CN102676598A - 谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法。主要工艺包括：（1）将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸，再通过离心分离生物固相酶与反应液；（2）反应液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，生成纯化γ-氨基丁酸；（3）γ-氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，真空薄膜浓缩得γ-氨基丁酸浓溶液；（4）γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色γ-氨基丁酸粉末。该工艺反应专一、产率高、纯度好、周期短、能耗低、适合工业化生产。

Description

谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及一种由谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法，属于生物合成领域。

背景技术

γ-氨基丁酸综述

简介

γ-氨基丁酸，英文名：γ-aminobutyric acid (GABA)γ-氨基丁酸，化学名称： 4-氨基丁酸；别名： γ-氨基丁酸，氨酪酸，哌啶酸。分子式： C₄H₉NO₂ 。分子量： 103.1。广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有GABA。在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1-0.6mg/g组织，免疫学研究表明，其浓度最高的区域为大脑中黑质。GABA是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有很高的生理活性。

基本信息

γ-氨基丁酸；英文名：γ-aminobutyric acid (GABA)

化学名称：4-氨基丁酸 

别名：γ-氨基丁酸，氨酪酸，哌啶酸； 

分子式：C₄H₉NO₂

分子量：103.1 

CAS：56-12-2

化学结构式： 

       

  理化性质：

　　小叶状结晶（甲醇-乙醚）、针状结晶（水-乙醇），熔点202℃（在快速加热下分解）。在25℃时解离常数Ka3.7×10^-11, Kb1.7×10^-10。易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于其他有机溶剂。在熔点温度以上分解形成吡咯烷酮和水。外观：白色结晶或结晶性粉末。 

白色片状或针状结晶；微臭，具有潮解性；极易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯；分解点为202℃；LD₅₀(大鼠，腹腔) 5400mg/kg。 

来源分布：

　　γ-氨基丁酸（GABA）是一种天然活性成分，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属、中草药等的种子、根茎和组织液中都含有GABA。在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1～0.6mg/g组织，免疫学研究表明，其浓度最高的区域为大脑中黑质。 

生理作用： 

　　γ-氨基丁酸属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用。它是抑制性神经递质（Inhibitory Neurotransmitter），可以抑制动物的活动，减少能量的消耗。氨基丁酸作用于动物细胞中的GABA受体，GABA受体是一个氯离子通道，GABA的抑制性或兴奋性是依赖于细胞膜内外的氯离子浓度的，GABA受体被激活后，导致氯离子通道开放，能增加细胞膜对氯离子通透性，使氯离子流入神经细胞内，引起细胞膜超极化，抑制神经细胞元激动，从而减少动物的运动量。 

它是通过减少动物的无意识运动，来减少能量消耗，从而达到促生长的目的。γ-氨基丁酸能促进动物胃液和生长激素的分泌，从而提高生长速度和采食量；能兴奋动物的采食中枢，从而增加采食量。是一种神经抑制的产品。  

γ-氨基丁酸临床应用：

（1）镇静神经、抗焦虑。医学家已经证明GABA是中枢神经系统的抑制性传递物质，是脑组织中最重要的神经递质之一。其作用是降低神经元活性，防止神经细胞过热，GABA能结合抗焦虑的脑受体并使之激活，然后与另外一些物质协同作用，阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢。 

（2）降低血压。GABA能作用于脊髓的血管运动中枢，有效促进血管扩张，达到降低血压的目的。据报道，黄芪等中药的有效降压成分即为GABA。 

（3）治疗疾病。1997年，大熊诚太郎的研究表明GABA与某些疾病的形成有关，帕金森病人脊髓中GABA的浓度较低，癫痫病患者脊髓液中的GABA浓度也低于正常水平。日本大阪大学医学院的研究显示GABA对Kupperman综合症具有显著的改善效果。另外，神经组织中GABA的降低也与Huntington疾病、老年痴呆等神经衰败症的形成有关。 

（4）降低血氨。我国的临床医学和日本的研究者也都认为，GABA能抑制谷氨酸的脱羧反应，使血氨降低。更多的谷氨酸与氨结合生成尿素排出体外，以解除氨毒，从而增进肝机能。摄入GABA可以提高葡萄糖磷酸酯酶的活性，使脑细胞活动旺盛，可促进脑组织的新陈代谢和恢复脑细胞功能，改善神经机能。 

（5）提高脑活力。GABA能进入脑内三羧酸循环，促进脑细胞代谢，同时还能提高葡萄糖代谢时葡萄糖磷酸酯酶的活性，增加乙酰胆碱的生成，扩张血管增加血流量，并降低血氨，促进大脑的新陈代谢，恢复脑细胞功能。 

（6）促进乙醇代谢。以嗜酒者为对象，服用GABA再饮用60ml威士忌后采血测定血中乙醇及乙醛浓度，发现后者浓度明显比对照组低。 

（7）其他。最新的研究表明，GABA还具有防止皮肤老化、消除体臭、改善脂质代谢，防止动脉硬化高效减肥等功能。 

制备方法：

　　GABA的制备方法主要有化学合成法、生物发酵法及固相生物酶合成法三种。 

1.化学合成法：

通常由吡咯烷酮开环制得。将生石灰用蒸馏水消化成石灰乳，抽入水解反应釜，加吡咯烷酮，升温至125～130℃，反应压力保持在0.29MPa，保温反应10～14h以上。反应结束后降温至30℃出料过滤，用蒸馏水洗涤。滤液加碳酸氢铵，直至无钙离子检出，再加活性炭在80℃保温脱色30min，60℃过滤，用蒸馏水洗，洗液与滤液合并，在60℃减压浓缩至析出结晶，加入乙醇，冷却、过滤、干燥，得成品，收率为85%以上。此类多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。

2.生物发酵合成法：

在早期的研究中，发酵法生产GABA以大肠杆菌为生产菌，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等。在发酵过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为GABA，再分离纯化得到GABA制品。相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。但是，若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的种种问题。

根据最新的研究报道和专利文献，乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物在GABA类食品的制备中已有应用，这就使得生物合成的GABA制品能用作高档功能性保健食品的配料。

3.谷氨酸固相生物酶脱羧合成法：

   将来源于乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等具有脱羧酶的基因片段进行重组，制备具有高表达的脱羧酶工程菌，经发酵倍增培养，收集细菌，细胞破碎，蛋白分离纯化，获得高纯度、高活性单一生物谷氨酸脱羧酶。再与谷氨酸钠进行脱羧反应生成γ-氨基丁酸。

合成工艺总结：

γ-氨基丁酸有合成法和发酵及固相生物酶法。1.合成法，成本较高，得率较低。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。2.发酵法，使用大肠杆菌作为菌种。发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、硫酸镁和氯化钠等。以豆油为消沫剂，用量约为0.1%，发酵单位约为100酶单位/ml发酵液。在提炼过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为γ-氨酪酸在水溶液中能解离成阳离子的特性，采用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行离子交换，氨水洗脱，提取，再经树脂纯化，浓缩、结晶、干燥后即得成品。但是，若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的种种问题。3.固相生物酶法，谷氨酸脱羧酶将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸在水溶液中能解离成阳离子的特性，采用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行离子交换，氨水洗脱，提取，再经树脂纯化，浓缩、结晶、干燥后即得成品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的γ-氨基丁酸的生产制备工艺。由谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法。该工艺反应专一、产率高、纯度好、周期短、能耗低、适合工业化生产。

简单的说，本发明提供一种改进的γ-氨基丁酸的生产制备工艺，包括以下步骤：（1）将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸，再通过离心或过滤的方法分离生物固相酶与反应液；（2）反应液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的阳离子，生成纯化γ-氨基丁酸；（3）向γ-氨基丁酸水溶液加入活性炭脱色，脱炭后浓缩得γ-氨基丁酸浓溶液；

（4）向γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色γ-氨基丁酸粉末。其中，所述的步骤（1）的条件为：将谷氨酸钠溶于水中，加固相酶，25～55℃保温搅拌，同时滴加1:1盐酸稀释液（市售盐酸与水的体积比，下同）维持反应液pH值3.5～7.5，每隔30分钟取样检测谷氨酸钠含量，确定反应转化率；生成γ-氨基丁酸转化率达到99%时，过滤或离心使反应液与固相酶分离，而终止反应。固相酶进下一批套用，反应液交下工序处理。所述的步骤（1）谷氨酸钠与固相酶的比例为：100～1000mmorl谷氨酸钠与10～100kU生物效价的固相酶。所述的步骤（2）的条件优选为：将反应液缓慢流过强酸性离子交换树脂（树脂当量为阳离子当量110%），然后用纯水洗到中性，用2M（M为浓度单位morl/L的缩写，mM为mmorl/L，下同）稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计。树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用。所述的步骤（2）树脂与氯化钠比为：210：100（当量比）。所述的步骤（3）的条件优选为：氨水洗脱液置脱色罐中，加入活性炭，搅拌30分钟，0.22μm钛棒过滤脱碳。滤液至真空薄膜浓缩器中；真空赶氨，然后60℃真空薄膜浓缩到γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml时，加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀，搅拌冷却至室温，离心分离，95%酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时。检验包装。离心母液，回收酒精套用。所述的步骤（3）γ-氨基丁酸水溶液与活性炭配比为：100:1～5（重量比）。所述的步骤（4）条件优选为：所述的步骤（4）γ-氨基丁酸浓缩液与95%酒精配比为：1:5～10（体积比）。

以下是本发明的详细描述：

本发明技术为现有技术的改进，总体路线背景技术中方法3的路线，但由于做了种种改进，使之达到了产业化生产的需要，具体如下步骤：

（1）生物合成：将谷氨酸钠加水溶解加固相酶，25～55℃保温搅拌，同时滴加1:1盐酸稀释液维持反应液pH值3.5～7.5，每隔30分钟（在工业化生产中，可根据实际情况调整时间）取样检测谷氨酸钠含量，确定反应转化率；生成γ-氨基丁酸转化率达到99%时（如果生成γ-氨基丁酸转化率低于99%或更低时，由于未转化的谷氨酸会随反应物进入γ-氨基丁酸的产品中，从而影响γ-氨基丁酸的质量，降低纯度），离心或过滤使反应液与固相酶分离，而终止反应。实验室可采用过滤分离方式，工业化生产时可采用离心分离方式。分离的固相酶进下一批套用，分离的反应液交下工序处理。反应方程式如下：

 

反应液中谷氨酸钠摩尔浓度为100～1000mmorl/L，各组分比例为：100～1000mmorl谷氨酸钠与10～100kU生物效价的固相酶。

（2）分离纯化：将反应液缓慢流过强酸性离子交换树脂（树脂与氯化钠比为：210：100（当量比），纯水洗到中性，用2M稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计。树脂用纯水洗到中性，再用盐酸再生备用。所述的步骤（2）树脂与氯化钠比为：210：100（当量比）。

（3）脱色浓缩：氨水洗脱液置脱色罐中，加入活性炭，搅拌30分钟，0.22μm钛棒过滤脱碳。滤液至真空薄膜浓缩器中；真空赶氨，然后60℃真空薄膜浓缩到γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml时。所述的步骤（3）γ-氨基丁酸与活性炭的配比为：100:1～5（重量比）。

（4）结晶干燥：向γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，浓溶液与95%酒精配比为：1∶5～10（体积比），析出γ-氨基丁酸白色沉淀，搅拌冷却至室温，离心分离，95%酒精洗涤，甩干，60℃真空干燥6小时。检验包装。离心母液，回收酒精套用。其中，本步骤（4）的过程为在10万级洁净环境下进行。

本发明，所述固相酶可由如下工艺制备：

（A）谷氨酸脱羧酶的基因克隆及表达：

根据短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶（GAD）的基因序列设计以下引物：引物一：AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT 和引物二：AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG，引物一和引物二分别含有内切酶位点Nde I和Hind III，利用引物一和引物二根据Bio-Rad公司的iProof DNA聚合酶的说明书扩增谷氨酸脱羧酶的基因片段，扩增片段经前述内切酶消化后，连接到前述内切酶预消化的载体pRSET-A（Invitrgen，美国）上成为质粒pRSET-A GAD，该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液（LB培养液的成份为：每1000ml培养液含：16克胰蛋白胨，10克酵母粉，5克氯化钠），37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体；

（B）酶的纯化与固定化：

GAD的纯化与固定化：取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液（20mM, pH7.4）悬浮，800bar高压破碎两次，加5M磷酸钾溶液（pH7.0）至终浓度为1.2M，缓慢搅拌下加适量1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液（具体加量依小试结果而定）使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量；以约每10mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体（市售产品），室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）、含1M 氯化钠的20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）及20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）洗涤，最后，测定固相酶的活性。

本发明，具有反应专一、产率高、纯度好、周期短、能耗低等特点，适合工业化生产。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，本发明保护范围并不受这些实施例的限制。

实施例1

称18.7g谷氨酸钠（一水）加入1000ml纯化水溶解，用1:1盐酸稀释液调pH=5.5，加入10kU固相酶，使谷氨酸钠浓度为100mmols/L，水浴加热，37℃保温搅拌反应，不断补加1:1盐酸稀释液维持反应液pH=5.5。每隔30分钟取样检测谷氨酸钠含量，确定反应转化率；生成γ-氨基丁酸转化率达到99%时，过滤使反应液与固相酶分离。 

将滤液缓慢流过强酸性离子交换树脂（树脂当量为0.21 morl），然后用纯水洗脱，待洗到中性，用2M稀氨水洗脱，氨水用量以树脂当量计。

氨水洗脱液，加入0.5g活性炭，搅拌30分钟，0.22μm滤膜过滤脱碳。滤液至旋转薄膜浓缩器，60℃真空浓缩到γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml时。

加入95%酒精100ml，析出γ-氨基丁酸白色沉淀，搅拌冷却至室温，抽滤，95%酒精洗涤，60℃真空干燥6小时。得8.76gγ-氨基丁酸。

实施例2

称93.5g谷氨酸钠（一水）加水500ml及50kU固相酶用纯水稀释到1000ml，使谷氨酸钠浓度为500mmols/L。水浴加热，37℃保温搅拌反应，不断补加1:1盐酸稀释液维持反应液pH=5.5。每隔30分钟取样检测谷氨酸钠含量，确定反应转化率；生成γ-氨基丁酸转化率达到99%时，过滤使反应液与固相酶分离。

将滤液缓慢流过强酸性离子交换树脂（树脂当量为1.1morl），然后用纯水洗脱，待洗到中性，用2M稀氨水洗脱。

氨水洗脱液，加入2.0g活性炭，搅拌30分钟，0.22μm滤膜过滤脱碳。滤液至旋转薄膜浓缩器； 60℃真空浓缩到γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml时。

加入95%酒精500 ml，析出γ-氨基丁酸白色沉淀，滤液搅拌冷却至室温，抽滤，95%酒精洗涤，60℃真空干燥6小时。得43.85gγ-氨基丁酸。

实施例3

称1000mmols谷氨酸钠（一水）187.0g，加水500ml及100kU固相酶，用纯水稀释到1000ml，使谷氨酸钠浓度为1000mmols/L。水浴加热，37℃保温搅拌反应，不断补加1:1盐酸稀释液维持反应液pH=5.5。每隔30分钟取样检测谷氨酸钠含量，确定反应转化率；生成γ-氨基丁酸转化率达到99%时，过滤使反应液与固相酶分离。

将滤液缓慢流过强酸性离子交换树脂（树脂当量为2.1morl），然后用纯水洗脱，待洗到中性，用2M稀氨水洗脱。

氨水洗脱液，加入4.0g活性炭，搅拌30分钟，0.22μm滤膜过滤脱碳。滤液至旋转薄膜浓缩器； 60℃真空浓缩到γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml时。

加入95%酒精1000 ml，析出γ-氨基丁酸白色沉淀，滤液搅拌冷却至室温，抽滤，95%酒精洗涤，60℃真空干燥6小时，得89.0gγ-氨基丁酸。

实施例4

谷氨酸脱羧酶的基因克隆及表达固相化工艺描述

根据短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶（GAD）的基因序列设计以下引物：

引物一：AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT 和

引物二：AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG，

引物一和引物二分别含有内切酶位点Nde I和Hind III。利用引物一和引物二根据Bio-Rad公司的iProof DNA聚合酶的说明书扩增谷氨酸脱羧酶的基因片段，扩增片段经前述内切酶消化后，连接到前述内切酶预消化的载体pRSET-A（Invitrgen，美国）上成为质粒pRSET-A GAD。

该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液（LB培养液的成份为：每1000ml培养液含：16克胰蛋白胨，10克酵母粉，5克氯化钠）。37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞。大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体。

GAD的基因序列为：

        1 atggctatgt tatatggtaa acacacgcat gaaacagatg agacgctcaa accaatcttc

       61 ggggccagcg ctgaacgcca cgacctcccc aaatataaat tggcaaagca cgcgctcgag

      121 ccccgtgaag ccgatcgatt ggttcgcgat caactattgg atgaaggaaa ctcgcggctg

      181 aatctcgcca cgttctgtca gacttacatg gaaccggaag cggttgaact catgaaagat

      241 acactggaga aaaacgccat cgataaatcc gagtatcctc ggaccgctga aattgaaaat

      301 cgttgcgtta atatcattgc caacctctgg catgctccag aagctgagtc gttcactggc

      361 acctcgacga ttggttcctc cgaggcctgc atgctggccg gtttggcgat gaagtttgct

      421 tggcgtaagc gcgccaaagc gaacggtctt gacttaactg cccatcaacc taatattgtc

      481 atctcagccg gttatcaagt ttgttgggaa aaattctgtg tctattggga catcgacatg

      541 catgtcgttc ccatggacga tgaccacatg tccttgaatg tcgatcacgt gttagattac

      601 gtggatgact acaccattgg tatcgttggc attatgggca tcacttatac tggacaatac

      661 gacgatttag cccgattaga tgccgttgta gagcggtaca atcggacgac taagttcccg

      721 gtatatatcc atgtcgatgc cgcttccggc ggattttaca cgccgtttat tgaacccgag

      781 ctcaagtggg acttccgttt aaacaacgtg atttccatca atgcctccgg ccacaaatat

      841 ggcttggttt atcccggagt cggctgggta atctggcgtg accaacagta tctaccaaaa

      901 gagctggtct ttaaggtcag ctacttgggt ggtgaactac ctacgatggc catcaacttc

      961 tcccacagtg cctcccaatt aatcggtcag tattacaact ttattcgctt tggttttgat

     1021 ggctatcgtg aaattcaaga aaaaactcac gacgttgccc gctatctcgc gaaatcgctc

     1081 actaaattag ggggcttttc cctcattaat gacggccacg agttaccgct gatctgttat

     1141 gaactcactg ccgattctga tcgcgaatgg accctctacg atttatccga tcggttatta

     1201 atgaagggct ggcaggttcc cacctatccc ttaccaaaaa acatgacgga ccgcgttatt

     1261 caacggatcg tggttcgggc tgactttggt atgagtatgg cccacgactt tattgatgat

     1321 ctaacccaag ccattcacga tctcgaccaa gcacacatcg ttttccatag tgatccgcaa

     1381 cctaaaaaat acggattcac tcactaa

GAD的蛋白质序列为：

        1 mamlygkhth etdetlkpif gasaerhdlp kyklakhale preadrlvrd qlldegnsrl

       61 nlatfcqtym epeavelmkd tleknaidks eyprtaeien rcvniianlw hapeaesftg

      121 tstigsseac mlaglamkfa wrkrakangl dltahqpniv isagyqvcwe kfcvywdidm

      181 hvvpmdddhm slnvdhvldy vddytigivg imgitytgqy ddlarldavv erynrttkfp

      241 vyihvdaasg gfytpfiepe lkwdfrlnnv isinasghky glvypgvgwv iwrdqqylpk

      301 elvfkvsylg gelptmainf shsasqligq yynfirfgfd gyreiqekth dvarylaksl

      361 tklggfslin dghelplicy eltadsdrew tlydlsdrll mkgwqvptyp lpknmtdrvi

      421 qrivvradfg msmahdfidd ltqaihdldq ahivfhsdpq pkkygfth

酶的纯化与固定化

GAD的纯化与固定化：取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液（20mM, pH7.4）悬浮，800bar高压破碎两次，加5M磷酸钾溶液（pH7.0）至终浓度为1.2M，缓慢搅拌下加适量1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液（具体加量依小试结果而定）使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量。

以约每10mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体（市售产品），室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）、含1M 氯化钠的20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）及20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）洗涤。最后，测定固相酶的活性。

Claims (5)

1.一种谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）生物合成：将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸溶液，当谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸的转化率≥99%时，离心或过滤使反应液与固相酶分离，得γ-氨基丁酸水溶液；     

（2）分离纯化：生成的γ-氨基丁酸溶液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，最后稀氨水洗脱置换游离γ-氨基丁酸；

（3）脱色浓缩：氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，赶氨，真空薄膜浓缩，浓缩至γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml，得γ-氨基丁酸浓溶液；

（4）结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得γ-氨基丁酸白色粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在生物合成工艺中，所述底物谷氨酸钠摩尔浓度为100～1000mmorl/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述底物谷氨酸钠与固相酶的配比为100～1000mmorl谷氨酸钠与1～10万生物效价的固相酶。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：在生物合成工艺中，所述合成的底物溶液pH值为3.5～7.5；合成反应温度为25～55℃；反应液滤液与活性炭的重量配比为：100∶1～5；所述的γ-氨基丁酸浓溶液与95%酒精的体积比为1∶5～10；结晶干燥的过程为在10万级洁净环境下进行。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述固相酶由如下工艺制备：

（A）谷氨酸脱羧酶的基因克隆及表达：

根据短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶（GAD）的基因序列设计以下引物：引物一：AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT 和引物二：AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG，引物一和引物二分别含有内切酶位点Nde I和Hind III，利用引物一和引物二根据Bio-Rad公司的iProof DNA聚合酶的说明书扩增谷氨酸脱羧酶的基因片段，扩增片段经前述内切酶消化后，连接到前述内切酶预消化的载体pRSET-A（Invitrgen，美国）上成为质粒pRSET-A GAD，该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液，37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体；

（B）酶的纯化与固定化：

GAD的纯化与固定化：取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液（20mM, pH7.4）悬浮，800bar高压破碎两次，加5M磷酸钾溶液（pH7.0）至终浓度为1.2M，缓慢搅拌下加1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量；以每10mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体，室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）、含1M 氯化钠的20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）及20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）洗涤，最后，测定固相酶的活性。