JPH0660157B2 - システインからシスチンを製造する方法 - Google Patents

システインからシスチンを製造する方法

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    • C07C323/58Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素法で得られたシステインを酸化してシス
チンを得る方法に関する。
L−シスチン、L−システインは、医薬あるいは医薬原
料、食品添加物、化粧品添加物として利用されており、
特に近年はコールドパーマ液の原料としての需要が伸び
ているS元素含有のアミノ酸である。
従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点 発酵法、酵素法、合成法いずれの方法においてもシステ
イン含有反応液(以下反応液とは発酵、酵素反応や合成
反応を問わず反応が終了した時点での液を意味する。)
よりシステインの分離においては反応液の組成が複雑で
あることと、システインの水に対する溶解度が非常に大
きいため、例えば塩酸、P−トルエンスルホン酸などの
強酸と塩を生成させてから単離、精製する方法などが知
られている。
これらの方法はいずれも繁雑で分離取り出し収率が極め
て低いのが通例であり、また発酵法の組成の複雑な液か
らの純度の高い状態で取り出すことは難しい。特に発
酵、酵素反応で得られた反応液中には、菌由来の挾雑物
が含まれているので、その分離精製時のロスは大きい。
システインは比較的酸化しやすいので反応液中のシステ
インを強制的に酸化してシスチンとして精製分離後、電
解還元により精システインとして回収する方法が知られ
ている。
システイン発酵液中のシステインを酸化する方法は若干
開示されており、特公昭57−7634号公報方法で
は、PH5〜10の範囲内に維持して、空気酸化やH2O2
などの過酸化物を用いた酸化方法が記載されている。
しかしながら、本発明者らの追試によればH2O2や空気に
よる酸化方法は、かなりの割合の分解物が生じるなど問
題点があった。
また反応液が例えば該方法のように、酸化反応時の触媒
となるFe++、Mn++などの金属イオンがシステイン反応系
中に添加含有されている発酵液の場合は、比較的高収率
でシスチンが得られるものの、金属イオンが殆んど含ま
れない反応液中では収率が悪い。Fe++、Mn++などの
添加により得られたシスチンへの金属イオンの混入はシ
ステインの電解還元時の悪影響も考えられる。
さらに発酵法、酵素法により得られたシスティン反応液
中の廃菌体や廃酵素を除去するためには反応液をHCl、H
2SO4などによりPH4以下として活性炭を添加、熱処理
により廃酵素、廃菌体をフロツク状に集菌して活性炭に
吸着後固液分離して除去する方法が、もっとも除菌効果
が大きいことがわかった。空気酸化、H2O2での酸化法で
はPH5以上が好ましいと該公報にも記載されており、
活性炭処理除菌液の如き酸性下での反応液後処理後のシ
ステインの酸化には適さない。
特に本発明者らの追試では、PH1付近の強酸性下での
空気酸化では殆んどシスチンは生成しないことがわかっ
た。
システインの酸化方法では、その他メチルキサンチドに
よる酸化(USP 4039586)やγ線照射による
酸化(ケミカルコミユニケイシヨン Chem,Commun,1968
826〜827)方法などの報告例もあるがいずれも工業的
には実施可能とはいえない。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記のような問題点を踏まえて鋭意検討
の結果、本発明方法に達したものである。
すなわち、本発明方法はトリプトファンシンターゼの存
在下、L−セリンとスルフィドリル基化合物との反応で
得られた反応液中のシスティンをジメチルスルホキシド
存在下、PH1〜4の範囲で酸化することによりシステ
ィンをシスチンに変換し分離することを特徴とするシス
チンの製造方法である。本発明においては、特にシステ
イン製造工程由来の無機塩含量が比較的多い反応液に適
用したほうが好ましい。
例えば、本出願人は先に、L−セリンを出発原料として
トリプトフアンシンターゼの存在下、Na2S、NaHSなどの
スルフイドリル基導入剤となる含硫黄化合物を酵素反応
させてL−システインを得る方法を見い出し出願した
が、この酵素反応で得られた反応液中にはNaCl、(NH4)2
SO4などの無機塩が含まれる。
本発明方法をこのような反応液に適用した場合、ジメチ
ルスルホキシド(以下DMSOと略す)存在下の酸化に
おいては、イオン的反応機構によるものと推定されるた
めか、酸化反応系中に存在する塩の触媒的作用により反
応速度は増大する傾向となる。本発明におけるスルフィ
ドリル基化合物とはNaS、NaHSなどのスルフィ
ドリル基を導入する化合物をいう。
本発明はこのような、DMSOの存在下で、酵素法で得
られた反応液中のシステインをシスチンに酸化する方法
であり、反応は温和な条件下で進行するので反応組成に
は影響されない。したがって、システイン製造過程で生
成する若干のシスチンが含まれていてもよく、また培養
由来の廃酵素や廃菌体が反応液中に含まれていても差し
支えない。例えば酵素反応終了後の酵素または酵素源の
菌体が存在している段階でDMSOを添加して酸化反応
を行いシスチンに添加後、廃酵素、廃菌体を除去してシ
スチンを単離してもよい。
しかしながら前記した如く、本発明においては反応液中
の除菌方法はPH4以下、好ましくはPH1付近の酸性
下で吸着剤存在下反応液を熱処理して廃酵素、廃菌体を
フロツク状に集菌して、これを活性炭などに吸着分離す
る方法が除菌効果は大きく、好ましいのでこのようにし
て反応液の除菌後、システインを含む酸性水溶液にDM
SOを添加してシスチンに酸化させたほうがよい。また
本発明においてはPHの低下とともに反応速度は増大
し、酸性下での反応がシスチン収率も向上する。
DMSOの使用量は、反応液中に含まれるシステインに
対して0.2倍モル〜2.0倍モル程度で良く、さらに好まし
くは、0.5倍モル〜1.0倍モルが良好である。
反応を実施する温度は、5℃〜100℃の範囲であれば
特に特定されるものでない。
また本発明においては、強制的に酸素を供給する必要は
全くなく、ごく普通の密閉系容器で実施でき、N2雰囲気
下においてもなんら支障はない。
作用効果 このように本発明においては、DMSOの存在下で酸化
反応を行うことにより以下の利点を有する。
(1).空気酸化、H2O2酸化などでは、触媒としてFe++、M
n++、Cu++などの金属を添加しないと適正な反応速度が
得られないが、本方法においてはその必要は全くない。
また、空気酸化、H2O2酸化などはシステイン酸などの分
解物まで進行し、シスチンとしての回収時にロスが多
く、酸化反応の制御に難があるがDMSO存在下の酸化
においては、ほぼ定量的にシステインからシスチンが得
られる。また電解質の無機塩が存在していれば酸化反応
速度も増す。
(2).本発明では酸化させるシステイン水溶液はPHが
低い程好ましいので、反応液を酸性下にして活性炭によ
る除菌後処理後のシステイン酸性水溶液を酸化させる場
合は、PH調整する必要もなくそのまま酸化反応が実施
できる、 などである。
本発明において、従来用いられていた空気酸化やH2O2
化に対し、DMSOを用いた場合、特に強酸性下ではシ
ステイン酸などへの分解率が低く、顕著な効果があるこ
とを示せば下表のとおりである。
なお、酸化試験には夫々L−システイン10%水溶液の
モデル液を用い、L−システインに対しDMSO及びH2
O2は夫々0.75倍モル、空気酸化の場合は空気を1分間に
溶液量の3倍量を通気し、夫々室温で8時間酸化反応を
行った。表中、上段の数字はシステインの反応率(酸化
率)を示し、下段の数字はシスチン生成率(シスチンへ
の選択率)を示す。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。実施例
中のシステイン及びシスチンの分析方法は以下のように
システインについては公知のガイトンデ(Gaitonde)の方
法によった。
すなわち、被検液約0.5gをサンプリングしてその正確
な量を秤量して、2N HClを加えて10〜20倍に希釈す
る。さらに希釈液を蒸留水で100倍程度に希釈する。
最終的に1000〜2000倍の希釈液を酸性ニンヒド
リン試薬を用いて発色させ吸光度計にて560nmの吸光
度を測定する。一方、既知の濃度の標準サンプルを作成
しておき、560nmの吸光度の検量線を作成しておき、
本検量線をもとに被検液中のシステイン濃度を算出す
る。
またシスチン分については、1000〜2000倍に希
釈した被検液に5μMの1,4−ジチオトレイトール
(還元剤)約同量加えて、さらに2N NaOHによりPH
8.0〜8.5とし、室温にて1時間放置して含有するシスチ
ンをすべてシステインに還元し、システインとして上記
方法により濃度を算出する。この方法により得られた濃
度から還元前のシステイン濃度を差し引くことによりシ
スチン濃度とする。
実施例 300ml容撹拌付きのセパラブルフラスコにL−セリン
22.0Wt.%を含有するL−セリン水溶液91g(L−セリ
ン0.19モル)と水硫化ソーダ2水和物(NaSH・2H2O)28.
1g(0.38モル)及び大腸菌由来のトリプトフアンシン
ターゼを培養した菌体ごと10g(乾燥分2.2g)を加
え、5%苛性ソーダ水溶液にてPH7.5に調整し、さら
に水を加えて全容を200mlとした。35℃の恒温槽に
浸して、24時間反応させた。
反応終了後、塩酸にてPHを1.0として活性炭(武田薬
品 特製白サギ)5gを添加して80℃にて30分熱処
理を付した。熱処理後80℃のままヌツチエにて熱過
を行ない廃菌体を除去して処理後の反応液188gを
得た。本反応液中には、分析の結果L−システイン換
算20.1g(0.166モル)のL−システイン及び2.0g(0.
008モル)のL−シスチンが含まれていた。L−セリン
からのL−システイン、L−シスチンへの転換率は計9
5.8%であった。
このように熱処理された反応液を、300ml容撹拌付き
セパラブルフラスコに移し、DMSO9.7gを添加し
て、室温にて8時間撹拌し、L−シスチン結晶の析出し
た溶液196.2gを得た。本溶液中には、L−システイン
が0.2gが残存していた。
本酸化反応溶液を、5%苛性ソーダ水溶液にてPH約5
まで中和して析出している結晶を過、乾燥し白色粉状
の結晶19.8g(0.165モルas100%)を得た。本品
は、▲〔α〕20 D▼=−218°(C=2,2N HCl)Fe
分10ppm以下、純度は98.5%以上であった。なお回収
率は、反応液中に存在したL−システインとL−シスチ
ンをL−シスチンとして95.0%が回収された。また分解
率は2%以内であった。
比較例 実施例と同様な反応方法が得た反応液を、実施例と同様
にして熱処理後、5%苛性ソーダ水溶液でPH約5まで
中和してから熱処理反応液を300ml容の実施例に用い
た同じセパラブルフラスコに移し、FeCl20.2gを添加
し、室温で空気を約200ml/分速度で24時間吹き込
み、L−シスチン結晶が析出した溶液を200.8gを得
た。
本溶液中にはL−システイン4.2gが残存していた。
本酸化反応液から析出した結晶を過、乾燥し、白色粉
状の結晶14.8gを得た。本品は、▲〔α〕20 D▼=−2
15°(C=2,2N HCl)Fe 30ppm、純度は98.5%
以上であった。なお回収率は、反応液中に存在するL−
システインとL−シスチンよりL−シスチンとして70.3
%が回収された。また分解率は9.9%であった。
フロントページの続き (56)参考文献 特公 昭57−7634(JP,B2) 「Biochem.Biophys.R es.Commun.」vol.64 N o.1 P.441〜P.447(1975)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】トリプトファンシンターゼの存在下、L−
    セリンとスルフィドリル基化合物との反応で得られた反
    応液中のシスティンをジメチルスルホキシド存在下、P
    H1〜4の範囲で酸化することによりシスティンをシス
    チンに変換し分離することを特徴とするシスチンの製造
    方法。
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