CN100359013C

CN100359013C - 经过修饰的启动子

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Publication number: CN100359013C
Application number: CNB038099136A
Authority: CN
Inventors: 铃木哉子; 塚越规弘
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2002-03-01
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2008-01-02
Anticipated expiration: 2023-02-28
Also published as: EP1489175A1; US20050170453A1; US8648183B2; CA2478113A1; CN1650009A; AU2003211620A1; JP2003319786A; AU2003211620B8; AU2003211620B2; WO2003080830A1; EP1489175A4; JP4495904B2

Abstract

提供与启动子的表达调控相关的碱基序列。还提供以该碱基序列为基础进行启动子改变，而得到的具有高表达活性的经过修饰的启动子。即，将含CCAATNNNNNN(第1碱基序列)的第1DNA片段和含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列)的第2DNA片段插入到在丝状真菌中发挥作用的启动子中而得到的经过修饰的启动子。N为A腺嘌呤(adenine)、G鸟嘌呤(guanine)、C胞嘧啶(cytosine)、T胸腺嘧啶(thymine)。

Description

经过修饰的启动子

技术领域

本发明涉及用于蛋白质生产的启动子的改良。详细言之，涉及对在丝状真菌中发挥作用的启动子进行修饰而得到的经过修饰的启动子。还涉及利用该修饰了的启动子的蛋白质生成体系。

技术背景

曲霉属丝状真菌分泌大量的各种酶蛋白质到菌体外已经得到证实。例如，工业上利用的米曲霉，每1升培养液可生产数十g以上的酶蛋白质。以丝状真菌作宿主可大量分泌生产同种和异种蛋白质。另外，丝状真菌中有许多长久以来用于生产酿造品的菌株，从安全性考虑，可以说适于蛋白质生产。因此，近年有利用丝状真菌作为通过基因重组生产有用蛋白质的宿主的例子报道。生产分泌型蛋白质时，其生产量由从目的基因的表达、蛋白质的修饰、到其分泌过程中的各种各样的因素决定。增大蛋白质产量的最有效的手段就是提高蛋白质生产过程的第1阶段中目的基因的转录效率，即增加转录量。从该观点出发，到目前为止已经有多种丝状真菌来源的启动子被分离出来，将它们用于蛋白质的生产体系。例如，米曲霉的淀粉酶基因的启动子(例如参照专利文献1及非专利文献1)，黑曲霉的葡萄糖淀粉酶基因的启动子(参照非专利文献2)等已被分离、供于利用。

现状是：有几个象这样的启动子被利用，但与启动子相关的基因表达结构还不大明了。到目前为止，作为转录调控因子，仅有与基因的分解代谢产物阻抑调控有关的因子(参照非专利文献3)、广泛区域转录活化因子HAP复合体的结合因子(参照非专利文献4)、淀粉分解酶基因群的转录活化因子(参照非专利文献5)等被报道。因此，尝试应用丝状真菌高效生产有用的蛋白质，主要地通过经典的育种制备高生产菌，分离出天然存在的、更高表达的启动子。但是，这些尝试需要很多劳力、很大程度上依赖于偶然性，所以获得高表达启动子的可能性低。另一方面，若能改善启动子的表达调节能力，该问题就能很快解决。到目前为止，作为改善启动子表达调节力的尝试，有对米曲霉的α-葡萄糖糖苷酶基因的启动子进行改善等报道(参照专利文献2、非专利文献6)。但是，这些改变过的启动子可看到某种程度上表达调节力的增强，但很难说充分的表达活性就能使得蛋白质生产有效进行，期望开发出使目的蛋白质基因能更高效转录的启动子。

专利文献1：特开昭62-272988号公报

专利文献2：特开平9-9968号公报

非专利文献1：Biotechnology，5，368(1987)

非专利文献2：Biotechnology，6，1419(1988)

非专利文献3：Mol.Microbiol.，7，847-857(1993)

非专利文献4：Mol.Gen.Genet.，237，251-260(1993)

非专利文献5：Mol.Gen.Genet.，262，668-676(1999)

非专利文献6：Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，459-467(1998)

本发明是在以上背景下完成的，其目的是提供与启动子的表达调控相关的碱基序列。此外，本发明的目的是在该碱基序列的基础上对启动子进行修饰，提供具有高表达活性的经过修饰的启动子。再者，本发明的目的是应用该经过修饰的启动子以丝状真菌作宿主构建蛋白质的高效表达体系(生产体系)。

发明公开

鉴于上述目的，本发明者们进行了以下研究。即，从米曲霉的Taka淀粉酶A基因着手，已知该基因的启动子活性高，通过修饰该启动子而试图获得获得高转录活性的经过修饰的启动子。结果，发现了一组插入到启动子区域能增强其转录活性的序列。通过应用经该序列修饰过的启动子，可获得构巢曲霉的淀粉酶高生产株。再进行研究，整合了多拷贝具有经过修饰的启动子的淀粉酶基因的菌株，可观察到更有效的蛋白质生产。

由以上研究结果得到这样的发现：新发现的序列对启动子区域的改变极其有效，应用它可构建以丝状真菌为宿主的蛋白质高效表达体系。

另一方面，以淀粉酶的表达体系作模型，研究了用多个这样的序列对启动子进行修饰时的效果。结果表明，当用整合了多个这样序列的经过修饰的启动子时，即便以葡萄糖作碳源时也可很好地产生淀粉酶。即，野生株中通过培养基中的葡萄糖进行表达抑制(代谢分解抑制)时，若应用插入多个这样序列的经过修饰的启动子可解除这种代谢分解抑制。这提示，这种新发现的序列对封闭或解除与启动子活性抑制相关的机制有效。

另外，本发明者们关注了SRE具有的增强子功能，对此进行了各种突变，尝试对它进行改善，结果成功地获得了具有比SRE更优秀的增强子功能的序列。

本发明是基于以上研究结果而完成的，提供以下构成。

[1]一种经过修饰的启动子，它是将含CCAATNNNNNN(第1碱基序列：序列号1)的第1DNA片段和含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列：序列号2)的第2DNA片段插入到在丝状真菌中发挥作用的启动子中而得到的。

[2][1]中经过修饰的启动子，其中第1碱基序列为CCAATTAGAAG(序列号3)。

[3][1]或[2]中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGHNWWWWNWHGG(序列号4)。

[4][1]或[2]中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGWWWWWWWWHGG(序列号5)。

[5][1]或[2]中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGAAATTTAAAGG(序列号6)、CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAAC GG(序列号8)。

[6][1]-[5]任一项中经过修饰的启动子，其中第1DNA片段和第2DNA片段按从启动子5’末端到3’末端的方向顺次插入。

[7][6]中经过修饰的启动子，其中将第1DNA片段和第2DNA片段插入到启动子中存在的CCAAT序列的5’端上游区域，或启动子中存在的SRE区域的3’端下游区域。

[8][1]-[7]任一项中经过修饰的启动子，其中插入了多个第1DNA片段和多个第2DNA片段。

[9][8]中经过修饰的启动子，其中插入的第1DNA片段和第2DNA片段数目相同。

[10][9]中经过修饰的启动子，其中第1DNA片段和第2DNA片段的插入方式是：一个第1DNA片段和一个第2DNA片段配对，且各对中第1DNA片段插入到启动子的5’末端。

[11]一种经过修饰的启动子，它是将1至数个具有增强子功能的DNA片段整合到在丝状真菌中发挥作用的启动子中而得到的，其DNA片段是具有序列号9中碱基序列的DNA片段，或是对该DNA片段进行了部分修饰的DNA片段。

[12][1]-[11]任一项中经过修饰的启动子，其中在丝状真菌中发挥作用的启动子是米曲霉淀粉酶的启动子。

[13]一种具有增强子功能的DNA片段，它由CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAAC GG(序列号8)的碱基序列构成。

[14]一种经过修饰的启动子，它在丝状真菌中发挥作用，且含有[13]中的DNA片段。

[15]一种载体，它整合了[1]-[12]、[14]任一项中经过修饰的启动子。

[16]一种载体，它整合了[1]-[12]、[14]任一项中经过修饰的启动子，还整合了目的蛋白质的结构基因，该基因受经过修饰的启动子的调控。

[17]一种丝状真菌的转化体，它持有[16]的载体，能表达上述结构基因。

[18]一种丝状真菌，它持有[1]-[12]、[14]任一项中经过修饰的启动子和编码目的蛋白质、受经过修饰的启动子调控的结构基因。

[19]一种蛋白质的生产方法，其特征在于，在可能产生上述蛋白质的条件下培养[18]中的丝状真菌，回收所产生的蛋白质。

附图简述

图1表示Kata淀粉酶A基因(米曲霉)启动子区域的序列。

图2表示Kata淀粉酶A基因(米曲霉)启动子区域的模式图，图中示出转录调控因子结合序列(CCAAT序列，SRE)的位置和导入突变的部位。用下划线表示经位点特异性突变而导入的限制性酶切位点。CCAAT表示CCAAT序列(广域转录活化因子(HAP复合体)的结合因子)，SRE表示淀粉分解酶基因群的转录活化因子(AmyR)的结合因子，TATA表示TATA盒，+1表示转录起始点。

图3表示实施例4中启动子活性评价所用质粒的制备过程。

图4表示实施例6中淀粉酶活性测定结果的总结表。表的左边表示各个经过修饰的启动子中CCAAT序列或SRE的插入位置的模式图。用点线围起的部分是插入片段。Taap代表野生型启动子，PCCAATb代表插入了CCAAT序列的经过修饰的启动子，PSREb代表插入了SRE的经过修饰的启动子，PCSP代表插入了CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子。

图5表示实施例7和8中淀粉酶活性测定结果的总结表。上半部分表示各个经过修饰的启动子中CCAAT-SRE片段的插入位置的模式图。用点线围起的部分是插入片段。Taap代表野生型启动子，PCSb及PCSP表示插入了一个CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子，PCSPb表示插入了三个CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子。

图6表示实施例10中淀粉酶活性测定结果的总结表。表的左边表示各个经过修饰的启动子中CCAAT-mSRE的插入位置的模式图。用点线围起的部分是插入片段。Taap代表野生型启动子。此外，PcmSa、PCmSN、PCmSb、PCmSS分别表示将一个CCAAT-SRE片段插入到不同位置的经过修饰的启动子。

图7表示用SPY培养基将实施例11中获得的各转化体培养5天时，淀粉酶产量的总结表。ABPU1表示所使用的宿主，taa2表示具有野生型启动子的菌株。淀粉酶产量用TaKa淀粉酶的比活性为100U/mg时的换算值表示。

图8是实施例12中淀粉酶产量测定结果的总结表，它表示用各种各样的碳源培养具有经过修饰的启动子的菌株5天时的淀粉酶产量。淀粉酶产量用TaKa淀粉酶的比活性为100U/mg时的换算值表示。

图9表示实施例13中淀粉酶活性测定结果的总结表。表的左边表示各个经过修饰的启动子中CCAAT-mSRE片段或sCCAAT-mSRE片段的插入位置的模式图。用点线围起的部分是插入片段。taap代表野生型启动子，PCmSb表示插入了CCAAT-mSRE片段的经过修饰的启动子，PsCmSb表示插入了sCCAAT-mSRE片段的经过修饰的启动子。

图10表示实施例14中淀粉酶活性测定结果的总结表。表的左边表示各个经过修饰的启动子中SRE部分的序列。taaP代表野生型启动子。taaS中，从5’末端开始的第12位的碱基被置换。同样，MSRE2中从5’末端开始的第12-14位的碱基被置换。

图11表示实施例15及16中淀粉酶活性测定结果的总结表。非重组株表示未进行转化的菌株，PCSPb表示具有插入了两个CCAAT-SRE片段的启动子的菌株。

图12表示实施例17及18中漆酶活性测定结果的总结表。非重组株表示未进行转化的菌株，PCSPb表示具有插入了两个CCAAT-SRE片段的启动子的菌株，PCSPPb表示具有插入了三个CCAAT-SRE片段的启动子的菌株。

实施发明的最佳状态

以下对本发明进行详细说明。需要指出的是，本发明中能提高启动子活性的功能叫做“增强子功能”。

首先，本发明者们注意到曲霉属中广泛保守的启动子区域的CCAAT序列(序列号3)和SRE(序列号6)，观察了它们外源性插入到启动子区域时对启动子活性的影响。首先，构建了含米曲霉JCM02239株TaKa淀粉酶A基因的启动子区域的质粒。另一方面，分别获得了含CCAAT序列的DNA片段和包含SRE序列的DNA片段。然后，将各DNA片段分别单独插入到上述质粒的启动子区域，构建了经过修饰的启动子。接下来制备包含各经过修饰的启动子和TaKa淀粉酶A基因的编码区域的质粒。用所得各质粒分别转化构巢曲霉，比较各转化体的淀粉酶活性。结果，具有插入了CCAAT序列或SRE序列的经过修饰的启动子的转化体的淀粉酶活性比具有未经修饰的启动子的转化体的活性低，或几乎无差异。另外，对插入多个CCAAT序列或多个SRE进行启动子修饰时也进行了研究，同样未观察到启动子活性的上升。从以上结果可以预测，即便将CCAAT序列或SRE单独插入到启动子区域中进行修饰，不能增强启动子活性。

因此，接下来对联合应用CCAAT序列和SRE序列对启动子进行修饰时启动子活性的变化进行了研究。首先，以米曲霉JCM02269株的TaKa淀粉酶A基因的启动子区域为模板制备包含CCAAT序列和SRE序列的DNA片段(CCAAT-SRE片段：序列号9)。用该DNA片段，用与上面同样的方法制备TaKa淀粉酶A基因的经修饰的启动子。然后，构建包含该经过修饰的启动子和TaKa淀粉酶A基因的编码区域的质粒。用该质粒获得构巢曲霉的转化株。测定该转化株的淀粉酶活性时，与具有未经修饰的启动子的转化株(野生菌株)相比，可见到显著的启动子活性的上升。由此可以判断，通过将CCAAT序列和SRE一并插入到启动子区域，可制备具有高活性的经过修饰的启动子。

这里，通常，即便置换了DNA序列的一部分碱基，有时仍能维持该DNA序列具有的功能。已知CCAAT序列是广域转录活化因子(HAP)的结合因子，有报道说5’末端的序列CCAAT对这种结合很重要。由此，预想即便置换5’末端CCAAT以外的序列也能维持CCAAT序列所具有的增强子功能。

另一方面，本发明者们研究了置换部分碱基时是否能维持SRE的增强子功能。首先，用为部分置换SRE而设计的引物进行PCR，获得包含TaKa淀粉酶A基因启动子区域的CCAAT序列及部分碱基被置换了的SRE(CGGAATTTAAACGG，序列号7)的DNA片段。然后，用与上面同样的方法插入该DNA片段，制备成经过修饰的启动子，接着获得构巢曲霉的转化株，该菌株整合了具有经过修饰的启动子的TaKa淀粉酶A基因。测定该转化株中的淀粉酶活性，结果可以看到与用上述CCAAT-SRE片段进行修饰时几乎同样的淀粉酶活性的上升。该结果提示，即便对SRE的部分碱基进行置换，某些情况下仍能维持其增强子功能。特别是，即便5’末端的第6位、第9位和第12位碱基置换成其它碱基时，SRE的增强子功能几乎不受影响。

得到以上结果后，为了确定对SRE发挥增强子功能很重要的部分(序列)，对野生型启动子中存在的SRE进行了突变，制备出经过修饰的启动子，并检测其启动子活性。结果，观察到这样的现象：当SRE5’末端的第12位碱基置换成C时，SRE具有的增强子功能不仅能维持，而且被增强。从该结果可以判断，即便5’末端的第12位碱基被置换也能维持SRE的增强子功能，以及SRE5’末端的第12位碱基为C的序列(CGGAAATTTAACGG，序列号8)具有比SRE更好的增强子功能。

另一方面，将5’末端的第13位、第14位碱基置换成其它碱基时，其活性比野生型启动子的活性低。考虑到该结果以及已知的该部分序列在曲霉属中广泛保守这一事实，我们认为希望这些碱基不要置换成其它碱基。另外，已知SRE5’末端的CGG在曲霉属中也广泛保守，所以认为希望这些碱基不要置换成其它碱基。

另一方面，曲霉属的野生株中，已知SRE的序列为CGGTCTTTTGTCGG(构巢曲霉的α-葡萄糖苷酶)及CGGCGAATTCACGG(米曲霉的葡糖淀粉酶)，没有这些野生株中启动子活性低下的报道。将这些序列与米曲霉TaKa淀粉酶基因的启动子中存在的SRE进行比较的话，5’末端的第4、5、7、10、11位的碱基不相同，由此认为这些碱基对SRE具有的增强子功能的参与程度低。也就是说，即便将这些碱基置换成其它碱基，维持SRE具有的增强子功能的可能性也高。具体而言，5’末端的第4位碱基为T或C、第5位碱基为C或G、第7位碱基为A、第10位碱基为G或C、第11位碱基为T时具有增强子功能。但是，考虑到单个碱基的结构引起的结合性等，期望5’末端第6-9位碱基及第11位的碱基，更优选5’末端第4位-11位的碱基为A或T。

基于以上发现和考察，用于修饰本发明启动子区域的第1DNA片段的碱基序列优选为CCAATTAGAAG(序列号3)。其它方面，第2DNA片段的碱基序列优选为CGGHNWWWWNWHGG(序列号4)，更优选CGGWWWWWWWWHGG(序列号5)，更优选CGGAAATTTAAAGG(序列号6)、CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAACGG(序列号8)。这里，碱基序列中N代表A腺嘌呤(adenine)、G鸟嘌呤(guanine)、C胞嘧啶(cytosine)或T胸腺嘧啶(thymine)，W代表A腺嘌呤(adenine)或T胸腺嘧啶(thymine)，H代表A腺嘌呤(adenine)、C胞嘧啶(cytosine)或T胸腺嘧啶(thymine)。

另外，如上所述，SRE5’末端第12位碱基置换成C时所得序列，其自身即具有比SRE更好的增强子功能，所以可以说可仅用该序列进行启动子的修饰。也就是说，该序列(CGGAAATTTAACGG：序列号8)对启动子的修饰有用，单独利用该序列可构建高活性的启动子。另外，当上述序列CGGAATTTAAACGG(序列号7)与CCAAT序列同时应用时的结果，可看到与野生型SRE同等的增强子功能，由此预想该序列也可单独用于启动子活性的增强。这里所讲“用于”包括部分置换野生型启动子(包括已经实施了其它修饰的)中原来存在的SRE而构建的上述序列，及将上述DNA片段插入到野生型启动子(包括已经实施了其它修饰的)中。另外，这里所讲“单独”是指不与上述第1DNA片段同时应用。

另一方面，本发明者们研究了插入CCAAT-SRE片段对启动子区域进行修饰与代谢分解抑制间的关系。首先，制备插入了1拷贝CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子、插入了2拷贝和3拷贝CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子。然后分别获得插入了代谢分解抑制基因的转化体，该基因中包含未实施修饰的启动子或经过修饰的启动子中的任一种，用含以葡萄糖作碳源的培养基进行培养，比较菌体的淀粉酶活性。结果观察到，具有未实施修饰的启动子的菌体，其代谢分解受到抑制淀粉酶活性低下；但具有插入了CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子的菌体，其代谢分解受到抑制的程度降低，其淀粉酶活性是具有未实施修饰的启动子的菌体的37倍以上。基于以上发现，从获得解除代谢分解抑制效果出发，优选插入多个CCAAT片段和SRE片段对启动子实施修饰。

本发明的第1DNA片段和第2DNA片段，可以例如用商业化的DNA合成仪合成。另外，例如，可以通过以米曲霉的TaKa淀粉酶A基因的启动子区域为模板，应用适当的引物进行PCR而制备。

另外，也可制备一个包含第1DNA片段和第2DNA片段的DNA片段，将它整合到在丝状真菌中发挥作用的启动子中，由此制备本发明的经过修饰的启动子。例如，从曲霉属等的启动子中选择包括与第1DNA片段和第2DNA片段相对应序列的启动子，以它为模板，通过PCR等方法制备这样的DNA片段。可用作模板的适宜的启动子的例子包括米曲霉的TaKa淀粉酶A基因的启动子(序列号12)。序列号9中显示了本发明中用于启动子修饰的DNA片段的碱基序列的一个例。该DNA片段(CCAAT-SRE片段)是米曲霉的TaKa淀粉酶A基因中启动子区域的一部分(240-367位(以转录起始点为+1对相当于-312～-185位))。需要指出的是，即便是该DNA片段中实施了部分修饰的DNA片段，只要具有增强整合了该片段的启动子活性的功能(增强子功能)，即可用于启动子区域的修饰。这里，部分改变是指构成DNA片段的部分碱基被置换、缺失，或添加或插入了1-数个碱基。这样修饰的所允许的程度因被修饰的DNA片段上的部位而异。如上所述，由于对增强子功能重要的部分是与第1DNA片段及第2DNA片段相对应的序列部分，所以优选该序列部分的修饰程度要小。其它方面，由于预测其它部分与增强子功能不直接相关，所以认为可进行比较大的修饰。例如，可进行1～20个，优选1～10个，更优选1～5个碱基的置换、缺失、附加等。需要指出的是，这些修饰中包括向5’末端、3’末端或其它部位导入限制性酶识别的序列和添加编码信号肽的序列等。

本发明中，向在丝状真菌中发挥功能的启动子中插入第1DNA片段和第2DNA片段(以下，将这些DNA片段及包含它们的DNA片段一并称作“具有增强子功能的DNA片段”)，构建经过修饰的启动子，对这些DNA片段的插入部位无特殊限制。但是，采用具有CCAAT序列和SRE的启动子作为被实施修饰的启动子时，优选插入到这两个序列间以外的部位。也就是说，优选将具有增强子功能的DNA片段插入到CCAAT序列5’末端侧的部位或SRE3’末端侧的部位。

可通过向在丝状真菌中发挥功能的启动子中插入多个第1DNA片段和多个第2DNA片段构建本发明的经过修饰的启动子。该情况下，优选所使用的第1DNA片段和第2DNA片段的个数相同。另外，优选一个第1DNA片段和一个第2DNA片段配对，且各对中第1DNA片段插入到启动子的5’末端。

应用包含第1DNA片段和第2DNA片段的DNA片段时，也可插入多个，从而进行启动子修饰。该情况下，采用具有CCAAT序列和SRE的启动子作为被实施修饰的启动子时，优选将该DNA片段插入到这两个序列间以外的部位。

通过整合多个具有增强子功能的DNA片段对启动子进行修饰，可期待启动子活性进一步提高。此时整合的DNA片段的数目优选2个而非1个，更优选3个而非2个。另外，如后面的实施例所述，通过插入DNA片段(显示产生淀粉酶时对解除代谢分解抑制有效)，可能封闭乃至解除发挥启动子活性抑制作用的机制。

作为本发明中在丝状真菌中发挥作用的启动子，对其种类无特殊限制，只要具有在丝状真菌中发挥作用的性质即可。例如，可包括曲霉属、青霉素属、木霉属等微生物中编码蛋白质的基因的启动子。具体而言，可应用曲霉属的编码α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等的基因的启动子。其中，优选应用米曲霉的TaKa淀粉酶的启动子。可用限制性酶处理、PCR法等遗传工程学技术从含有这些启动子的微生物中获得。另外，当利用整合了目的启动子的载体时，可通过限制性酶处理、PCR法等方法从该载体中获得。需要指出的是，本发明中丝状真菌意味着广义的丝状真菌，包括酵母在内。

本发明提供整合了上述经过修饰的启动子的载体。这些载体可用于目的蛋白质的生产。例如，在经过修饰的启动子的控制下导入目的蛋白质的结构基因，构建成表达用载体。用它转化适当的宿主，在可生产该蛋白质的条件下培养适当导入了经过修饰的启动子和目的蛋白质的结构基因的转化体。其后，从培养液或菌体内回收目的蛋白质。需要指出的是，本发明中所讲整合了经过修饰的启动子的载体中包括整合了在经过修饰的启动子的调控下的特定蛋白质的结构基因的载体。

本发明中的载体，优选具有选择标记，在转化宿主丝状真菌时该标记适于筛选转化体。根据与所使用的宿主的关系，可适当采用选择标记，例如鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因(argB)、硝酸还原酶基因(niaD)、乙酰胺酶基因(amdS)、色氨酸合成酶基因(trpC)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)等营养要求性互补基因，寡霉素越霉素、潮霉素等的耐药性基因等。

作为用于蛋白质生产的宿主可应用分类为曲霉属(米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉)、青霉素属、木霉属、根霉属等的丝状真菌。优选应用曲霉属的丝状真菌。从安全性考虑，其中优选米曲霉和黑曲霉。

另外，为了检测导入了经过修饰的启动子的丝状真菌不仅产生原本产生的蛋白质(同种蛋白质)，而且可产生导入了本发明的经修饰的启动子的丝状菌。本来不产生的蛋白质，即通过外源性导入编码该蛋白的基因后开始产生的蛋白质(异种蛋白质)均高效表达，本发明者们用米曲霉的淀粉酶基因转化宿主米曲霉，得到转化体，再用系统分类学上离米曲霉较远的丝状真菌的漆酶基因进行转化，验证了蛋白质水平的表达。

利用本发明的经过修饰的启动子可生产的蛋白质无特殊限制，例如，包括α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、纤维素酶、果胶酶等糖相关的酶，漆酶、过氧化物酶等氧化还原酶，凝乳酶等蛋白酶，脂酶等。另外可以是同种蛋白质，也可是异种蛋白质。

本发明的载体向宿主的导入可用众所周知的方法进行。例如，通过应用原生质体化菌体的Turner等方法(Gene，36，321-331(1985))进行。此外，可采用五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))等。

通过在结构基因可能表达的条件下培养适当导入了本发明的经过修饰的启动子和目的蛋白质结构基因的转化体，可产生出目的蛋白质。培养过程中应用的培养基可根据使用的宿主进行适当的选择。例如，可应用商品化的各种培养基，或者向其中添加了精氨酸、尿嘧啶核苷等促进转化体繁殖、选择、蛋白质表达等必要成分的培养基等。

按期望的时间进行培养后，可从培养液或菌体中回收目的蛋白质。即，若是分泌型蛋白质则从培养液中回收，除此之外则从菌体回收。从培养液中回收时，例如过滤培养上清，离心除去不溶物后，可通过硫酸铵沉淀等盐析、联合各种色谱进行分离、纯化等获得目的蛋白质。另一方面，从菌体回收时，例如，通过对菌体进行加压处理、超声波处理等使其破碎后，可与上面同样进行分离、纯化，从而获得目的蛋白质。需要指出的是，通过过滤、离心等预先从培养液回收菌体后，也可进行上述一系列过程(菌体的破碎、分离、纯化)。

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于这些实施例。本实施例中，除特殊说明之外，限制性酶及其它基因操作过程中应用的酶应用宝酒造或东洋纺织的产品。酶的反应条件等按附加的说明书进行。

另外，本实施例中使用的合成寡DNA，使用宝酒造或Invitrogen合成的，碱基序列的测定用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(AppliedBiosystems)进行，PCR反应应用Thermal Cycler(PerkinElmerJanpan)进行。

[实施例1]启动子区域的亚克隆

以含米曲霉JCM02239株的TaKa淀粉酶A基因(taaG2)3164bp[Gene，84，319-327(1989)]的pTG-taa[Mol.Gene.Genet.，254，119-126(1997)]为出发材料，制备TaKa淀粉酶A基因启动子区域和TaKa淀粉酶A基因的编码区域。

首先，从pTG-taa获得包含TaKa淀粉酶A(taaG2)启动子区域的750bp的EcoRI-SalI片段，将该片段插入到质粒pKF18K(东洋纺织株式会社)的多克隆位点的EcoRI-SalI部位，获得含TaKa淀粉酶启动子的质粒pKF-taaP。用该质粒进行向启动子区域导入突变的操作，及修饰启动子区域的构建。

[实施例2]含转录调控因子结合序列的DNA片段的获得

如下获得含已经报道的广域转录活化因子(HAP)的结合因子CCAAT序列[Mol.Gene.Genet.，237，251-260(1993)]和淀粉分解酶基因群的转录活化因子(AmyR)的结合因子SRE[Mol.Gene.Genet.，262，668-676(1999)]的片段。

首先，合成XNF(5’-CCGCTCGAGGCACCATCCAATTAGAAGCGCGGCCGCTAAACTAT-3’，序列号13)和XWF的互补链XNR(5’-ATAGTTTAGCGGCCGCGCTTCTAATTGGATGGTGCCTCGAGCGG-3’，序列号14)，XNF是CCAAT序列的5’末端添加了XhoI位点、3’末端添加了NotI位点的DNA。然后混合这些合成的DNA的互补链，98℃加热10分钟后，经2小时冷却到30℃，其后冷却到4℃退火，获得单含CCAAT序列的DNA片段。

另一方面，合成SREf(5’-GACTAGTTAACCTAGGGGCGGAAATTTAACGGGATGTTAACTAGTC-3’，序列号15)和其互补链SREr(5’-GACTAGTTAACATCCCGTTAAATTTCGCCCCCTAGGTTAACTAGTC-3’，序列号16)，SREf为SRE的5’末端和3’末端添加了SpeI位点和HincII位点的合成DNA，用与上面同样的方法获得单含SRE的DNA片段。以后将这里制备的仅含CCAAT序列的DNA片段叫做“CCAAT片段”，仅含SRE的DNA片段叫做“SRE片段”。

接下来，应用以下引物和在实施例1中制备的pKF-taaP作模板，以94℃30秒、54℃30秒、72℃1分30秒为1个循环，通过30个循环的PCR获得含从CCAAT序列到SRE区域的DNA片段。需要指出的是，制备出含PstI位点的片段(序列号10，以下叫做“CCAAT-SRE(PstI)片段”)和含XhoI-NotI位点的片段(序列号11，以下叫做“CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段”)2种。

添PstI位点的上游引物：

CSPf：5’-AAACTGCAGACCACCTCTAGGCATCGGACG-3’(序列号17)

添加PstI位点的下游引物：

CSPr：5’-TTTCTGCAGTGTTGA TTTGTGGTTGAGTGG-3’(序列号18)

添加XhoI位点的上游引物：

CSXf：5’-CGGCTCGAGGCATCGGACGCACCATCC-3’(序列号19)

添加NotI位点的下游引物：

CSNr：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCCGACTGTGATTTGTGGTTGAGTGG-3’(序列号20)

[实施例3]含经过修饰的启动子的质粒的构建

给TaKa淀粉酶A基因的启动子区域导入突变如下进行。首先，为了给实施例1中制备的pKF-taaP导入修饰启动子区域用的限制性酶位点，用以下所示的引物和Mutan-Super Express Km Kit(TAKARA)对pKF-taaP进行位点特异性突变的导入。需要指出的是，野生型启动子的序列(序列号12)示于图1，导入的限制性酶位点的位置示于图2。

向下游区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置465)导入NotI位点时用的引物：

Not-b：5’-CGCTTGGATTCCCCGCCCGCGGCCGCAGAGCTTAAAGTATGTCCC-3’(序列号21)

向下游区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置440)导入XhoI位点时用的引物：

Xho-b：5’-GAATGCATTTAAACTCTTCCTCGAGTCGCTTGGATTCCCCGCCC-3’(序列号22)

向上游区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置153)导入NotI位点时用的引物：

Not-a：5’-GTAGTAAAACCCCGGAGTCAGCGGCCGCCAAGCCCAAGTCCTTCACG-3’(序列号23)

向上游区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置128)导入XhoI位点时用的引物：

Xho-a：5’-CGTCAAGGGATGCAAGACTCGAGTAGTAAAACCCCGGAGTC-3’(序列号24)

向CCAAT序列与SRE间的区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置252)导入NotI位点时用的引物：

Not：5’-GCACCATCCAATTAGAAGCGCCCGCGAAACAGCCCAAGAAAAAGG-3’(序列号25)

向下游区域(序列号12中所示TaKa淀粉酶启动子的存在位置490)导入SpeI位点时所用引物：

STATA：5’-TAAAGTATGTCACTAGTCGATGCGAT-3’(序列号26)

接下来用XhoI和NotI酶切实施例2中制备的CCAAT片段，通过琼脂糖凝胶电泳进行回收、纯化。将所得DNA片段插入到如上导入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制备出含经过修饰的启动子PCCAATb的质粒pKF-CCAATb。同样，用HincII酶切实施例2中制备的SRE片段，将所得DNA片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制备出含经过修饰的启动子PSREb的质粒pKF-SREb；用PstI酶切实施例2中制备的CCAAT-SRE(PstI)片段，将所得DNA片段插入到启动子下游区域的PstI位点，制备出含经过修饰的启动子PCSP的质粒pKF-PCSP；用XhoI、NotI酶切实施例2中制备的CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段，将所得DNA片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制备出含经过修饰的启动子PCSb的质粒pKF-PCSb。另外，用XhoI、NotI酶切CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段，将回收、纯化的片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，其后通过将CCAAT-SRE(PstI)片段插入到PstI位点，制备含经过修饰的启动子PCSPb的质粒pKF-PCSPb，其中PCSPb中插入了2个CCAAT-SRE片段。

[实施例4]构建启动子活性评价时用的质粒

启动子活性评价用质粒的制作过程示于图3。首先，用SalI消化质粒pUC18(东洋纺织株式会社)后，通过Klenow处理使其末端平滑化，通过自身连接获得SalI位点缺失的质粒pUC18(S-)。另一方面，从质粒pTG-taa分离出TaKa淀粉酶A基因的EcoRI片段，将该片段插入到pUC18(S-)的多克隆位点的EcoRI位点，获得pUC-taa(S-)。用EcoRI部分分解该质粒pUC-taa(S-)，获得taaG2基因的3’末端EcoRI位点缺失的质粒pUC-taa。同样，获得从pBluescriptII KS(+)获得缺失了XhoI、SalI、BamHI的质粒pBlue(XSE-)。

接下来，从pUC-taa分离出含taaG 2的EcoRI-HindIII片段，将该片段插入到质粒pBlue(XSE-)的多克隆位点的EcoRI-HindIII位点，获得含taaG2的质粒pBlue-taa。

然后，从实施例3中得到的含经过修饰的启动子的质粒pKF-taaPM系列(pKF-CCAATb、pKF-SREb、pKF-PCSP、或pKF-PCSPb)中分离出经过修饰的启动子区域的EcoRI-SalI片段，插入到质粒pBlue-taa的多克隆位点的EcoRI-SalI中，获得经过修饰的启动子与taaG 2基因连接的质粒pBlue-taaM。从pBlue-taaM分离出含经过修饰的启动子的taaG 2基因的Xbal-BamHI片段，整合到质粒pBAR7(pBluescriptII KS(+)中插入了构巢曲霉来源的C末端缺失的argB基因的质粒)的多克隆位点Xbal-BamHI中，作为启动子活性测定用的质粒pBAR-taaM系列(pBAR-CCAATb、pBAR-SREb、pBAR-PCSP、pBAR-PCSb及pBAR-PCSPb)。

[实施例5]具有经过修饰的启动子的转化体的获得

1. 转化

如下进行丝状真菌的转化。首先，用EcoRV消化实施例4中得到的pBAR-taaM系列(pBAR-CCAATb、pBAR-SREb、pBAR-PCSP、pBAR-PCSb及pBAR-PCSPb)的质粒后，进行酚/氯仿抽提及乙醇沉淀，用纯化的质粒进行转化。

其次，用这些质粒进行构巢曲霉的转化。用向完全培养基(2％麦芽提取物，2％葡萄糖和0.1％Bacto-蛋白胨)中添加了必要营养源(精氨酸、尿苷、维生素B6和生物素)的培养基，37℃、振荡培养一晚构巢曲霉的鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因缺失株ABPU1株(biAl，pyrG89，wA3，argB2，pyroA4)后，将所得菌体悬浮到细胞壁溶解液[20mg/ml Yatalase(宝酒造)，0.8M NaCl，10mM磷酸缓冲液(pH6.0)]中，30℃缓慢振荡1～2小时使其原生质体化。用尼龙膜过滤，除去残存的菌体。然后用该原生质体，根据Turner等的方法[Gene，36，321-331(1985)]进行活性细胞的制备和转化，用不含精氨酸的培养基(Czapek-Dox琼脂培养基(0.2％NaNO₃，0.1％K₂HPO₄，0.05％KCl，0.05％MgSO₄·7H₂O，2％葡萄糖(pH5.5))中添加了尿苷、维生素B6和生物素的培养基)获得可生长发育的转化体，每种质粒20-40株。

2.通过Southern Blotting选择转化体

从各转化株中如下制备染色体DNA。首先，用向完全培养基中添加了必要营养源(尿苷、维生素B6和生物素)的培养基，37℃、振荡培养一晚转化株后，用Buchner漏斗和No.2滤纸(Advantech)过滤收集得到的菌体，用无菌水洗涤。去除多余的水分后，-80℃冻存，用FREEZONE(LABCONCO)进行冷冻干燥。干燥后，加入1mm的玻璃珠，用Multi-Beads Shoker(安井器械社)2000rpm破碎5分钟，使其成微粉末状，向该菌体破碎物中加入提取溶液[1％十六烷基甲基溴化铵，0.7M NaCl，50mM Tris-HCl，10mM EDTA，1％β-巯基乙醇]，搅拌后，室温放置30分钟。用酚/氯仿抽提所得溶菌液，除去杂蛋白后，加入等量的异丙醇，沉淀DNA。将该沉淀物溶解到含0.1mg/ml RNase的TE溶液中，37℃、反应30分钟后，再加入含0.2mg/ml蛋白酶K的TE溶液，37℃、反应30分钟。用酚/氯仿抽提该溶液后，用2.5倍体积的冷乙醇沉淀。用70％乙醇洗涤沉淀物，干燥后溶解到TE溶液中，作为染色体DNA溶液。

Southern Blotting检测：用PvuII或EcoRV消化染色体DNA后，用琼脂糖凝胶电泳分离，印迹到尼龙膜(Roche)上后，以taaG2的大约1000bp的BglII-SmaI消化物作探针进行检测。此时，用DIG核酸检测试剂盒(Roche)进行探针的标记和信号检测。

根据Southern分析的结果任意地选择2株以上适于启动子活性测定的转化体，即选择在argB座位同源整合了1拷贝质粒的转化株，测定启动子活性时不受整合到染色体时的位置影响，也不受导入的基因的拷贝数影响的转化体。

[实施例6]转化体的淀粉酶活性测定及经过修饰的启动子的活性评价

用实施例5中得到的整合了pBAR-CCAATb或pBAR-SREb的各转化体，评价单独插入CCAAT序列或SRE进行修饰时启动子活性的变化。另外，用整合了pBAR-PCSP的转化体同样评价同时插入CCAAT序列和SRE时启动子活性的变化。首先，将各转化体放射状接种到向基本培养基(0.9％NaNO₃，0.05％KCl，0.15％KH₂PO₄，0.15％痕量元素，0.05％MgSO₄·7H₂O，1％葡萄糖pH(6.5))中添加了必要营养成分(尿苷、维生素B6和生物素)的琼脂培养基中，37℃培养3天后，从琼脂培养基上把分生孢子悬浮到孢子悬浮溶液(0.01％tween80，0.8％NaCl)中，用海绵过滤，制备成孢子悬浮液。从孢子悬浮液中，将1×10⁸个分生孢子接种到100ml SP培养基(1％淀粉，1％多聚蛋白胨，0.5％KH₂PO₄，0.1％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH(6.5))中，该培养基中添加了除精氨酸以外的必要营养成分(尿苷、维生素B6和生物素)，37℃振荡培养36小时后，用Buchner漏斗和滤纸分离菌体与上清，上清作为酶溶液。

淀粉酶的活性测定是：向20mM醋酸钠缓冲液、10mM CaCl₂、2％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)中加入酶溶液，制备150μl的反应体系，37℃反应20分钟，用Nelson-Somogy法对所生成的还原糖量进行定量。另外，以1分钟内释放1μmol葡萄糖的酶量作为1U。以如上测定的淀粉酶活性为指标，对野生型启动子和经过修饰的启动子进行启动子活性评价。

淀粉酶活性的测定结果示于图4的表中。该表表明：与野生型启动子(taaP)相比，插入了CCAAT序列或SRE的经过修饰的启动子(PCCAATb及PSREb)的活性降低，或者几乎无差异，单独插入CCAAT序列或SRE，未观察到启动子活性上升的效果。另外，分别插入多个这样的片段时，同样未观察到启动子活性上升的效果(未显示数据)。由这些结果，考虑该启动子已经是高度优化的启动子，通过导入突变而对启动子结构造成的负面影响比插入CCAAT序列和SRE更显著。

其它方面，与野生型启动子(taaP)相比，同时插入CCAAT序列和SRE的经过修饰的启动子(PCSP)活性显著上升，可看到约4倍的淀粉酶活性。通过以上结果，可以说同时插入CCAAT序列和SRE对增强启动子活性很重要。

[实施例7]插入多个CCAAT序列和SRE对启动子进行修饰时的效果

接下来，在启动子区域插入1拷贝、2拷贝、3拷贝的CCAAT-SRE片段，检测用这样的启动子时淀粉酶产量的增加效果。为了检测在启动子区域最多插入3个CCAAT-SRE片段时(起始点1+插入的片段3＝4)对启动子活性的效果，制备质粒pKF-PCSPPb。它是将实施例2中获得的CCAAT-SRE(PstI)片段(序列号10)插入到实施例3中获得的pKF-PCSPb的PstI位点获得的。用该质粒，按实施例4制备测定启动子活性用的质粒pBAR-CSPPb，按实施例5获得整合了pBAR-CSPPb的转化体。用与实施例6同样的方法，制备该转化体的孢子悬浮液。从孢子悬浮液中，将1×10⁸个分生孢子接种到100ml SP培养基(1％淀粉，1％多聚蛋白胨，0.5％KH2PO4，0.1％NaNO3，0.05％MgSO4-7H2O，pH(6.5))中，该培养基中添加了除精氨酸以外的必要营养成分(尿苷、维生素B6和生物素)，37℃振荡培养40小时后，按照实施例6测定淀粉酶活性。测定整合了质粒pBAR-taa的转化体、整合了质粒pBAR-CSb的转化体和整合了质粒pBAR-CSPb的转化体的淀粉酶活性，进行比较。其中质粒pBAR-taa具有野生型启动子，质粒pBAR-CSb具有插入了一个CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子，质粒pBAR-CSPb具有插入了二个CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子。

测定结果示于图5的表(淀粉栏)中。需要指出的是，图的上半部分表示各经过修饰的启动子中CCAAT序列或SRE的插入位置模式图。如该表所示，每插入一个包含从CCAAT序列到SRE的区域可看到淀粉酶产量的增加。也就是说，可以确认通过插入多个CCAAT-SRE片段，可提高淀粉酶的产量。

[实施例8]经过修饰的启动子对碳源的效果

为了检测插入了1拷贝、2拷贝、3拷贝CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子PCSb、PCSPb及PCSPPb对葡萄糖代谢分解抑制的减弱效果，测定以葡萄糖作碳源的GP培养基(1％葡萄糖，1％多聚蛋白胨，0.5％KH₂PO₄，0.1％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH(6.5))培养整合了pBAR-CSb的转化体、整合了质粒pBAR-CSPb的转化体和整合了pBAR-CSPPb的转化体时的淀粉酶活性，与用以淀粉作碳源的SP培养基(1％淀粉，1％多聚蛋白胨，0.5％KH₂PO₄，0.1％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH(6.5))进行培养时的淀粉酶活性进行比较。

以葡萄糖作碳源时的测定结果于图5的表(葡萄糖栏)中。用以葡萄糖作碳源的培养基培养具有野生型启动子的转化株时，其淀粉酶产量是用以淀粉作碳源的培养基进行培养时的酶产量的40分之一。另一方面，用以葡萄糖作碳源的培养基培养具有经过修饰的启动子的转化株时，其淀粉酶产量与用以淀粉作碳源的培养基进行培养时酶产量相比，为1∶8。该结果表明：启动子区域插入了CCAAT-SRE片段的经过修饰的启动子，与野生型启动子相比，可得到减弱代谢分解抑制的效果。另外，由于用以葡萄糖作碳源的培养基进行培养时，与用以淀粉作碳源的培养基进行培养时同样，通过插入多个CCAAT-SRE片段可看到表达增强效果，所以表明通过应用经过修饰的启动子，可获得2种效果4表达增强效果和减弱代谢分解抑制效果。总而言之，可以证明用整合了多个CCAAT-SRE序列的经过修饰的启动子时，即便以葡萄糖作碳源，也可很好地产生淀粉酶。

[实施例9]具有增强子功能的DNA片段多样性检测

检测部分改变CCAAT-SRE片段的SRE部分时，是否保持启动子活性的增强效果。首先，设计以下的引物MSRE，使SRE部分由野生型(CGGAAATTTAAAGG，序列号6)置换成(CGGAATTTAAACGG，序列号7)，应用MSRE和Mutan-Super Express Km Kit(TAKARA)，对pKF进行位点特异性突变的导入。从导入突变了的启动子区域获得CCAAT-SRE(XhoI-NotI)片段，叫做CCAAT-mSRE片段。然后，用与实施例2和3同样的方法，将CCAAT-mSRE片段插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点，制作经过修饰的启动子PCmSb。用含该经过修饰的启动子的质粒pKF-PCmSb，用与实施例4同样的方法构建淀粉酶活性测定时用的质粒pBAR-CmSb，然后用与实施例5及6同样的方法进行启动子活性评价。

用于将SRE部分的一部分碱基置换成其它碱基的引物：

MSRE：5’-TAGGGGCGGAATTTAAACGGGATTAA-3’(序列号27)

淀粉酶活性的测定结果于图6的表中。如表所示，实施碱基置换的启动子(PCmSb)，其淀粉酶表达量是野生型(taaP)的大约3.2倍，与SRE未实施碱基置换的启动子(PCSb)具有同等的启动子活性增强效果。由此证实，即便对SRE部分实施部分突变也能保持增强启动子活性的效果，即保持增强子功能。

[实施例10]增强子序列插入位置的检测

比较将CCAAT-SRE片段插入到多种不同部位进行启动子修饰时，对启动子活性的影响，检测有效的插入位置。

首先，用与实施例3同样的方法，将实施例9中制备的CCAAT-mSRE片段插入到启动子上游区域的XhoI-NotI位点、CCAAT序列与SRE之间区域的NotI位点、或下游的SpeI位点，分别制备经过修饰的启动子PCmSa、PCmSN、PCmSS。用与实施例3和4同样的方法，构建含这些经过修饰的启动子的淀粉酶活性测定时用的质粒，然后用与实施例5及6同样的方法进行启动子活性比较。

淀粉酶活性的测定结果于图6的表中。需要指出的是，表的左侧是各经过修饰的启动子中CCAAT-mSRE片段插入位置的模式图。如表所示，将包含从CCAAT序列到SRE的区域插入到原本存在的CCAAT序列与SRE之间而得到的经过修饰的启动子PCmSN中，未见到启动子活性的上升，但是插入到CCAAT序列与SRE之间以外区域时，无论插入到哪个区域均见到淀粉酶表达量的增加。但是，与插入到CCAAT序列上游和直接插入到TATA-box之前的经过修饰的启动子PCmSa和PCmSS相比，插入到启动子下游区域的XhoI-NotI位点的PCmSb(实施例9)类型的表达量多。这些结果表明：CCAAT-mSRE片段的插入位置在原来存在的SRE下游区域最合适，另外提示从转录起始点到CCAAT-mSRE片段的距离与启动子活性无相关性。需要指出的是，对CCAAT-SRE片段同样适用。

[实施例11]淀粉酶高生产株的获得

尝试用持有经过修饰的启动子的淀粉酶基因获得构巢曲霉的淀粉酶高生产株。

从实施例5或7中制备的转化体中选择具有经过修饰的启动子的淀粉酶基因多拷贝同源整合到argB座位的转化株(CSb16、CSP6、CSPb19)，用100mlSPY培养基(3％淀粉，0.2％KCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物)37℃培养5天，用实施例6所示的方法测定淀粉酶活性。其结果示于图7的表中。与持有野生型启动子的taa2株相比，持有经过修饰的启动子的CSb17株显示5倍的淀粉酶表达量。整合了多拷贝淀粉酶基因的菌株中，有随拷贝数增加表达量增加的倾向，表达量最高的菌株是野生型启动子的34倍，每1升蛋白质质量表达大约10g的淀粉酶。由此可以确认，通过多拷贝整合持有经过修饰的启动子的淀粉酶基因，可进行大量的蛋白质生产。

[实施例12]不同碳源的淀粉酶生产性的比较

下面，应用启动子区域中有2个CCAAT-SRE片段的CSP6株和启动子区域中有3个CCAAT-SRE片段的CSPb19株检测对各种不同碳源的表达量差异。

用100ml SPY培养基(淀粉碳源：3％淀粉，0.2％KCl，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4-7H2O，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物)和MPY培养基(麦芽糖碳源：3％麦芽糖，0.2％KCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物)及GPY培养基(葡萄糖碳源：3％葡萄糖，0.2％KCl，0.1％KH₂PO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，1％蛋白胨，0.5％酵母提取物)培养CSP6株和CSPb19株，37℃培养5天，用与实施例6同样的方法测定淀粉酶活性。

其结果示于图8的表中。如表中所示，与以淀粉作碳源进行培养时相比，以麦芽糖作碳源进行培养时，无论哪一株其淀粉酶活性均降低。考虑这是由于用低分子碳源时受到碳源枯竭等影响。另外，以葡萄糖作碳源时，CSP6株由于代谢分解抑制表达量显著降低，而CSPb19株则维持与以淀粉作碳源时几乎同等的表达量。由该结果可以确认长时间培养导入了多拷贝质粒的转化株时，代谢分解抑制效果和表达增强效果更显著表现出来。也就是说，以获取淀粉酶高生产株为目的导入多拷贝质粒时，通过应用具有3个以上CCAAT-SRE序列的经过修饰的启动子，可更高效获得淀粉酶高生产株。

[实施例13]改变CCAAT与SRE间的距离时的效果

探讨改变CCAAT-SRE片段中CCAAT序列与SRE间的距离时对增强子功能的影响。

首先，用实施例2中所示引物CSXf、CSNr与以下所示引物CbgIr、SBglf进行PCR反应，分别获得含CCAAT序列的片段和含SRE的片段。通过用BglII位点连接这些片段，获得CCAAT序列与SRE间距离短的DNA片段(以下，叫做“sCCAAT-mSRE片段”)，将之插入到启动子(taaP)区域的下游区域的XhoI-NotI位点，制备出经过修饰的启动子。应用该经过修饰的启动子，用与实施例3-6同样的方法评价启动子活性。

添加Bg111位点的下游引物：

CBglr：5’-GAAGATCTCTGTTTCGCTTTGCTGCTTC

添加Bg111位点的上游引物：

SBglf：5’-GAAGATCTTCCAGAGTGACTAGGGGCGG-3’(序列号29)

测定淀粉酶活性的结果示于图9的表中。如表中所示，与野生型启动子(taaP)相比，用CCAAT-SRE片段进行修饰的启动子(PsCmSb)显现1.6倍的淀粉酶表达量增加效果。也就是说，CCAAT序列与SRE间的距离缩短时，也能获得启动子活性的增强效果。该结果强烈提示与启动子活化相关的区域是CCAAT序列与SRE2个区域。需要指出的是，PsCmSb与插入了原来大小的CCAAT-mSRE区域的PCmSb相比，仅增加约一半的效果，考虑这种增加效果的降低是由于改变CCAAT序列与SRE间的距离而造成与CCAAT序列结合的HAP复合体和与SRE结合的AmyR的位置关系偏离最适距离。总而言之，通过使从CCAAT序列到SRE的距离最适化，即便应用更短的DNA片段，也十分可能保持CCAAT-SRE片段具有的启动子活性增强效果。

[实施例14]增强子序列(SRE)多样性的探讨

检测向野生型启动子(taaP)的SRE部分导入各种突变时对启动子活性的影响。首先，用以下所示的引物进行PCR反应，制备经过修饰的启动子taaS(SRE部分的序列为：CGGAAATTTAACGG，序列号8)和MSRE2(SRE部分的序列为：CGGAAATTTAATTA，序列号30)，其中野生型启动子(taaP)中存在的的SRE的一部分碱基被置换成其它碱基。用这些经过修饰的启动子，按与实施例3-6同样的方法评价启动子活性。

SREc(taaS用)：5’-GGGGCGGAAATTTAACGGGATTAATTTCC-3’(序列号31)

MSRE2(MSRE2用)：5’-CGGAAATTTAATTAGATTAATTTCC-3’(序列号32)

测定淀粉酶活性的结果示于图10的表中。野生型启动子中存在的SRE5’末端第12位碱基突变成C的经过修饰的启动子taaS，显现野生型启动子1.2倍的淀粉酶活性。该结果表明：即便给SRE5’末端第12位碱基造成突变也能维持SRE具有的增强子功能，将该碱基置换成C时所得序列具有更好的增强子功能。另一方面，SRE5’末端第13和第14位碱基分别置换成T和A时的经过修饰的启动子MSRE2的淀粉酶表达量降低，是野生型启动子的0.8倍。根据该结果，可以说不突变SRE5’末端的第13和第14位碱基对维持高增强子功能很重要。

[实施例15]构建表达淀粉酶而用的质粒

为了证明在利用米曲霉作宿主的酶的生产体系中利用经过修饰的启动子有效，应用实施例3和实施例7中制备的各种经过修饰的启动子进行以下实验。首先，用Xbal和BamHI酶切实施例4中制备的质粒pBAR-CSPb，然后通过琼脂糖凝胶电泳回收、纯化约3600bp的DNA片段。将回收的DNA片段插入到导入了鸟氨酸5’磷酸脱羧酶基因(pyrG基因)的质粒pYRG100的Xbal-BamHI酶切位点，构建淀粉酶基因表达用质粒pYRG-CSPb。需要指出的是，按先前的报道(日本酱油研究所杂志，25(1)，21-26(1999))如下制备pYRG100。即，以米曲霉AMA1201株(FERMP-19089)的染色体DNA为模板，应用以下引物PyrF和PyrR进行PCR反应，用Sall和HindIII酶切所得扩增产物，得到约1.9Kbp的DNA片段。将该片段导入pUC119多克隆位点的Sall-HindIII位点，得到pYRG100。

PyrF：5’TATGTCGACCCAAGCCGCTGCTGGAATTGA3’(序列号33)

PyrR：5’GAAAAGCTTGATCAATACCGTACGGGAGAT3’(序列号34)

[实施例16]淀粉酶低生产株(米曲霉AMA1201-P株)和淀粉酶高生产株(米曲霉KBN6217-56株)的转化

1.米曲霉的转化

用实施例15中所得质粒pYRG-CSPb，在米曲霉同种内(用米曲霉的基因转化米曲霉)利用经过修饰的启动子时，评价蛋白质生产性提高效果。首先，用实施例15中所得质粒pYRG-CSPb如下进行米曲霉的转化。用向完全培养基(2％麦芽提取物，2％葡萄糖，0.1％细菌蛋白胨)中添加了尿苷的培养基培养pyrG基因的缺损株米曲霉1201-P株和同基因的缺损株米曲霉KBN6217-56株，30℃振荡培养一晚后，将所得菌体悬浮到细胞壁溶解液(20mg/ml Yatalase(宝酒造)，0.8MNaCl，10mM磷酸缓冲液(pH6.0))中，30℃缓慢振荡，使其原生质体化。然后，用尼龙膜过滤含原生质体的悬浮液，除去残存的菌体。

需要指出的是，AMA1201株为米曲霉AMA1201-P株的亲株，KBN6217株是米曲霉KBN6217-56株的亲株，均是按Mol.Gen.Genet.(1987)，210：460-461，分离出5氟乳清酸(5-FOA)的耐性株后，筛选出尿苷要求性突变株的。

米曲霉AMA1201株如下保藏。

保藏号：FERM P-19089

国际保藏机关：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，305-8566茨城县筑波市东1丁目1番3号中央第6

保藏日：2002年(平成14年)11月1日

同样，米曲霉KBN6217株如下保藏。

保藏号：FERM P-19088

保藏日：2002年(平成14年)11月1日

接下来，应用用上述方法而得的各原生质体，通过Turner等的方法(Gene，36，321-331(1985))进行活性细胞的制备和转化。每一宿主得到数十株能在不含尿苷的培养基(Czapek-Dox培养基(0.2％NaNO₃，0.1％K₂HPO₄，0.05％KCl，0.05％MgSO₄·7H₂O，2％葡萄糖(pH5.5))中生长发育的转化体。

2.淀粉酶高生产株的获得

将上面1.中所得各转化株点植到淀粉酶活性检测用的琼脂培养基(2％麦芽糖，1％支链淀粉，0.09％NaNO₃，0.15％KH₂PO₄，0.05％KCl，0.05％MgSO₄·7H₂O，1.5％琼脂(pH6.5))上。从菌体分泌出的淀粉酶作用于底物，使支链淀粉分解产生晕，以晕的大小为指标，分别筛选各宿主的淀粉酶高生产株。

3.淀粉酶活性的测定

用施用器刮取上面2.中获得的淀粉酶高生产株，接种到100ml SP培养基(1％淀粉，1％多聚蛋白胨，0.5％KH₂PO₄，0.1％NaNO₃，0.05％MgSO₄·7H₂O，pH(6.5))中，30℃、振荡培养66小时，然后按照实施例6测定淀粉酶活性。

测定结果示于图11的表中。淀粉酶低生产株AMA1201-P株或高生产株KBN6217-56株任一株作宿主时，其转化体的淀粉酶生产量均比其亲株有显著增加。具体而言，以淀粉酶低生产株AMA1201-P株为宿主所得转化株中，其淀粉酶生产量是其亲株的57倍以上。另一方面，当用淀粉酶高生产株KBN6217-56株作宿主所得转化株中，其淀粉酶生产量是其亲株的10倍以上。由以上结果可以确认：即便以米曲霉作宿主时，对于高表达其导入基因而言，本发明的经过修饰的启动子也能有效发挥功能。

[实施例17]异种基因(漆酶基因)表达用质粒的构建

接下来探讨表达异种基因时经过修饰的启动子的效果。如下进行漆酶基因表达用质粒的构建。首先，为了与漆酶基因连接，用以下所示的引物，通过PCR法，分别向TaKa淀粉酶启动子和经过修饰的启动子(PCSPb、PCSPPb)导入突变。

TaKa淀粉酶基因启动子5’末端(有EcoRI酶切位点)的引物：5’GGAATTCATGGTGTTTTGATC 3’(Taa1F，序列号35)

向TaKa淀粉酶基因启动子3’末端添加EcoT221酶切位点时的引物：5’ GAGACCACCACGCGACATGCATAAATGCCTTCTGTGG 3’(Taa-E，序列号36)

另一方面，为了将Paraphaeoshaeria属或鉴定为与该属近缘的KL112株来源的漆酶基因与启动子连接，整合到载体中，用以下所示引物，通过PCR法导入突变进行漆酶基因的扩增及限制性酶识别。

漆酶基因扩增及向其5’末端添加EcoT221酶切位点时的引物：P11：5’ CCATGCATTTCTTTATCATTGGAG 3’(序列号37)

漆酶基因扩增及向其3’末端添加SacI酶切位点时的引物：P12：5’ CCGAGCTCTGGTATAGTATCTTGAATGTATC 3’(序列号38)

按Raeder等的方法(U.Raeder and P.Broda，Lett.App1.Microb.，1，17-20(1985))，从用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(DIFCO)培养的KL112株制备供于PCR反应的模板DNA。KL112株如下保藏：

保藏号：FERM P-19071

保藏日：2002年(平成14年)10月18日

用EcoRI和EcoT221酶切用以上方法导入突变了的各启动子区域，另一方面，用EcoT221和SacI酶切扩增的漆酶基因。然后利用琼脂糖凝胶电泳回收、纯化各限制性酶切片段。将所得各限制性酶切片段插入到表达载体pYRG100的EcoRI-SacI酶切位点，构建漆酶表达用载体pTALC100(TaKa淀粉酶启动子)、pTALCPb(经过修饰的启动子PCSPb)及pTALCPPb(经过修饰的启动子PCSPPb)。

[实施例18]以米曲霉作宿主的转化体的获得

1.漆酶高生产株的获得

用实施例17中得到的质粒pTALC100、pTALCPb及pTALCPPb，用与实施例16 1.中记载的同样方法转化米曲霉AMA1201-P株。接下来，将转化体点植到漆酶活性检测用琼脂培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基(DIFCO)：10mM CuSO₄，1mM咖啡酸)上。通过菌体分泌出来的漆酶的作用，底物中的咖啡酸被氧化开裂、聚合，生成褐色物质，由此形成晕，以晕的大小为指标，筛选淀粉酶高生产株。

2.漆酶活性测定

用施用器刮取上面1.中获得的漆酶高生产株，接种到50mlSPN培养基(3％淀粉，1％多聚蛋白胨，1％发酵粕，0.1％KH₂PO₄，0.2％KCl，0.05％MgSO₄·7H₂O，10mM CuSO₄pH(6.5))中，30℃、振荡培养6日。培养终止后，用Buchner漏斗和滤纸分离菌体与上清，以上清作为酶溶液。

向50mM醋酸钠缓冲液、1mM邻甲氧基苯酚(和光纯药)中加入酶溶液，制成2.5ml的反应体系，40℃、反应10分钟，通过检测430nm处吸光度的变化求出漆酶活性。

测定漆酶活性的结果示于图12的表中。用非重组体(用米曲霉AMA1201-P株作宿主)的菌株中未见到漆酶活性，转化体中任一株中均检测出高漆酶活性。导入了含三个CCAAT-SRE片段的启动子(PCSPb)的转化体的漆酶生产性，与导入了野生型启动子的转化体相同。但是，通过导入含四个CCAAT-SRE片段的启动子(PCSPPb)，可获得更高效生产漆酶的菌株。

以上结果证明：即使是以表达异种基因为目的，应用含较多CCAAT-SRE序列的改良启动子利于高效生产酶。

需要指出的是，对各转化体的培养滤液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时可以发现，由漆酶基因而来的预想分子量大小的蛋白质量在任一种转化体中均比非重组体有明显增多。

产业上利用的可能性

本发明提供在丝状真菌发挥功能的表达效率高的经过修饰的启动子。用该经过修饰的启动子可构建以丝状真菌为宿主的同种或异种蛋白质的高效生产体系。以生产淀粉酶蛋白质为模型进行检测时，与应用野生型启动子时相比，可获得具有其7倍表达量的转化体。由此可以证明，本发明的经过修饰的启动子对蛋白质的高效生产体系的构建极其有用。

序列表

<110>天野酶株式会社

<120>经过修改的启动子

<130>P0200102

<150>JP P2002-055853

<151>2002-03-01

<150>JP P2002-354670

<151>2002-12-06

<160>38

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<220>

<221>mise_feature

<222>(6)..(11)

<223>n代表任何碱基

<400>1

ccaatnnnnnn 11

<210>2

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<220>

<221> mise_feature

<222>(4)..(12)

<223>n代表任何碱基

<400>2

cggnnnnnnn nngg 14

<210>3

<211>11

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<400>3

ccaattagaa g 11

<210>4

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<220>

<221>mise_feature

<222>(5)..(5)

<223>n代表任何碱基

<220>

<221>mise_feature

<222>(10)..(10)

<223>n代表任何碱基

<400>4

cgghnwwwwn whgg 14

<210>5

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<400>5

cggwwwwwww whgg 14

<210>6

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<400>6

cggaaattta aagg 14

<210>7

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<400>7

cggaatttaa acgg 14

<210>8

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：增强子序列

<400>8

cggaaattta acgg 14

<210>9

<211>128

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人序列说明：包含CCAAT序列和SRE的DNA片段

<400>9

ccaattagaa gcagcaaagc gaaacagccc aagaaaaagg tcggcccgtc ggccttttct 60

gcaacgctga tcacgggcag cgatccaacc aacaccctcc agagtgacta ggggcggaaa 120

tttaaagg 128

<210>10

<211>196

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：包含CCAAT序列和SRE的DNA片段

<400>10

ctgcagacca cctctaggca tcggacgcac catccaatta gaagcagcaa agcgaaacag 60

cccaagaaaa aggtcggccc gtcggccttt tctgcaacgc tgatcacggg cagcgatcca 120

accaacaccc tccagagtga ctaggggcgg aaatttaaag ggattaattt ccactcaacc 180

acaaatcaca ctgcag 196

<210>11

<211>193

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：包含CCAAT序列和SRE的DNA片段

<400>11

ctcgagaggc atcggacgca ccatccaatt agaagcagca aagcgaaaca gcccaagaaa 60

aaggtcggcc cgtcggcctt ttctgcaacg ctgatcacgg gcagcgatcc aaccaacacc 120

ctccagagtg actaggggcg gaaatttaaa gggattaatt tccactcaac cacaaatcac 180

agtcggcggc cgc 193

<210>12

<211>615

<212>DNA

<213>米曲霉

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(615)

<223>

<400>12

gaattcatgg tgttttgatc attttaaatt tttatatggc gggtggtggg caactcgctt 60

ccgggcaact cgcttaccga ttacgttagg gctgatattt acgtaaaaat cgtcaaggga 120

tgcaagacca aagtagtaaa accccggagt caacagcatc caagcccaag tccttcacgg 180

agaaacccca gcgtccacat cacgagcgaa ggaccacctc taggcatcgg acgcaccatc 240

caattagaag cagcaaagcg aaacagccca agaaaaaggt cggcccgtcg gccttttctg 300

caacgctgat cacgggcagc gatccaacca acaccctcca gagtgactag gggcggaaat 360

ttaaagggat taatttccac tcaaccacaa atcacagtcg tccccggtat tgtcctgcag 420

aatgcaattt aaactcttct gcgaatcgct tggattcccc gcccctggcc gtagagctta 480

aagtatgtcc cttgtcgatg cgatgtatca caacatataa atactagcaa gggatgccat 540

gcttggagga tagcaaccga caacatcaca tcaagctctc ccttctctga acaataaacc 600

ccacagaagg cattt 615

<210>13

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增CCAAT序列的PCR引物

<400>13

ccgctcgagg caccatccaa ttagaagcgc ggccgctaaa ctat 44

<210>14

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增CCAAT序列的PCR引物

<400>14

atagtttagc ggccgcgctt ctaattggat ggtgcctcga gcgg 44

<210>15

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SRE的PCR引物

<400>15

gactagttaa cctaggggcg gaaatttaac gggatgttaa ctagtc 46

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增SRE的PCR引物

<400>16

gactagttaa catcccgtta aatttccgcc cctaggttaa ctagtc 46

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增包含CCAAT序列和SRE的DNA片段的PCR引物

<400>17

aaactgcaga ccacctctag gcatcggacg 30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>18

tttctgcagt gttgatttgt ggttgagtgg 30

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>19

cggctcgagg catcggacgc accatcc 27

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>20

atagtttagc ggccgccgac tgtgatttgt ggttgagtgg 40

<210>21

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>21

cgcttggatt ccccgcccgc ggccgcagag cttaaagtat gtccc 45

<210>22

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>22

gaatgcaatt taaactcttc ctcgagtcgc ttggattccc cgccc 45

<210>23

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>23

gtagtaaaac cccggagtca gcggccgcca agcccaagtc cttcacg 47

<210>24

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>24

cgtcaaggga tgcaagactc gagtagtaaa accccggagtc 41

<210>25

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>25

gcaccatcca attagaagcg cggccgcgaa acagcccaag aaaaagg 47

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>26

taaagt atgt cactagtcga tgcgat 26

<210>27

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于定点诱变的引物

<400>27

taggggcgga atttaaacgg gattaa 26

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增包含CCAAT序列的DNA片断的PCR引物

<400>28

gaagatctct gtttcgcttt gctgcttc 28

<210>29

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于扩增包含SRE的DNA片段的PCR引物

<400>29

gaagatcttc cagagtgact aggggcgg 28

<210>30

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：部分修饰的SRE

<400>30

cggaaattta atta 14

<210>31

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于诱变SRE的PCR引物

<400>31

ggggcggaaa tttaacggga ttaatttcc 29

<210>32

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：用于诱变SRE的PCR引物

<400>32

cggaaattta attagattaa tttcc 25

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>33

tatgtcgacc caagccgctg ctggaattga 30

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>34

gaaaagcttg atcaataccg tacgggagat 30

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>35

ggaattcatg gtgttttgat c 21

<210>36

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>36

gagaccacca cgcgacatgc ataaatgcct tctgtgg 37

<210>37

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>37

ccatgcattt ctttatcatt ggag 24

<210>38

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列说明：RCR引物

<400>38

ccgagctctg gtatagtatc ttgaatgtat c 31

15

Claims

1.一种经过修饰的启动子，它是将含CCAATNNNNNN(第1碱基序列：序列号1)的第1DNA片段和含CGGNNNNNNNNNGG(第2碱基序列：序列号2)的第2DNA片段插入到在丝状真菌中发挥作用的启动子中而得到的，其中将第1DNA片段和第2DNA片段插入到启动子中存在的CCAAT序列上游的5’端，或启动子中存在的SRE区域下游的3’端，所述经过修饰的启动子不是米曲霉(Aspergillusoryzae)野生型TAKA-淀粉酶启动子。

2.权利要求1中经过修饰的启动子，其中第1碱基序列为CCAATTAGAAG(序列号3)。

3.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGHNWWWWNWHGG(序列号4)。

4.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGWWWWWWWWHGG(序列号5)。

5.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中第2碱基序列为CGGAAATTTAAAGG(序列号6)、CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAACGG(序列号8)。

6.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中第1DNA片段和第2DNA片段按从启动子5’末端到3’末端的方向顺次插入。

7.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中插入了多个第1DNA片段和多个第2DNA片段。

8.权利要求7中经过修饰的启动子，其中插入的第1DNA片段和第2DNA片段数目相同。

9.权利要求8中经过修饰的启动子，其中第1DNA片段和第2DNA片段的插入方式是：一个第1DNA片段和一个第2DNA片段配对，且各对中第1DNA片段插入到启动子的5’末端。

10.一种经过修饰的启动子，它是将1-数个具有增强子功能的DNA片段整合到在丝状真菌中发挥作用的启动子中而得到的，其DNA片段是具有序列号9中碱基序列的DNA片段，其中将所述DNA片段插入到启动子中存在的CCAAT序列上游的5’端，或启动子中存在的SRE区域下游的3’端，所述经过修饰的启动子不是米曲霉野生型TAKA-淀粉酶启动子。

11.权利要求1或2中经过修饰的启动子，其中在丝状真菌中发挥作用的启动子是米曲霉TAKA淀粉酶的启动子。

12.一种具有增强子功能的DNA片段，它由含CCAATNNNNNN(序列号1)的第1DNA片段、CGGAATTTAAACGG(序列号7)或CGGAAATTTAACGG(序列号8)的碱基序列构成。

13.一种经过修饰的启动子，其中在丝状真菌中发挥作用的启动子中存在的CCAAT序列上游的5’端、或所述启动子中存在的SRE区域下游的3’端含有权利要求12中的DNA片断，所述经过修饰的启动子不是米曲霉(Aspergillus oryzae)野生型TAKA-淀粉酶启动子。

14.一种载体，它整合了权利要求1-11和13任一项中经过修饰的启动子。

15.权利要求14的载体，其还整合了目的蛋白质的结构基因，该基因受经过修饰的启动子的调控。

16.一种丝状真菌的转化体，它持有权利要求15的载体，能表达上述结构基因。

17.一种丝状真菌，它持有权利要求1-11和13任一项中经过修饰的启动子和编码目的蛋白质、受经过修饰的启动子调控的结构基因。

18.一种蛋白质的生产方法，其特征在于，在能够产生上述蛋白质的条件下培养权利要求17中的丝状真菌，回收所产生的蛋白质。