugenden Mikroorganismus, durch Zentrifugieren oder ähnliche Verfahren aus den Kulturen gewonnene lebende Zellen, daraus erhaltene getrocknete Zellen sowie daraus erhaltene Zelltrümmer benutzt werden, die durch Zerreiben, Ultraschall- oder andere Behandlung oder durch Autolyse der Zellen erhalten wurden. Extrakte dieser Zellen und aus den Extrakten erhaltene Rohenzyme können ebenfalls benutzt werden. Ebenso können auch immobilisierte Zellen oder Enzyme eingesetzt werden.

Zum Züchten von Tryptophansynthase produzierenden Zellen kann jedes synthetische oder natürliche Medium benutzt werden, vorausgesetzt, es enthält eine Kohlenstoffquelle, eine Stick stoffquelle, Mineralien und gegebenenfalls eine geringe Menge untergeordneter Nährstoffe. Die Zugabe einer geringen Menge von Tryptophan oder Indol zum Kulturmedium kann manchmal wirksam sein. Die produzierte Menge an Tryptophansynthase kann man z. B. dadurch erhöhen, daß man eine geringe Menge Indol acrylsäure zum Medium hinzugibt. Das Züchten erfolgt aerob durch Schütteln oder durch Bewegen der Kultur mittels Belüftung. Die Temperatur liegt im Bereich von 20-40°C, gewöhnlich zwischen 25 und 37°C. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt im Bereich von 5 bis 8.

Es ist bekannt, daß Tryptophansynthase ein multifunktionelles Enzym ist, d. h. daß das Enzym nicht nur die Synthese von L-Tryptophan aus Indol-3-glycerinphosphorsäure und L-Serin katalysiert, sondern auch viele andere Umsetzungen (vergleiche z. B. "Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology", Band 49, Seiten 127-185 (1979).

Erfindungsgemäß wird jedoch erstmalig auch die beschriebene Umsetzung durch Tryptophansynthase katalysiert.

β-substituierte L-Alanine, d. h. Ausgangsprodukte für die Umsetzung, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind z. B. β-Halogen-L-alanin, wie β-Chlor-L-alanin und β-Brom-L-alanin; O-Alkyl-L- serine, wie O-Methyl-L-serin und O-Ethyl-L-serin; S-Alkyl-L- cysteine, wie S-Methyl-L-cystein und S-Ethyl-L-cystein; O-Acetyl-L-serin; O-Benzyl-L-serin; S-Benzyl-L-cystein; L-Serin-O-sulfat; L-Serin et al.

Sulfide, Hydrosulfide oder Polysulfide für das erfindungs gemäße Verfahren sind z. B. Metall sulfide, wie Natriumsulfid, Kaliumsulfid und Lithiumsulfid; Metallhydrosulfide, wie Natriumhydrosulfid, Kaliumhydrosulfid und Lithiumhydrosulfid; Metallpolysulfide, wie Natriumpolysulfide und Kaliumpolysulfide; Ammoniumsulfid; Ammoniumhydrosulfid; Ammoniumpolysulfide et al.

Nach der Erfindung werden das β-substituierte L-Alanin und das Sulfid, Hydrosulfid oder Polysulfid üblicherweise in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 10 in Gegenwart von Tryptophansynthase umgesetzt. Die Reaktionstemperatur wird geeigneterweise im Bereich von 20 bis 60°C gehalten. Die Reaktionszeit beträgt allgemein 1 bis 100 Stunden für eine ansatzweise Durchführung der Reaktion, obwohl sie in Abhängigkeit vom Titer des Enzyms, den Konzentrationen der Ausgangsprodukte und anderen Bedingungen variieren kann. Die Umsetzung wird stationär oder unter langsamem Rühren ausgeführt.

Die Konzentrationen der Ausgangsstoffe, des β-substituierten L-Alanins und des Sulfids, Hydrosulfids oder Polysulfids, sind nicht besonders begrenzt, liegen jedoch üblicherweise im Bereich von etwa 0,1 bis 30 Gew.-%. Die Ausgangsstoffe können zu Beginn auf einmal hinzugegeben werden oder man kann sie portionsweise hinzufügen, während die Umsetzung fortschreitet. Es ist erwünscht, daß (bezogen auf das b-sub stituierte L-Alanin) das Sulfid, Hydrosulfid oder Polysulfid in der Reaktionsmischung in einer äquimolaren Menge oder mehr vorhanden ist. Bei der Umsetzung ist es erwünscht, eine geringe Menge eines Coenzyms (Pyridoxalphosphat) zu den Aus gangsstoffen hinzuzugeben.

Werden Zellen oder Kulturmedien eines Mikroorganismus, der Tryptophansynthase erzeugen kann, als Enzymquelle benutzt, dann kann die Ausbeute dadurch erhöht werden, daß man zumin dest eine der Verbindungen, ausgewählt aus Alkoholen, Estern, Ketonen und oberflächenaktiven Mitteln zu der Reaktionsmischung hinzugibt. Die Alkohole, die benutzt werden können, sind z. B. Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, Tertiärbutylalkohol, 1-Pentanol, 1-Octanol und ähnliche. Die Ester, die benutzt werden können, sind z. B. Ethylformiat, Propylformiat, Butyl formiat, Ethylacetat, Propylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat und ähnliche. Die Ketone, die benutzt werden können, sind z. B. Aceton, Methylethylketon, Methyl isobutylketon und ähnliche. Die oberflächenaktiven Mittel, die benutzt werden können, sind z. B. anionische oberflächenaktive Mittel, wie Natriumdodecylsulfat und Natriumdeoxycholat, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Octylphenylether, und andere oberflächenaktive Mittel. Die Menge dieser Verbindungen, die zu der Reaktionsmischung hinzugegeben wird, liegt üblicherweise im Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-%, wobei die Menge in Abhängigkeit von den benutzten Verbindungen oder dem eingesetzten Stamm variieren kann.

Bei dieser Arbeitsweise enthält die Reaktionsmischung im allgemeinen eine Mischung von L-Cystein und L-Cystin, da das L-Cystein leicht oxidiert und in L-Cystin umgewandelt wird. Die Menge an L-Cystin nimmt mit fortschreitender Umsetzung graduell zu. Das Verhältnis der Konzentration von L-Cystein zu der von L-Cystin kann durch Steuern der Reaktionsbedingungen variiert werden.

L-Cystein oder L-Cystin kann in irgendeiner üblichen Weise aus dem Reaktionsmedium gewonnen werden. So kann man zum Beispiel L-Cystin, das schwierig in Wasser löslich ist, leicht dadurch isolieren, daß man die Reaktionsmischung belüftet, um einen Hauptanteil des L-Cysteins zu L-Cystin zu oxidieren, nachdem die Umsetzung beendet ist. L-Cystein kann man erhalten, indem man das so erhaltene L-Cystin einer elektrolytischen Reduktion unterwirft.

Die quantitative Bestimmung von L-Cystein und L-Cystin erfolgt durch Flüssigkeitschromatographie. Die Flüssigkeitschroma tographie unter Verwendung einer Säule zum Trennen der optischen Isomeren zeigt, daß sowohl Cystein als auch Cystin in der L-Konfiguration erhalten werden.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Escherichia coli MT-10242 FERM BP-20 wurde in ein flüssiges Medium von einem Prozent Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH₂PO₄ (pH 7,0) geimpft und unter Schütteln 20 Stunden bei 30°C gezüchtet.

Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und das Enzym nach dem Verfahren von O. Adachi et al. "The Journal of Biological Chemistry", Band 249, Nummer 24, Seiten 7756-7763 (1974) gereinigt. Das erhaltene Enzym Tryptophansynthase mit einer spezifischen Aktivität (Titer) von 9,2 Einheiten/mg wurde in der folgenden Umsetzung verwendet. Die Enzymaktivität wurde nach dem Verfahren von C. Yanofsky et al., "Methods in Enzymology", Band 15, Seiten 801-807 (1962) bestimmt. Eine Einheit ist durch die Menge des Enzyms repräsentiert, die ein Mikromol/min Tryptophan aus L-Serin und Indol bei 37°C (pH 7,8) erzeugt.

0,5 mg Tryptophansynthase wurden zu 10 ml eines Reaktions mediums (pH 8,5) hinzugegeben, das 50 mM L-Serin, 100 mM eines Sulfids, Hydrosulfids oder Polysulfids, wie in Tabelle 1 angegeben, und 0,1 mM Pyridoxalphosphat enthielt, und dann wurde das Reaktionsmedium langsam 10 Stunden bei 35°C geschüttelt. Die Konzentration des erhaltenen L-Cysteins und L-Cystins und die Gesamtausbeuten, bezogen auf L-Serin, sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Beispiel 2

Nach dem Verfahren von W. H. Matchett et al., "The Journal of Biological Chemistry", Band 250, Nummer 8, Seiten 2941-2946 (1975), wurde Neurospora crassa ATCC 14692 gezüchtet und das Enzym gereinigt.

Das so erhaltene Enzym Tryptophansynthase hatte eine spezifische Aktivität von 1,3 Einheiten/mg.

Die Enzymflüssigkeit wurde in der folgenden Umsetzung benutzt: Ein Reaktionsmedium (pH 8,5; 10 ml), das 50 mM L-Serin, 100 mM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 1,3 Ein heiten Tryptophansynthase enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht geschüttelt. In dem Reaktionsmedium wurden 12 mM L-Cystein und 4 mM L-Cystin gebildet.

Beispiel 3

Saccharomyces cerevisiae ATCC-26787 wurde in ein flüssiges Medium aus 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 2% Glucose und 0,01% Indolacrylsäure (pH 6,0) geimpft und unter Schütteln 20 Stunden bei 30°C gezüchtet. Danach wurden die Zellen durch Zentri fugieren gesammelt.

Das Enzym wurde nach dem Verfahren von M. Dettwiler et al., "European Journal of Biochemistry", Band 102, Seiten 159-165 (1979) gereinigt.

Es wurde Tryptophansynthase mit einer spezifischen Aktivität von 1,2 Einheiten/mg erhalten.

Die Enzymflüssigkeit wurde benutzt, um die folgende Umsetzung auszuführen: Eine Reaktionsflüssigkeit (10 ml), die 50 mM L-Serin, 100 mM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 1,2 Einheiten Tryptophansynthase (pH 8,5) enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht geschüttelt. Die erhaltene Reak tionsflüssigkeit enthielt 11 mM L-Cystein und 3 mM L-Cystin.

Beispiel 4

Escherichia coli MT-10242 FERM BP-20 wurde in ein flüssiges Medium vom pH 7,0 geimpft, das 1% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH₂PO₄ enthielt, und dann wurde 20 Stunden bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden danach durch Zen trifugieren gesammelt und als Enzymquelle von Tryptophansynthase benutzt. Die Naßzellen hatten eine spezifische Aktivität von 120 Einheiten/g.

Ein Reaktionsmedium (100 ml), das 200 mM L-Serin, 300 mM Natrium sulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat und 5 g der nassen Zellen enthielt und mit HCl auf einen pH-Wert von 87,5 eingestellt worden war, schüttelte man 24 Stunden bei 35°C. Nach Abschluß der Umsetzung wurde das in dem Reaktionsmedium vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert. Die Menge des erzeugten L-Cysteins betrug 98 mM.

Beispiel 5

Nach Beispiel 1 erhaltene Tryptophansynthase wurde in der folgenden Umsetzung benutzt:
Die Tryptophansynthase (500 Einheiten) wurde zu 100 ml einer Reaktionsflüssigkeit hinzugegeben, die 300 mM eines β-substi tuierten L-Alanins, wie in der Tabelle 2 angegeben, 600 mM Natriumhydrosulfid, 1 mM Pyridoxalphosphat und 480 mM Trisamino methan-HCl-Puffer (pH 8,5) enthielt, und 1 Stunde bei 35°C leicht geschüttelt. Nach Abschluß der Umsetzung wurde das in der Reaktionsflüssigkeit vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert und die Menge des L-Cysteins bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2

Beispiel 6

Escherichia coli MT-10232 FERM BP-19 wurde in ein flüssiges Medium vom pH-Wert 7,0 geimpft, das 1% Fleischextrakt, 0,5% Pepton, 0,1% Hefeextrakt und 0,2% KH₂PO₄ enthielt und zum Züchten wurde 20 Stunden bei 30°C geschüttelt. Danach sammelte man die Zellen durch Zentrifugieren und fror sie bei -20°C ein, um sie als Enzymquelle von Tryptophansynthase zu lagern. Die nassen Zellen hatten eine Tryptophansynthase-Aktivität von 89 Einheiten/g. Die gelagerten Zellen wurden in der folgenden Umsetzung eingesetzt:
Ein Reaktionsmedium (100 ml), das 200 mM L-Serin, 300 mM Natrium sulfid, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 100 mM Trisaminomethan- HCl-Puffer (pH 8,5) und 5 g der nassen Zellen enthielt, wurde 10 Stunden bei 35°C leicht geschüttelt. Nach Beendigung der Umsetzung wurde das im Reaktionsmedium vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert. Man erhielt 114 mM L-Cystein.

Beispiel 7

Die nach Beispiel 6 erhaltenen Naßzellen wurden in der folgenden Umsetzung benutzt:

Eine Reaktionsflüssigkeit (100 ml) vom pH-Wert 8,0, die 200 mM (2,1 g) L-Serin, 1000 mM Natriumhydrosulfid, 0,1 mM Pyridoxal phosphat und 5 g der nassen Zellen enthielt, wurden 10 Stunden bei 35°C leicht gerührt. L-Serin wurde nach 2 und nach 5 Stunden nach Beginn der Umsetzung jeweils in einer Menge von 2,1 g hinzugegeben. Während der Umsetzung wurde der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit durch Zugabe von 6 normaler Phosphorsäure bei 8,0 gehalten. Nach Beendigung der Umsetzung hatten sich 4,3 g L-Cystein und 1,1 g L-Cystin in der Reaktions flüssigkeit gebildet.

Beispiel 8

Die nach Beispiel 4 erhaltenen Naßzellen wurden direkt als Enzymquelle von Tryptophansynthase in der folgenden Umsetzung benutzt:

Ein Reaktionsmedium (100 ml; pH 8,5), das 200 mM L-Serin, 300 mM Natriumsulfid, 1 mM Pyridoxalphosphat, 5 g der nassen Zellen und eine Verbindung enthielt, die in der Tabelle 3 angegeben ist, wurde 5 Stunden bei 35C leicht geschüttelt. Der pH-Wert wurde während der Umsetzung bei 8,5±0,3 gehalten. Nach Beendigung der Reaktion wurde das im Reaktionsmedium vorhandene L-Cystin durch Dithiothreit zu L-Cystein reduziert und die Menge des gebildeten L-Cysteins bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von L-Cystein und/oder L-Cystin durch Umsetzen eines β-substituierten L-Alanins der allgemeinen Formel (I): worin X für ein Halogenatom oder eine -OR- oder eine -SR-Gruppe steht, in der R ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Acetyl-, Benzyl- oder Sulfonsäure-Gruppe ist, mit einem Metallsulfid, einem Metallhydrosulfid, einem Metall polysulfid, Ammoniumsulfid, Ammoniumhydrosulfid oder einem Ammoniumpolysulfid, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart von Tryptophansynthase durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 0,01 bis 5 Gew.-% mindestens einer Komponente aus der Gruppe von Alkoholen, Estern, Ketonen und oberflächenaktiven Mitteln ausgeführt wird.