JPS63258849A - システインからシスチンを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素法または発酵法で得られたシスティンを
酸化してシスチンを得る方法に関する。

Ｌ−シスチン、Ｌ−システィンは、医薬あるいは医薬原
料、食品添加物、化粧品添加物として利用されており、
特に近年はコールドパーマ液の原料としての需要が伸び
ている硫黄含有のアミノ酸である。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）発酵
法、酵素法、合成法いずれの方法においてもシスティン
含有反応液（以下反応液とは発酵、酵素反応や合成反応
を問わず反応が終了した時点での液を意味する。）より
システィンの分離においては反応液の組成が複雑である
ことと、システィンの水に対する溶解度が非常に大きい
ため、例えば塩酸、Ｐ−）ルエンスルホン酸などの強酸
と塩を生成させてから単離、精製する方法などが知られ
ている。

これらの方法はいずれも繁雑で分離取り出し収率が極め
て低いのが通例であり、また発酵法の組成の複雑な液か
ら純度の高い状態で取り出すことは難しい、特に発酵、
酵素反応で得られた反応液中には菌由来の挾雑物が含ま
れているので、その分離精製時のロスは大きい。

そのため、システィンは比較的酸化しやすいので反応液
中のシスティンを強制的に酸化してシスチンとして精製
分離後、電解還元により精システィンとして回収する方
法が知られている。

システィン発酵液中のシスティンを酸化する方法は若干
開示されており、特公昭５７−７６３４号公報方法では
、ｐＨ５〜１０の範囲内に維持して、空気酸化やＨ２Ｏ
，などの過酸化物を用いた酸化方法が記載されている。

しかしながら、本発明者らの追試によればＨ２Ｏ。

や空気による酸化方法は、反応機構としてはラジカル酸
化で進むものと推定され、反応条件制御に難がありかな
りの割合の分解物が生じるなど問題点があった。

また反応液が例えば該方法のように、ラジカル酸化反応
時の触媒となるＦｅ、Ｍｎ　　などの金属イオンがシス
ティン反応系中に添加含有されている発酵液の場合は、
比較的高収率でシスチンが得られるものの、金属イオン
が殆ど含まれない反応液中では収率が悪い。またＦｅ、
Ｍｎ　　などの添加によるシスチンへの混入は、シスチ
ンの電解還元時の悪影響も考えられる。

さらに発酵法、酵素法により得られたシスティン反応液
中の廃菌体や廃酵素を除去するためには反応液を）ＩＣ
Ｉ　Ｈ２ＳＯ，などによりｐＨ４以下として活性炭を添
加、熱処理により廃酵素、廃菌体をフロック状に集菌し
て活性炭に吸着後置液分離して除去する方法が、もっと
も除菌効果が大きいことがわかったが、その場合空気酸
化、ｏｔｏｇでの酸化法ではＰＨ５以上が好ましいと該
公報にも記載されており、酸性下での反応液後処理後の
システィンの酸化には適さない。

特に本発明者らの追試では、ｐＨ１付近の強酸性下での
空気酸化では殆どシスチンは生成しないこ、とがわかっ
た。

システィンの酸化方法では、その他メチルキサンチドに
よる酸化（ｔｌｓＦ　　４，０３９，５８６）やＴ線照
射による酸化（ケミカル　コミユニケイジョンＣｈｅ＋
＊、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１９６８．８２６〜８２７　）
方法などの報告例もあるがいずれも工業的には実施可能
とはいえない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、上記のような問題点を踏まえて鋭意検討
の結果、本発明方法に達したものである。

すなわち本発明方法は、酵素法または発酵法で得られた
システィンを含む水溶液中のシスティンを、ジメチルス
ルホキシドの存在下、酸化することによりシスティンを
シスチンに変換し分離することを特徴とするシスチンの
製造方法である。

本発明においては、酸化の対象となる反応液は発酵、酵
素法で得られたシスティンを含む反応液なら全て使用で
き、例えば前記特公昭５７−７６３４で使用された２−
アミノ−チアリシン−４−カルボン酸（ＡＴＣ）を原料
としてシュードモナス属菌などのＬ−システィンを生産
する能力のある微生物を培養して得られた反応液なども
使用できるが、本発明においては、特にシスティン製造
工程由来の無機塩金星が比較的多い反応液に適用したほ
うが好ましい。

例えば、本出願人は先に、Ｌ−セリンを出発原料として
トリプトファンシンターゼの存在下、ＮａｐＳ　、　Ｎ
ａＨ５，Ｈａｓなどのスルフヒドリル基導入剤となる含
硫黄化合物を酵素反応させてＬ−システィンを得る方法
を見出し出願したが、この酵素反応で得られた反応液中
にはＮａＣＩ！、（ＮＨａ）　ｔｓＯａなどの無機塩が
含まれる。

本発明方法をこのような反応液に適用した場合、ジメチ
ルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）存在下の酸化に
おいては、イオン的反応機構によるものと推定されるた
めか、酸化反応系中に存在する塩の触媒的作用により反
応速度は増大する傾向となる。

本発明はこのように、ＤＭＳＯの存在下で、酵素法（以
下発酵法も含めて酵素法と呼称する。）で得られた反応
液中のシスティンをシスチンに酸化する方法であり、反
応は温和な条件下で進行するので反応組成には影響され
ない。したがって、システィン製造過程で生成する若干
のシスチンが含まれていてもよく、また培養由来の廃酵
素や廃菌体が反応液中に含まれていても差し支えない。

例えば、酵素反応終了後の酵素または酵素源の画体が存
在している段階でＤＭＳＯを添加して酸化反応を行いシ
スチンに転換後、廃酵素、廃菌体を除去してシスチンを
単離してもよい。

しかしながら前記した如く、本発明においては反応液中
の除菌方法はｐＨ４以下、好ましくはｐＨ１付近の酸性
下で吸着剤存在下反応液を熱処理して廃酵素、廃菌体を
フロック状に集菌して、これを活性炭などに吸着分離す
る方法が除菌効果は大きく好ましいので、このようにし
て反応液の除菌後、システィンを含む酸性水溶液にＤＭ
ＳＯを添加してシスチンに酸化させたほうがよい、また
本発明においてはｐＨの低下とともに反応速度は増大し
、酸性下での反応がシスチン収率も向上する。

ＤＭＳＯの使用量は、反応液中に含まれるシスティンに
対して０．２〜２．０倍モル程度で良く、さらに好まし
くは、０．５〜１．０倍モルが良好である。

反応を実施する温度は、５〜１００°Ｃの範囲であれば
特に特定されるものでない。

また本発明においては、強制的に酵素を供給する必要は
全くなく、ごく普通の密閉系容器で実施でき、Ｎ２雰囲
気下においてもなんら支障はない。

（作用効果） このように本発明においては、ＤＭＳＯの存在下で酸化
反応を行うことにより以下の利点を有する。

（１）、空気酸化、ＩＩｚＯｔ酸化などでは、触媒とし
てＦｅ１、Ｍｎ”　、Ｃｕ”″などの金属を添加しない
と適正な反応速度が得られないが、本方法においてはそ
の必要が全くない。

また空気酸化、Ｈ２０！酸化などはラジカル的な反応で
あるためシスチンで止まらずにシスティン酸などの分解
物まで進行し、シスチンとしての回収時にロスが多く、
酸化反応の制御に難があるが開ＳＯ存在下の酸化におい
ては、イオン的な反応であるため緩和な反応で、はぼ定
量的にシスティンからシスチンが得られる。また電解質
の無機塩が存在していれば酸化反応速度も増し、特に本
発明方法をＬ−セリンを原料としてトリプトファンシン
ターゼの存在下含硫黄化合物を酵素反応して得られたＬ
−システィン反応液に適用した場合著しい効果がある。

（２）３本発明では酸化されるシスティン水溶液はｐＨ
が低い程好ましいので、反応液萎酸性下にして活性炭に
よる除菌処理後のシスティン酸性水溶液を酸化させる場
合は、ｐＨ調整する必要もなくそのまま酸化反応が実施
できる。

などである。

本発明において、従来用いられていた空気酸化や０２０
□酸化に対し、ＤＭＳＯを用いた場合、特に強酸性下で
はシスティン酸゛などへの分解率が低く、顕著な効果が
あることを示せば、下表のとおりである。

なお、酸化試験には夫々Ｌ−システィン１０％水溶液の
モデル液を用い、Ｌ−システィンに対し開ＳＯ及びＨ，
Ｏ□は夫々０．７５倍モル、空気酸化の場合は空気は１
分間に溶液量の３倍量を通気し、夫々室温で８時間酸化
反応を行った。表中、上段の数字はシスティンの反応率
（酸化率）を示し、下段の数字はシスチン生成率（シス
チンへの選択率）を示す。

注）空気、及び１１□０．酸化の場合はＦｅＣ１゜を微
量添加して系中にＦｅ’＋イオンを共存させた。

以下、実施例によって本発明の詳細な説明する。

実施例中のシスティン及びシスチンの分析方法は以下の
ようにシスティンについては公知のガイトンデ（Ｇａｉ
ｔｏｎｄｅ）の方法によった。

すなわち、被検液約０．５ｇをサンプリングしてその正
確な量を秤量して、２ＮｌＩＣｊ！を加えて１０〜２０
倍に希釈する。さらに希釈液を蒸留水で１００倍程度に
希釈する。最終的に１　、０００〜２，０００倍の希釈
液を酸性ニンヒドリン試薬を用いて発色させ吸光度肝に
て５６０ｎｍの吸光度を測定する。一方、既知の濃度の
標準サンプルを作成しておき、５６０ｒｖの吸光度の検
量線を作成しておき、本検量線をもとに被検液中のシス
ティン濃度を算出する。

またシスチン分については、１，０００〜２，０００倍
に希釈した被検液に５μ門の１．４−ジチオトレイトー
ル（還元剤）約同量加えて、さらに２Ｎ　ＮａＯＨによ
りｐＨ８，０〜８．５とし、室温にて１時間放置して含
有するシスチンをすべてシスティンに還元し、システィ
ンとして上記方法により濃度を算出する。この方法によ
り得られた濃度から還元前のシスティン濃度を差し引く
ことによりシスチン濃度とする。

実施例 ３００　ｄｌ容撹拌付きのセパラブルフラスコにＬ−セ
リン２２．Ｏｗｔ、％を含有するし一セリン水溶液９１
ｇ（Ｌ−セリン０．１９モル）と水硫化ソーダ２水和物
（ＮａＳＨ・２８ｚＯ）　２１ｂ１ｇ（０，３８モル）
及び大腸菌エシェリヒア・コリ阿Ｔ−１０２４２（ＦＥ
Ｒ門ＢＰ−２０）を培養して得られたトリプトファンシ
ンターゼを菌体ごと１０ｇ（乾燥分２．２ｇ）を加え、
５％苛性ソーダ水溶液にてｐｌ＋７．５に調整し、さら
に水を加えて全容を２００ｄとした。３５°Ｃの恒温槽
に浸して、２４時間反応させた。

反応終了後、塩酸にてｐｌ＋を１．０として活性炭（式
日薬品　特製白すギ）５ｇを添加して８０°Ｃにて３０
分熱処理を付した。熱処理後８０’Ｃのままヌッチェに
て熱濾過を行い廃菌体を除去して処理後の反応濾液１８
８ｇを得た０本反応ｉＩｔ液中には、分析の結果Ｌ−シ
スティン換算２０．１ｇ（０，１６６モル）のし−シス
ティン及び２．０ｇ（０，００８モル）のし−シスチン
が含まれていた。Ｌ−セリンからＬ−システィン、Ｌ−
シスチンへの転換率は計９５．８％であった。

このように熱処理された反応液を、３００　ｍｌｌ容撹
拌付きセパラブルフラスコに移し、ＤＭＳＯ９，７ｇを
添加して、室温にて８時間撹拌し、Ｌ−シスチン結晶の
析出した溶液１９６．２ｇを得た。本溶液中には、Ｌ−
システィンが０．２ｇが残存していた。

本酸化反応溶液を、５％苛性ソーダ水溶液にてｐｌ（約
５まで中和して析出している結晶を濾過、乾燥し白色粉
状の結晶１９．８ｇ（０，１６５モルａｓ　１００％）
を得た。本島は、〔α）　”＝−２１８＠（Ｃ＝２．２
ＮＨＣｌ　）Ｆｅ分１０ｐｐ＋ｓ以下、純度９８．５％
以上であった。

なお回収率は、反応液中に存在するＬ−システィンとＬ
−シスチンとして、９５．０％が回収された。

また分解率は２％以内であった。

比較例 実施例と同様な反応方法で得られた反応液を、実施例と
同様にして熱処理後、５％苛性ソーダ水溶液でｐｌ＋約
５まで中和してから熱処理反応液を３００１ｄ容の実施
例に用いた同じセパラブルフラスコに移し、ＦｅＣｊ！
ｚ　０．２ｇを添加し、室温で空気を約２００　ｍ／分
速度で２４時間吹き込み、Ｌ−シスチン結晶が析出した
溶液２００．８ｇを得た。

本溶液中にはＬ−システィン４．２ｇが残存していた。

本酸化反応液から析出した結晶を濾過、乾燥し、白色粉
状の結晶１４．８ｇを得た０本品は〔α〕ル０＝−２１
５＠（Ｃ＝２．２Ｎ　ＨＣｆ　）　Ｆｅ　３０ｐｐｍ、
純度は９８．５％以上であった。なお回収率は反応液中
に存在するＬ−システィンとＬ−シスチンよりＬ−シス
チンとして７０．３％が回収された。また分解率は９゜
９％であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素法または発酵法で得られたシスティンを含む
   水溶液中のシスティンを、ジメチルスルホキシドの存在
   下、酸化することによりシスティンをシスチンに変換し
   分離することを特徴とするシスチンの製造方法。
2. （２）システィンを含む水溶液が、トリプトファンシン
   ターゼの存在下、Ｌ−セリンとスルフヒドリル基化合物
   との反応で得られたＬ−システィン水溶液である特許請
   求の範囲第（１）項記載の方法。
3. （３）システィンを含む水溶液のｐＨが１〜４の範囲の
   水溶液である特許請求の範囲第（１）項記載の方法。