CN102120995B

CN102120995B - 一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法

Info

Publication number: CN102120995B
Application number: CN2010105800217A
Authority: CN
Inventors: 孙君社; 刘萍; 张秀清; 范杰; 张京声
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: Shandong crystal biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-06
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-12-06
Also published as: CN102120995A

Abstract

本发明公开了一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法。该固定化谷氨酸脱羧酶是按照包括下述步骤的方法制备得到的：1)向乳酸菌中加入醋酸-醋酸盐缓冲液，配制成每毫升含菌数为300-500cfu的菌悬液，将所述菌悬液在冰水浴条件下超声破碎，得到谷氨酸脱羧酶的粗酶液；2)使用棉绒布为载体，依次用氢氧化钠、吡啶、对甲苯磺酰氯进行预处理；3)将预处理的棉绒布置于谷氨酸脱羧酶粗酶液中浸泡，然后向溶液中加入戊二醛，实现谷氨酸脱羧酶的固定化。本发明提供的谷氨酸脱羧酶的固定化方法简单，条件要求温和，易于实现，所得到的固定化谷氨酸脱羧酶具有活力高、负载量大、催化反应寿命长等优点。

Description

一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法。

背景技术

γ-氨基丁酸，是一种非组成蛋白质的氨基酸，是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质，一些植物中也含有这种氨基酸。在人脑中，γ-氨基丁酸是通过脑内谷氨酸脱羧酶转化谷氨酸生成的。生物体内γ-氨基丁酸可以参与镇痛、抗焦虑、抗惊厥、降血压等生理活动，具有多种生物学功能。

γ-氨基丁酸的制备，一般分为化学合成、植物富集提取和生物合成三大类。其中化学合成γ-氨基丁酸的方法很多，但成本较高，反应条件不易控制，安全性较差。植物富集提取方法生产γ-氨基丁酸是以植物为原料，经过富集、提取、分离、提纯制得，虽然比化学方法易操作，但由于植物γ-氨基丁酸含量较低，成本仍然较高。生物合成方法操作复杂，成本较高。而固定化酶具有方法简单，可反复利用，反应体系和产物分离简单，条件要求温和，易于实现，生产成本低的优点，因此在实际生产中，与生物合成、化学合成和植物富集提取相比具有很大的优势。

目前发现，具有谷氨酸脱羧酶活性的微生物菌种主要有大肠杆菌，乳酸菌以及曲霉菌等。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶活性最高，但是其存在安全卫生方面的隐患。乳酸菌是一类普遍认为安全的细菌，广泛用于食品加工中。乳酸菌具有多种生理功能，如调节肠道菌群，增强免疫力，抑菌抗氧化，降低血压等。

目前，对于谷氨酸脱羧酶的固定化方法及固定化谷氨酸脱羧酶的研究，有少量文献报道，但或固定化材料和方法复杂，或谷氨酸脱羧酶与载体结合不牢固，或以市售谷氨酸脱羧酶丙酮粉为酶源，固定化后活力低，结果都很不理想。本发明提供的方法很好的克服了上述缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化谷氨酸脱羧酶及其制备方法。

本发明所提供的固定化谷氨酸脱羧酶是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)制备谷氨酸脱羧酶粗酶液：向乳酸菌中加入醋酸-醋酸盐缓冲液，配制成每毫升含菌数为300-500cfu的菌悬液，将所述菌悬液在冰水浴条件下超声破碎，得到谷氨酸脱羧酶的粗酶液；该粗酶液可以放在4℃的冰箱中待用；其中，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.4mol/L，pH值为4.0-5.0；

2)预处理棉绒布载体：依次用氢氧化钠、吡啶、对甲苯磺酰氯对棉绒布进行预处理，得到预处理的棉绒布载体；

3)将预处理的棉绒布载体置于步骤1)得到的谷氨酸脱羧酶粗酶液中浸泡30-50min；

4)向步骤3)的体系中加入戊二醛，使其终浓度达到0.2-1mol/L，继续浸泡1-2h，即得到固定化谷氨酸脱羧酶。

其中，步骤1)中所述乳酸菌可为乳酸菌NBRC 12005。

步骤1)中所述超声破碎的条件可为：超声功率200-400W，工作时间4-8s，间歇时间7-11s，超声工作次数10-40次。

步骤2)中对棉绒布载体进行预处理的具体方法如下：

a)先用浓度为0.2-1mol/L的氢氧化钠溶液在20-50℃下对棉绒布处理1-5h，将处理后的棉绒布吸干水分后，40-80℃烘干；

b)将经a)处理后的棉绒布用5-20mL/g_干棉绒布的干吡啶在20-50℃下处理1-5h；

c)向b)的体系中加入0.2-1.2g/mL_干吡啶的对甲苯磺酰氯，在20-50℃下继续处理1-5h；处理完后晾干，得到预处理的棉绒布载体。

所述棉绒布为常规布料，可从商业途径中获得。

所述a)处理中，处理完后的棉绒布可以在40-70℃的烘箱中烘干待用。

步骤3)中制得的固定化谷氨酸脱羧酶可以放在4℃的冰箱中待用。

将本发明所制备的固定化谷氨酸脱羧酶加入到100mL含1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；取出IGAD(固定化谷氨酸脱羧酶)，用去离子水反复浸泡冲洗3次，再将其加入到100mL含1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；如此反复操作10次。连续进行10次催化反应后，酶活回收率仍可达75％以上。

本发明中谷氨酸脱羧酶的固定化方法的优点：

1、根据选择不同形状的载体，固定化谷氨酸脱羧酶形态可多样，可以以碎片状、桶状、膜状、条状等形态出现，适用于更广泛形态的反应器，更易于二氧化碳的传递和排放。

2、固定化谷氨酸脱羧酶的负载量大。预处理后的载体与酶液接触后已有大量的谷氨酸脱羧酶共价连接到棉纤维上，在经戊二醛处理后，有更多的谷氨酸脱羧酶共价连接到已附着的谷氨酸脱羧酶上，在棉绒布表面形成枝状排列。

3、催化反应寿命长。本发明提供的固定化方法中，棉绒布经过预处理后，谷氨酸脱羧酶与棉纤维以共价键连接，同时谷氨酸脱羧酶之间再通过戊二醛连接起来，进一步增加了固定化谷氨酸脱羧酶的稳定性。

4、本发明提供的谷氨酸脱羧酶的固定化方法简单，条件要求温和，易于实现，所得到的固定化谷氨酸脱羧酶具有活力高、负载量大、催化反应寿命长等优点。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、制备固定化谷氨酸脱羧酶

1)制备谷氨酸脱羧酶粗酶液。向乳酸菌NBRC 12005湿菌体中加入20mL/g_湿菌体的醋酸-醋酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH 4.6)，将离心管内菌体悬浮(菌悬液含菌数350cfu/ml)，并在冰水浴条件下超声破碎，超声波处理条件为超声功率300W，工作时间6s，间歇时间9s，超声工作次数30次。超声结束后，即获得谷氨酸脱羧酶的粗酶液。

2)预处理棉绒布载体：

a)用10mL浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液在30℃下处理3cm×3cm的棉绒布3h，将处理的棉绒布用吸水纸吸干水分后，在50℃烘干。

b)用10mL/g_干棉绒布的干吡啶在25℃下处理步骤1得到的棉绒布2h。

c)向b)的体系中加入0.5g/mL_干吡啶的对甲苯磺酰氯，在25℃下继续处理2h；处理后的棉绒布在通风橱中自然晾干，得到预处理的棉绒布载体。

3)将预处理的棉绒布载体放在步骤1)得到的谷氨酸脱羧酶粗酶液中浸泡30min。

4)向步骤3)的体系中加入戊二醛，使其终浓度达到0.3mol/L，继续浸泡2h即可，即得到固定化谷氨酸脱羧酶。

将固定化谷氨酸脱羧酶加入到100mL含质量浓度1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；取出IGAD，用去离子水反复浸泡冲洗3次，再将其加入到100mL含1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；如此反复操作10次。

测定酶活及计算酶活回收率的方法如下：以Berthelot显色法测定反应液中的GABA。以等量游离短乳杆菌在相同条件下的酶活力为100％，计算固定化细胞酶活回收率。比酶活定义为37℃、pH＝5.0时，1g湿菌体转化1h所产生的GABA物质的量，单位为U，即1U＝1.0μmol/(g·h)。

10次测定酶活回收率依次分别为84.79％，83.12％，82.77％，82.48％，80.01％，79.19％，79.21％，76.94％，76.89％，76.67％。

实施例2、制备固定化谷氨酸脱羧酶

1)制备谷氨酸脱羧酶粗酶液。向乳酸菌NBRC 12005湿菌体中加入20mL/g_湿菌体的醋酸-醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 5.0)，将离心管内菌体悬浮(菌悬液含菌数400cfu/ml)，并在冰水浴条件下超声破碎，超声波处理条件为超声功率200W，工作时间8s，间歇时间7s，超声工作次数30次。超声结束后，即获得谷氨酸脱羧酶的粗酶液。

2)预处理棉绒布载体：

a)用10mL浓度为0.8mol/L的氢氧化钠溶液在40℃下处理3cm×3cm的棉绒布4h，将处理的棉绒布用吸水纸吸干水分后，在60℃烘干。

b)用5mL/g_干棉绒布的干吡啶在40℃下处理步骤1得到的棉绒布4h。

c)向b)的体系中加入0.8g/mL_干吡啶的对甲苯磺酰氯，在35℃下继续处理2h；处理后的棉绒布在通风橱中自然晾干，得到预处理的棉绒布载体。

3)将预处理的棉绒布载体放在步骤1)得到的谷氨酸脱羧酶粗酶液中浸泡50min。

4)向步骤3)的体系中加入戊二醛，使其终浓度达到0.6mol/L，继续浸泡1h即可，即得到固定化谷氨酸脱羧酶。

将固定化谷氨酸脱羧酶加入到100mL含1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；取出IGAD，用去离子水反复浸泡冲洗3次，再将其加入到100mL含1％谷氨酸钠的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 5.0，0.2mol/L)中，于37℃100r/min摇床反应1h后，取反应液测定酶活；如此反复操作10次。酶活测定方法及酶活回收率计算的方法同实施例1。

10次测定酶活回收率依次分别为86.90％，86.44％，86.73％，86.48％，84.97％，84.88％，84.74％，82.99％，80.10％，79.33％。

实施例3、制备固定化谷氨酸脱羧酶

1)制备谷氨酸脱羧酶粗酶液。向短乳杆菌湿菌体中加入20mL/g_湿菌体的醋酸-醋酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH 4.0)，将离心管内菌体悬浮(菌悬液含菌数500cfu/ml)，并在冰水浴条件下超声破碎，超声波处理条件为超声功率400W，工作时间6s，间歇时间11s，超声工作次数30次。超声结束后，即获得谷氨酸脱羧酶的粗酶液。

2)预处理棉绒布载体：

a)用10mL浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液在5℃下处理3cm×3cm的棉绒布5h，将处理的棉绒布用吸水纸吸干水分后，在60℃烘干。

b)用20mL/g_干棉绒布的干吡啶在20℃下处理步骤1得到的棉绒布2h。

c)向b)的体系中加入1.0g/mL_干吡啶的对甲苯磺酰氯，在40℃下继续处理1h；处理后的棉绒布在通风橱中自然晾干，得到预处理的棉绒布载体。

3)将预处理的棉绒布载体放在步骤1)得到的谷氨酸脱羧酶粗酶液中浸泡40min。

4)向步骤3)的体系中加入戊二醛，使其终浓度达到1mol/L，继续浸泡1h即可，即得到固定化谷氨酸脱羧酶。

10次测定酶活回收率依次分别为86.71％，86.69％，86.50％，86.44％，85.87％，84.81％，84.73％，82.99％，80.05％，79.44％。

Claims

1.一种谷氨酸脱羧酶的固定化方法，包括下述步骤：

1)制备谷氨酸脱羧酶粗酶液：向乳酸菌中加入醋酸-醋酸盐缓冲液，配制成每毫升含菌数为300-500cfu的菌悬液，将所述菌悬液在冰水浴条件下超声破碎，得到谷氨酸脱羧酶的粗酶液；其中，所述醋酸-醋酸盐缓冲液的浓度为0.1-0.4mol/L，pH值为4.0-5.0；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中对棉绒布载体进行预处理的具体方法如下：

a)先用浓度为0.2-1mol/L的氢氧化钠溶液在20-50℃下对棉绒布处理1-5h，将处理后的棉绒布吸干水分后，烘干；

b)将经a)处理后的棉绒布用干吡啶在20-50℃下处理1-5h；所述干吡啶的用量为每克干棉绒布使用5-20mL；

c)向b)的体系中加入对甲苯磺酰氯，在20-50℃下继续处理1-5h；处理完后晾干，得到预处理的棉绒布载体；所述对甲苯磺酰氯的用量为每毫升干吡啶加入0.2-1.2g。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述乳酸菌是乳酸菌NBRC 12005。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述超声破碎的条件为：超声功率200-400W，工作时间4-8s，间歇时间7-11s，超声工作次数10-40次。

5.权利要求1-4中任一所述方法制备得到的固定化谷氨酸脱羧酶。