JPS62221664A - システインからシスチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素法または発酵法で得られたシスティンを
酸化してシスチンを得る方法に関する。

Ｌ−シスチン、Ｌ−システィンは、医薬あるいは医薬原
料、食品添加物、化粧品添加物として利用されており、
特に近年はコールドパーマ液の原料としての需要も大き
いＳ元素含有のアミノ酸である。

〔従来の技術及び発明が解決しようとしている問題点〕
発酵法、酵素法２合成法いずれの方法においても、シス
ティン含有反応液（以下反応液とは発酵。

酵素反応や合成反応を問わず、反応が終了した時点での
液を意味する。）よりシスティンの分離においては反応
液の組成が複雑であることと、システィンの水に対する
溶解度が非常に大きいため、例えば塩酸、Ｐ−トルエン
スルホン酸などの強酸と塩を生成させてから単離、精製
する方法などが知られている。

これらの方法はいずれも繁雑で分離取り出し収率が極め
て低いのが通例であり、また発酵法の組成の複雑な液か
ら純度の高い状態で取り出すことは難しい。特に発酵、
酵素反応で得られた反応液中には菌由来の挾雑物が含ま
れているので、その分離精製時のロスは大きい。

そのため、システィンは比較的酸化しやすいので反応液
中のシスティンを強制的に酸化してシスチンとして精製
分離後、電解還元により精システィンとして回収する方
法が知られている。

システイソ発酵液中のシスティンを酸化する方法は若干
知られており、特公昭５７−７６３４号公報方法では、
ＰＨ５〜１０の範囲内に維持して空気酸化やＨ２Ｏ２な
どの過酸化物を用いた酸化方法が記載されている。

しかしながら、本発明者らの追試によればＨ２Ｏ２や空
気による酸化方法は、反応機構としてはラジカル酸化で
進むものと推定され、反応条件制御に難があり、かなり
の割合の分解物が生じるなど問題点があった。

また発酵法、酵素法により得られたシスティン反応液中
の廃菌体や廃酵素を除去する方法としては、反応液をＨ
Ｃｌ　、　　Ｈ２ＳＯ４などにより、ＰＨ４以下として
活性炭を添加、熱処理により廃酵素。

廃菌体をフロック状に集菌して活性炭に吸着後置液分離
して除去する方法が、通常もっとも除菌効果が大きいこ
とが知られているが、その場合該公報のように空気酸化
＃　Ｈ２Ｏ２での酸化法ではＰＨ５以上が好ましいとさ
れており、酸性下での反応液処理後のシスティンの酸化
には適さない。

特に本発明者らの追試では、ＰＨＩ付近の強酸性下での
空気酸化では殆んどシスチンは生成しないことがわかっ
た。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは上記のような問題を踏まえて、反応液の除
菌後の酸性処理液にもそのまま適用できて、しかも高収
率でシスティンがらシスチンを得る方法を鋭意検討の結
果、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）の存
在下で実施する方法を先に見い出した。

さらに本発明者らは、以下の知見を得た。

反応液中の生成システィンは反応時または除菌時に一部
シスチンとなるが、シスチンの溶解度はＰＨ１，０付近
の強酸性下でも約０．５係程度であり、溶液状にした完
全な除菌処理はできなく、極力シスチンの溶解領域でシ
スティンの酸化反応を行うのが望ましい。

図−１は、本発明実施例１に準じて調整したモデル液、
即ち約１０１濃度のシスチン、約５．３係濃度のＤＭＳ
Ｏを含有する水溶液に、濃塩酸を添加して強酸性にした
場合の室温における夫々のＰＨ値におけるシスチンの溶
解度曲線である。

図より理解できるように、ＤＭＳＯの存在したＰＨ１以
下になれば極端にシスチンの溶解度が上昇し、ＰＨ０，
５以下になれば系中の生成シスチンは殆んど溶解されて
いることがわかった。

また、システィンは塩酸酸性下などの強酸性側では、特
に安定であり、したがって強酸性下で酸化反応を行えば
分解ロスなども少ないこともわがった。

本発明はこれらの知見に基づき発明されたものである。

即ち、本発明は酵素法または発酵法で得られたシスティ
ン水溶液を酸化してシスチンを得る方法において、ジメ
チルスルホキシドの存在下、水溶液中のＰＨを１以下に
して酸化させることを特徴とするシスティンからシスチ
ンの製造方法である。

本発明においては、酸化の対象となる反応液は発酵、酵
素法で得られたシスティンを含む反応液なら全て使用で
き、例えば前記特公昭５７−７６３４で使用された２−
アミノ−チアリシン−４−カルボン酸（ＡＴＣ）を原料
としてシュードモナス属菌なとのＬ−システィンを生産
する能力のある微生物を培養して得られた反応液なども
使用できる。

例えば、本出願人は先にＬ−セリンを出発原料として、
トリプトファンシンターゼの存在下、Ｎａ２Ｓ、ＮａＨ
８、Ｈ２Ｓ　などのスルフィドリル基導入剤となる含硫
黄化合物を酵素反応させてＬ−システィンを得る方法を
見い出し出願したが、本発明方法はこのような反応液を
塩酸、硫酸などでＰ　Ｈ１，ｎ以下にして適用した場合
、ＤＭＳＯ存在下の酸化においては、イオン的反応機構
によるものと推定されるためか、酸化反応系中に存在す
る酸の触媒的作用によりＰＨの低下とともに反応速度は
増大する傾向となる。またｐＨ１，０以下、特に１１．
５以下とすれば系中のシスチン分も殆んどが溶解してい
るため有効成分が溶液系となっており、除菌などの固液
分離の精製では極めて有利となる。また反応は温和な条
件下で進行するので反応組成には影響されない。したが
って、システィン製造過程で生成する若干のシスチンが
含まれていてもよく、また培養由来の廃酵素や廃菌体が
反応液中に含まれていても差し支えない。

特に本発明の好ましい態様としては、酵素反応終了後の
酵素または酵素源の菌体が存在している段階で塩酸、硫
酸などで反応液のＰｉ（を１，０以下とし、ＤＭＳＯを
添加して反応液内のシスティンを酸性下の安定な条件下
で速やかにシスチンへ転換し、より安定なシスチンの形
態で溶解させておき、その後活性炭などの吸着剤存在下
で熱処理を付して廃酵素、廃菌体をフロック状に集菌し
て取り除き、得られた除菌ろ液をアルカリでＰＨ２〜３
程度まで中和してシスチンを析出させ単離する方法が効
果的である。

もちろん酸化を実施する前に、上記と同様な方法で除菌
を行ないその後ＤＭＳＯを添加して酸化を行なっても何
ら問題はない。

ＤＭＳＯの使用量は１反応液中に含まれるシスティンに
対して０．２倍モル〜２．０倍モル程度で良く、さらに
好ましくは０．５倍モル〜１．０倍モルが良好である。

反応を実施する温度は、５〜１００℃の範囲であれば特
に特定されるものでない。

また本発明においては、強制的に酸素を供給する必要は
全くなく、ごく普通の密閉系容器で実施でき、Ｎ２雰囲
気下においてもなんら支障はない。

〔作用効果〕

このように本発明においては、システィン含有水溶液を
ＰＨ１，０以下でＤＭＳＯの存在下、酸化反応を行なう
ことにより以下の利点を有する。

（１）酸性下で酸化反応を行なうことによりシスティン
を安定な状態で酸化でき、分解ロスなどが少なく、また
酸化反応速度が速い。

（２）酸化反応終了後も、ＰＨ１，０以下に維持されて
いるのでシスチンは溶解しており、有効成分は最も安定
な形態であり、かつ均一な溶液状態となっており、除菌
のための加熱処理をしても分解ロスはなく、また活性炭
などを使用しての菌体吸着操作を行なっても付着ロスな
どが少なく、除菌効果も極めて大きいことなどである。

以下、実施例によって本発明の詳細な説明する。

実施例中のシスティン及びシスチンの分析方法は以下の
ように、システィンについては公知のガイトンデ（Ｇａ
ｉｔｏｎｄｅ）の方法によった。

すなわち、被検成約０．５ｇをサンプリングしてその正
確な量を稗量して、２ＮＨＣＩ！　を加えて１０〜２０
倍に希釈する。さらに希釈液を蒸留水で１００倍程度に
希釈する。最終的に１０００〜２０００倍の希釈液を酸
性ニンヒドリン試薬を用いて発色させ、吸光度計にて５
６０ｎｍの吸光度を測定する。一方、既知の濃度の標準
サンプルをもとに、５６０ｎｍの吸光度の検量線を作成
しておき、本検量線をもとに被検液中のシスティン濃度
を算出する。

またシスチン分については、１０００〜２０００倍に希
釈した被検液に、５μＭの１．４−ジチオトレイトール
（還元剤）約同量加えて、さらに２ＮＮａＯＨによりＰ
　）Ｉ　８．０〜８．５とし、室温にて１時間放置して
含有するシスチンをすべてシスティンに還元し、システ
ィンとして上記方法により濃度を算出する。この方法に
より得られた濃度から還元前のシスティン濃度を差し引
くことによりシスチン濃度とする。

実施例 ３００ゴ容撹拌付きのセパラブルフラスコに、Ｌ−セリ
ン２２．Ｏｗｔ　、％　　を含有するＬ−セリン水溶Ｖ
Ｌ９１ｇ（Ｌ−セリン０．１９モル）に水硫化ソーダ２
水和物（Ｎａ５Ｈ・２ＨｚＯ）　２８．１１　（０，３
８モル）及び大腸菌由来のトリプト７アンシンターゼを
培養した菌体ごとｌ０ＪＦ（乾燥分２．２１）を加え、
５係苛性ソーダ水溶液にてＰ　Ｈ７，５に調整し、さら
に水を加えて全容を２００　ｍｌとした。３５°Ｃの恒
温槽に浸して、２４時間反応させた。

反応終了後の反応液には、分析の結果Ｌ−システィン換
算１８．５１！（０，１５３モル）のし−システィン及
び：４．２　ｇ（０，０１３モル）のし−シスチンが含
まれていた。Ｌ−セリンからＬ−システィン及びＬ−シ
スチンへの転換率は計９４．２％であった。

本反応液に濃塩酸約３０＋ｎＡ’を加えてＰＨ０，５と
し、さらにＤＭＳＯ９，７ｇを添加して、３５°Ｃにて
８時間撹拌下に酸化を行なった。この段階で酸化液中に
はＬ−システィン０．７＃　（０，００６モル）及びＬ
−シスチン２０．７９　（０，０８６モル）であり、Ｌ
−セリンからし一シスチンへの転換率は９０．６係であ
った。

これに活性炭（武田薬品）５ｇを添加して８０°Ｃ３０
分熱処理を付した。熱処理後８０°Ｃのままヌッチェに
て熱ヂ過を行ない廃菌体を除去して処理後の均一な除菌
液２３０．９を得た。分析の結果、本除菌液中には、Ｌ
−システィン０．３　＆　（０，００２モル）及びＬ−
シスチン２０．８１！（０，０８７モル）であり、Ｌ−
セリンからし一シスチンへの転換率は９１．３係であっ
た。

得られた除菌液を室温にて３０　Ｓ　ＮａＯＨ液約５ゴ
を滴下して、ＰＨ２まで中和しＬ−シスチンの結晶を析
出させ、これをヌツチェによる減圧ｐ過で戸別して５０
ｍ１の水で十分洗浄し、乾燥後白色粉状の結晶２０．２
　ｇ（０，１１８４モルａｓ　　１００係）を得た。氷
晶は〔α〕習＝−２１８，６（Ｃ＝　２゜２Ｎ　　ＨＣ
ｌ　）、　　Ｆｅ分１０ｐｐｍ以下、純度は９８．５　
％以上であった。なお回収率は反応液中に存在するし一
システィンとＬ−シスチンよりＬ−シスチンとしてほぼ
１００チ回収された。

【図面の簡単な説明】

図−１は、１０係濃度のシスチン及び５．３係濃度のＤ
ＭＳＯを含有するモデル水溶液に塩酸を添加して強酸性
にした場合の室温（２５℃）におけるＰＨとシスチン溶
解度との関係図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　酵素法または発酵法で得られたシステイン水溶液を
   酸化してシスチンを得る方法において、ジメチルスルホ
   キシドの存在下、水溶液中のＰＨを１以下にして酸化さ
   せることを特徴とするシステインからシスチンの製造方
   法。