CN117025697B - 一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，且公开了一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：S1、采用基因工程方法将腺苷蛋氨酸合成酶基因导入大肠杆菌内，建立菌种库；S2、在容器中加入聚乙烯醇、氯化钠、去离子水，使其充分溶解，然后加入混匀的甲基丙烯酸羟乙酯，二乙烯苯及混合致孔剂正庚烷和乙酸乙酯，200‑300rpm搅拌升温至75℃反应2h，然后升温至85℃反应3h，最后升温95℃固化6h；制得的羟基树脂载体先用热水清洗，再用丙酮提取8h，50‑60℃真空干燥。本发明相较于现有的腺苷蛋氨酸工业化生产工艺，固定化方法先进，简单，固酶的强度高，可以使用搅拌方式，使用的效率高，可以反复使用多次，有效降低成本，同时提高转化率。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的公开了一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法。
背景技术
腺苷蛋氨酸（SAM）于1951年被发现，广泛存在于动物、植物和微生物中，也是存在于人体所有组织和体液中的一种生理活性分子，参与了40多种生化反应，主要用于治疗肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁郁积，妊娠期肝内胆汁郁积，精神抑郁等疾病。在生物体内由蛋氨酸和ATP经腺苷蛋氨酸合成酶催化合成，在此反应中，ATP的腺苷转移到蛋氨酸上，形成一个高能硫原子，通过亲核进攻使与其相连的碳原子活化，从而具有转甲基、转氨丙基、转硫基等作用。腺苷蛋氨酸通过提供基团和作为酶的诱导剂参与体内重要的生化反应的各种代谢途径，如脂内、蛋白质、核酸甲基化反应、转硫反应及多氨合成反应等、因其具有消炎及组织修复等功能，因此多用于关节炎的治疗；由于甲基化作用可以促进大脑和血液代谢多巴胺及复合胺，因此对抑郁症有很好的治疗作用；腺苷蛋氨酸通过转硫途径生成体内关键的抗氧化及解毒物质半胱氨酸，再生成另一种抗氧化及解毒物质谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，因此具有治疗肝病的作用；等等。腺苷蛋氨酸在常温条件下的吸湿性、不稳定性、易发生失活反应以及生产工艺的复杂性，使得生产成本较高，价格昂贵严重限制了腺苷蛋氨酸在医疗保健领域的广泛使用。
目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺主要有酵母发酵法、酶促转化法、固定化细胞法，固定化酶法四种。
酵母发酵法：国内外通过培育表达SAM的酿酒酵母菌株和基因工程改构的酿酒酵母，发酵表达SAM，但产物浓度低，原料转化率低，生产周期长，发酵液杂质多，处理和纯化复杂；酶促法：从啤酒酵母或大肠杆菌工程菌中提取纯化腺苷蛋氨酸合成酶，以纯化的游离态SAM合成酶为酶源，以腺苷三磷酸（ATP）为前体底物原料，因游离态SAM合成酶不能重复利用，导致酶促法合成SAM成本很高；固定化细胞：通过海绵多孔结构将含有SAM合成酶的交联细胞挂住形成固定化细胞，固定化过程繁琐，固定化细胞杂酶多，反应温度高，产物易降解，另外海绵机械强度不足，容易被压扁变硬，细胞通透性变差，使底物与酶结合受阻，酶失活快，重复利用率低；普通固定化酶法：酶交联聚合体，氨基载体固定化酶，壳聚糖固定化酶，固定化过程酶失活多，重复使用次数少。
发明内容
本发明主要提供一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，能够解决目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺中存在的生产周期长，发酵液杂质多，处理和纯化复杂，合成成本高等问题。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，更具体的说是一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
S1、采用基因工程方法将腺苷蛋氨酸合成酶基因导入大肠杆菌内，建立菌种库；
S2、在容器中加入聚乙烯醇、氯化钠、去离子水，使其充分溶解，然后加入混匀的甲基丙烯酸羟乙酯，二乙烯苯及混合致孔剂正庚烷和乙酸乙酯，200-300rpm搅拌升温至75℃反应2h，然后升温至85℃反应3h，最后升温95℃固化6h；
S3、将高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的大肠杆菌按15%浓度于水中溶解，经高压均质机破碎释放出胞内SAM合成酶，4000-5000rpm离心得粗酶液，粗酶液经琼脂糖分离介质吸附、20mM咪唑-50mMPBS-200mM NaCl洗脱杂质、再用500mM咪唑-50mMPBS-200mM NaCl洗脱，提取纯化得精酶液；精酶液按30-60mg蛋白/1g已活化的羟基树脂载体搅拌4h或以上，使载体上亚氨基碳酸基团与酶分子上的氨基反应，固定化得固定化SAM合成酶，酶蛋白固定化率达到90%；
S4、固定化SAM合成酶合成SAM：将固定化SAM合成酶加入底物反应液中，调节PH5.0-7.0，在温度30-40℃的条件下酶催化搅拌反应生成SAM，转化率达到90%以上，固定化酶与反应液经简单的固液分离后可以重复使用，固定化酶在重复使用100次后，活性不会显著下降。
更进一步的，所述S1的具体过程为：发酵生产时取工作菌种接种于LB液体培养基中，转速200rpm，37℃摇床培养16～20h，OD600大于3，镜检无杂菌即为合格摇瓶种子；将摇瓶种子接种于50L一级种子罐培养基中，转速250rpm，通气1.3~1.5m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养4-8h，OD600大于4后移入500L二级种子罐培养基中，转速150rpm，通气10~12m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养4-8h，OD600大于4后将二级种子液移入发酵罐改良LB培养基中，转速100~130rpm，通气40~80m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养2.5-3.5h，当出现溶氧、PH上升时，以适当的流速流加C源及N源，当培养到OD600达到22～25，降温到25℃，并加入IPTG诱导剂使终浓度达0.2mmol/L进行诱导表达，继续补料发酵培养；发酵20～30h，直到补完料或OD600增加不明显、蛋白量增加不明显时终止发酵，离心收集菌体细胞。
更进一步的，所述S2中，在制得羟基树脂载体后，制得的羟基树脂载体先用热水清洗，再用丙酮提取8h，50-60℃真空干燥。
更进一步的，所述S2中还包括对羟基树脂载体进行活化，具体的活化方法为：将载体加入1%溴化氰溶液中，搅拌4h或以上，使载体上的羟基活化生产亚氨基碳酸衍生物。
更进一步的，所述S4中，固定化SAM合成酶与底物反应液的质量体积比=1∶10~1∶50。
更进一步的，所述S4中底物反应液包括：20-50mmol/L腺苷三磷酸（ATP）、50-100mmol/L甲硫氨酸和20-40mmol/L硫酸镁。
本发明一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法的有益效果为：本发明相较于现有的腺苷蛋氨酸工业化生产工艺，固定化方法先进，简单，固酶的强度高，可以使用搅拌方式，使用的效率高，可以反复使用多次，有效降低成本，同时提高转化率，减少降解杂质的生成。并且，固酶的使用次数多，有效减少因固酶失活所产生的固体废物，同时相对其他的方法，能够有效减少发酵尾气的排放，污水的排放等。另外，通过琼脂糖分离介质纯化大肠杆菌工程菌中的SAM合成酶，纯化效率高，蛋白纯度高，再采用羟基树脂载体对纯化后的SAM合成酶进行固定化，固定化条件温和，蛋白固定率高，酶失活少，固定化酶稳定性好，催化腺苷三磷酸（ATP）和甲硫氨酸合成腺苷蛋氨酸，速度快，1.5小时完成反应，底物利用率高，重复使用100次合成能力不下降，反应液与固定化酶过滤分离操作简单，更使用于工业生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方法对本发明做进一步详细的说明。
图1为第一次反应1.5h图谱；
图2为第五十次反应1.5h图谱；
图3为第一百次反应1.5h图谱。
具体实施方式
下文中将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
根据本发明的一个方面，提供了一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
第一步、菌体发酵：取工作种子一支接种于750ml LB液体培养基中，转速200rpm，37℃摇床培养20小时，OD600为4.3，镜检无杂菌即为合格摇瓶种子。将摇瓶种子接种于50L一级种子罐培养基中，转速250rpm，通气1.3~1.5m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养5小时，OD600大于4后移入500L二级种子罐培养基中，转速150rpm，通气10~12m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养6小时，OD600大于4后将二级种子液移入发酵罐改良LB培养基中，转速100~130rpm，通气40~80m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养3小时，当出现溶氧、PH上升时，以适当的流速流加C源及N源，当培养到OD600达到24，降温到25℃，并加入IPTG诱导剂使终浓度达0.2mmol/L进行诱导表达，继续补料发酵培养。发酵26小时，直到补完料或OD600增加不明显、蛋白量增加不明显时终止发酵。离心收集菌体细胞。
第二步、羟基树脂载体制备：向装有冷凝管，搅拌，温度计的三口瓶中加入聚乙烯醇、氯化钠、去离子水，使其充分溶解，然后加入混匀的甲基丙烯酸羟乙酯，二乙烯苯及混合致孔剂正庚烷和乙酸乙酯，缓慢启动搅拌调至200rpm，再升温至75摄氏度反应两小时，然后升温至85摄氏度反应三小时，最后升温至95摄氏度固化六小时。将反应物倒入滤袋中，先用热水冲洗至流出液无色，再用丙酮提取8小时，晾干，55摄氏度真空干燥，分筛备用。羟基树脂载体的活化：将200g羟基树脂载体加入1L 5%溴化氰溶液中，搅拌4小时，过滤。
第三步、酶蛋白提取：取大肠杆菌工程菌300g，用水定容2L溶解得菌液，菌液经550bar高压均质机破碎，4500rpm离心得2L粗酶液，称取120g琼脂糖介质加入粗酶液中，搅拌吸附SAM合成酶4小时，过滤，测得滤液中残留蛋白计算介质共吸附酶蛋白6.08g，用600ml20mM咪唑-50mMPBS-200mM NaCl溶液洗杂，再用300ml500mM咪唑-50mMPBS-200mMNaCl溶液洗脱得精酶液约300ml，检测酶液中蛋白量共5.73g，称取112g已活化的羟基树脂载体加入精酶缓冲液中，搅拌4小时固定酶，过滤，滤液测定蛋白残留量并计算蛋白固定化率为97%，单位重量羟基树脂载体的固定化蛋白含量为49.79mg/g，将得到固定化SAM合成酶用300ml水洗3次，待用。
称取5g固定化SAM合成酶加入100ml底物反应液，调节PH至6，升温至37℃反应1.5小时，测定转化率，固定化酶重复使用100次，反应转化率保持90%以上。反应图谱如图1-3所示。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用基因工程方法将腺苷蛋氨酸合成酶基因导入大肠杆菌内，建立菌种库；
S2、在容器中加入聚乙烯醇、氯化钠、去离子水，使其充分溶解，然后加入混匀的甲基丙烯酸羟乙酯，二乙烯苯及混合致孔剂正庚烷和乙酸乙酯，200-300rpm搅拌升温至75℃反应2h，然后升温至85℃反应3h，最后升温95℃固化6h；然后对得到的羟基树脂载体进行活化，具体的活化方法为：将载体加入1%溴化氰溶液中，搅拌4h，使载体上的羟基活化生产亚氨基碳酸衍生物；
S3、将高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的大肠杆菌按15%浓度于水中溶解，经高压均质机破碎释放出胞内SAM合成酶，4000-5000rpm离心得粗酶液，粗酶液经琼脂糖分离介质吸附、20mM咪唑-50mMPBS-200mM NaCl洗脱杂质、再用500mM咪唑-50mMPBS-200mM NaCl洗脱，提取纯化得精酶液；精酶液按30-60mg蛋白/1g已活化的羟基树脂载体搅拌4h，使载体上亚氨基碳酸基团与酶分子上的氨基反应，固定化得固定化SAM合成酶；
S4、固定化SAM合成酶合成SAM：将5g固定化SAM合成酶加入100ml由20-50mmol/L腺苷三磷酸（ATP）、50-100mmol/L甲硫氨酸和20-40mmol/L硫酸镁组成的底物反应液中，调节PH至6.0，在温度37℃的条件下酶催化搅拌反应1.5小时生成SAM。
2.根据权利要求1所述的一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于：所述S1的具体过程为：发酵生产时取工作菌种接种于LB液体培养基中，转速200rpm，37℃摇床培养16～20h，OD600大于3，镜检无杂菌即为合格摇瓶种子；将摇瓶种子接种于50L一级种子罐培养基中，转速250rpm，通气1.3~1.5m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养4-8h，OD600大于4后移入500L二级种子罐培养基中，转速150rpm，通气10~12m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养4-8h，OD600大于4后将二级种子液移入发酵罐改良LB培养基中，转速100~130rpm，通气40~80m3/h，温度36～37℃，压力0.05Mpa，培养2.5-3.5h，当出现溶氧、PH上升时，流加C源及N源，当培养到OD600达到22～25，降温到25℃，并加入IPTG诱导剂使终浓度达0.2mmol/L进行诱导表达，继续补料发酵培养；发酵20～30h，直到补完料或OD600增加不明显、蛋白量增加不明显时终止发酵，离心收集菌体细胞。
3.根据权利要求1所述的一种羟基树脂固定酶法生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于：所述S2中，在制得羟基树脂载体后，制得的羟基树脂载体先用热水清洗，再用丙酮提取8h，50-60℃真空干燥。
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