CN103205469A - 一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用香蕉生物酶法生产
γ
-
氨基丁酸的方法，将香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入1～3L浸提液，均匀搅拌后在4～25
℃
条件下静置
提取3～5h；5000～7000rpm离心5～10min后，得谷氨酸脱羧酶粗酶液；1L酶液中加入30～50g谷氨酸及谷氨酸钠（pH值4.5～6.0），37
℃
条件下12～24h即可转化完全；加入0.1%～3.0%活性炭搅拌30～60min，过滤，旋蒸结晶得20～40g
γ
-
氨基丁酸。该生产工艺简单、反应专一、成本低、产率高、纯度好、周期短、浸提液可反复使用、废弃物少、环保，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物转化酶法合成技术领域，具体涉及利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)广泛存在于原核和真核生物中，是一种胞内酶，主要存在于细胞质中，与辅因子磷酸吡哆醛（PLP）结合催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸和CO
2
。在植物中，GAD的C末端具有特殊的与钙调蛋白(CaM)结合的区域，能够与CaM结合并增加酶的活力。香蕉谷氨酸脱羧酶的分子量为56kD，香蕉谷氨酸脱羧酶基因cDNA的ORF全长l500bp，编码499个氨基酸。
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 分子式为C
4
H
9
NO
2
，是一种天然的非蛋白质的游离氨基酸活性成分，广泛分布于动植物体内。植物如豆属、参属以及一些中草药等的种子和根茎中都含有GABA。在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中，其中脑组织中的含量大约为0.1～0.6mg/g组织，免疫学研究表明，大脑黑质中的GABA浓度最高。GABA可以与GABAA受体、GABAB受体、GABAC受体3种不同受体结合, 导致细胞膜离子通透性变化,会产生不同的调节性影响。研究表明GABA具有降血压、抗焦虑、降低血氨、抗癫痫、调节免疫、改善脂质代谢、防止动脉硬化、减肥、促进乙醇代谢、防止皮肤老化、消除体臭、健脑益智等功能，能够用作尿毒症、睡眠障碍以及CO中毒的治疗药物。
GABA可以开发为保健食品，也可以开发为具有显著药理作用的药物，前景非常乐观，因而GABA正越来越引起人们的关注。然而GABA天然存在量低，且从动植物组织中大量提取分离难度非常大，目前已知的制取GABA的方法有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法和酶法。一、化学合成法主要有：（1）通过γ-氯丁氰的取代水反应来合成，将邻苯二甲酰亚氨钾与γ-氯丁氰在180℃反应，然后将产物与浓硫酸回流，再结晶提纯而得；（2）由吡咯烷酮经氢氧化钙、碳酸氢铵水解开环制得；（3）以丁内酯为起始原料，经过氯化酯化反应，生成4-氯丁酸甲酯，再经氨解和皂化反应制得GABA。化学合成方法条件剧烈，且有化学物质残留，成本较高，主要应用于化工和医药领域，不适合在食品中应用。二、微生物发酵法主要是用筛选法或者基因重组法得到具有高GAD活性的大肠杆菌、曲霉和乳酸菌等微生物来发酵生产GABA。微生物发酵法生产周期较长，副反应多，分离纯化较复杂。三、植物富集法主要是用含米胚芽的糙米或者米糠、辣椒、蜜柑、番茄、南瓜、茄子、豆芽等来生产富含GABA食品等。此法可使水果蔬菜等的加工深度得到提升，提高水果蔬菜等的附加值，但加工复杂。四、酶法主要有两种：（1）将微生物中的GAD提取后得到的粗酶液或者纯酶液作用于谷氨酸生产GABA；（2）将植物中的GAD提取后得到的粗酶液或者纯酶液作用于谷氨酸生产GABA。酶法生产GABA具有周期短、副反应少、纯度高等优点。
近年来，GABA的生理作用被不断发现，其应用也越来越广泛。研究开发低成本且适合大规模工业化生产食品药品级GABA的技术方法，意义重大。本发明就是基于此背景诞生的。
发明内容
本发明的目的是提供一种从香蕉中提取谷氨酸脱羧酶用来制备γ-氨基丁酸的生产方法，该生产方法成本低、周期短、适于大规模工业化生产食品药品级γ-氨基丁酸。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
（1）将香蕉切碎研磨，然后在每1kg所述香蕉中加入1～3L浸提液，均匀搅拌后，于4～25℃静置提取3～5h，接着5000～7000rpm离心5～10min，所得上清液即为香蕉谷氨酸脱羧酶粗酶液，所述浸提液采用H
2
O、0.05～0.1mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.1～0.2mol/L NaCl、10～40mg/L CaCl
2
以及0.1～0.5mmol/L维生素B
6
或者0.1～0.5mmol/L磷酸吡哆醛配制而成，并保持pH值4.5～6.0，所述浸提液中的维生素B
6
或者磷酸吡哆醛能够缓解所述谷氨酸脱羧酶粗酶液的氧化；
（2）在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入10～30g/L谷氨酸及谷氨酸钠溶液0.5～1.0L，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应1～4h后，然后每隔0.5～2h分批添加1～5g谷氨酸及谷氨酸钠继续反应，直至谷氨酸脱羧酶活性消失；
或者，在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应12～24h；
（3）步骤（2）反应完成后，在反应液中加入0.1％～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；
或者，将步骤（2）反应完成的反应液旋蒸至原反应液体积一半后，加入0.1～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；
（4）然后将步骤（3）的脱色液趁热过滤，过滤液40～80℃旋蒸至原过滤液体积的10～30%后，4～25℃冷却，重结晶，则得到γ-氨基丁酸。
在步骤（2）中，所述谷氨酸脱羧酶活性的测定采用Berthelot反应原理。
在步骤（1）前，设置香蕉成熟过程中测定谷氨酸脱羧酶酶活的步骤，使用的香蕉为国产或者进口的能食用的香蕉，从香蕉果肉中或连皮带果肉中提取谷氨酸脱羧酶进行测定，该测定采用Berthelot反应原理。
测定所述谷氨酸脱羧酶活性的方法包括:首先将200μL 0.1mol谷氨酸或谷氨酸钠溶液和100μL待测谷氨酸脱羧酶液在30℃反应0.5h，然后将反应液置于冰浴中，并加入200μL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸缓冲液终止反应，再加入1.0mL 6%苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反应10 min，然后迅速在冰浴中冷却20 min，于分光光度计上在630nm处测定吸光值。
在步骤（2）中，所述谷氨酸、谷氨酸钠采用分批添加的方式。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：从香蕉中提取谷氨酸脱羧酶，催化谷氨酸或谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸并提纯出，该酶法生产工艺简单，操作方便，反应专一，成本低，产率高，纯度好，周期短，浸提液可反复使用，废弃物少，环保，能够大规模生产出γ-氨基丁酸，满足对食品药品级γ-氨基丁酸的需求。
附图说明
图1是4℃储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化图；
图2是25℃储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化图；
图3是37℃储存条件下香蕉谷氨酸脱羧酶活性变化图。
具体实施方式
下面进一步阐述本发明。
本发明中使用的原料是国产或者进口的能食用的香蕉、谷氨酸和谷氨酸钠。
实施例1
（1）配置浸提液：0.05mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.2mmol/L维生素B
6
或者磷酸吡哆醛PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉（连皮带果肉）切碎研磨，每1kg香蕉中加入2L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入15g谷氨酸或者谷氨酸钠，pH值控制在4.5～5.5，于37℃条件下，150r/min搅拌反应2～3h后每1h补加3～5g谷氨酸或者谷氨酸钠, pH值控制在5.0～5.5，如此重复进行，直至酶活性消失，这里酶活性的测定采用Berthelot反应原理；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）然后过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
在步骤（2）前，设置香蕉成熟过程中测定谷氨酸脱羧酶酶活的步骤，从香蕉果肉中或连皮带果肉中用浸提液提取谷氨酸脱羧酶进行测定，该测定采用Berthelot反应原理。通过Berthelot反应原理测定香蕉中谷氨酸脱羧酶的酶活后发现，如图1-3所示，购买的国产或进口香蕉在37℃条件下放置两天左右，酶活达最大值，此时作用于谷氨酸或者谷氨酸钠从而制得γ-氨基丁酸的产率最高。
运用Berthelot反应原理测定谷氨酸脱羧酶活性的方法包括:首先将200μL 0.1mol谷氨酸或谷氨酸钠溶液和100μL待测谷氨酸脱羧酶液在30℃反应0.5h，然后将反应液置于冰浴中，并加入200μL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸缓冲液终止反应，再加入1.0mL 6%苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反应10 min，然后迅速在冰浴中冷却20 min，于分光光度计上在630nm处测定吸光值。
实施例2
（1）配置浸提液： 0.08mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨, 每1kg香蕉中加入1L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入pH值在4.5～5.5的20g/L谷氨酸或者谷氨酸钠溶液500mL，于37℃条件下，150r/min搅拌反应1～2h后每1h补加3～5g谷氨酸或者谷氨酸钠，pH值控制在5.0～5.5，如此重复进行，直至酶活性消失；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
实施例3
（1）配置浸提液：0.05mol/L Na
2
HPO4/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.5；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入1.5L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心8min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入10g谷氨酸，pH值在5.0～5.5，于37℃条件下，120r/min搅拌反应1～2h后每1h补加3～5g谷氨酸，pH值控制在5.0～5.5，如此重复进行，直至酶活性消失；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、120r/min条件下搅拌脱色60min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
实施例4
（1）配置浸提液：0.05mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.5；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入1.5L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心8min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入10g谷氨酸钠，pH值在5.0～5.5，于37℃条件下，120r/min搅拌反应1～2h后每1h补加3～5g谷氨酸钠，pH值控制在5.0～5.5，如此重复进行，直至酶活性消失；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、120r/min条件下搅拌脱色60min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
实施例5
（1）配置浸提液：0.08mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入1L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入含有10g重量比约为1:3的谷氨酸和谷氨酸钠的pH值在4.5～5.5的溶液500mL，于37℃条件下，150r/min搅拌反应2～3h后每2h补加2～3g谷氨酸和谷氨酸钠， pH值控制在5.0～5.5，如此重复进行，直至酶活性消失；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
实施例6
（1）配置浸提液： 0.08mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入2L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g谷氨酸，pH值控制在5.0～5.5于37℃条件下，150r/min搅拌反应12～24h；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约25g γ-氨基丁酸。
实施例7
（1）配置浸提液： 0.08mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨， 每1kg香蕉中加入2L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g谷氨酸钠，pH值控制在5.0～5.5于37℃条件下，150r/min搅拌反应12～24h；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约25g γ-氨基丁酸。
实施例8
（1）配置浸提液： 0.08mol/L Na
2
HPO
4
/NaH
2
PO
4
、0.15mol/L NaCl、0.3mmol/L维生素B
6
或者PLP、30mg/L CaCl
2
，pH值5.7；
（2）将成熟的整根香蕉切碎研磨，每1kg香蕉中加入2L浸提液，搅拌均匀，于室温静置提取4小时；
（3）7000rpm离心10min后，上清即为谷氨酸脱羧酶液；
（4）向谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g重量比约为1:3的谷氨酸和谷氨酸钠，pH值控制在5.0～5.5于37℃条件下，150r/min搅拌反应12～24h；
（5）反应完成后，加入1%（w/v）活性炭于37℃、100r/min条件下搅拌脱色30min；
（6）过滤，55℃旋蒸至有少量晶体析出时，室温冷却结晶，重结晶，可得到约30g γ-氨基丁酸。
上述的制备方法中，从香蕉中提取谷氨酸脱羧酶，催化谷氨酸或谷氨酸钠转化为γ-氨基丁酸并提纯出，该酶法生产工艺简单，操作方便，成本低，周期短，能够大规模生产出γ-氨基丁酸，满足对食品药品级γ-氨基丁酸的需求。
Claims (5)
1.一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将香蕉切碎研磨，然后在每1kg所述香蕉中加入1～3L浸提液，均匀搅拌后，于4～25℃静置提取3～5h，接着5000～7000rpm离心5～10min，所得上清液即为香蕉谷氨酸脱羧酶粗酶液，所述浸提液采用H2O、0.05～0.1mol/L Na2HPO4/NaH2PO4、0.1～0.2mol/L NaCl、10～40mg/L CaCl2以及0.1～0.5mmol/L维生素B6或者0.1～0.5mmol/L磷酸吡哆醛配制而成，并保持pH值4.5～6.0，所述浸提液中的维生素B6或者磷酸吡哆醛能够缓解所述谷氨酸脱羧酶粗酶液的氧化；
（2）在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入10～30g/L谷氨酸及谷氨酸钠溶液0.5～1.0L，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应1～4h后，然后每隔0.5～2h分批添加1～5g谷氨酸及谷氨酸钠继续反应，直至谷氨酸脱羧酶活性消失；
或者，在上述步骤（1）制得的每1L谷氨酸脱羧酶液中加入30～50g谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4.5～6.0，于25～40℃，50～200r/min搅拌反应12～24h；
（3）步骤（2）反应完成后，在反应液中加入0.1％～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；
或者，将步骤（2）反应完成的反应液旋蒸至原反应液体积一半后，加入0.1～3.0%（w/v）活性炭于25～80℃、50～200r/min条件下搅拌脱色30～60min；
（4）然后将步骤（3）的脱色液趁热过滤，过滤液40～80℃旋蒸至原过滤液体积的10～30%后，4～25℃冷却，重结晶，则得到γ-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述谷氨酸脱羧酶活性的测定采用Berthelot反应原理。
3.根据权利要求1所述的一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：在步骤（1）前，设置香蕉成熟过程中测定谷氨酸脱羧酶酶活的步骤，使用的香蕉为国产或者进口的能食用的香蕉，从香蕉果肉中或连皮带果肉中提取谷氨酸脱羧酶进行测定，该测定采用Berthelot反应原理。
4.根据权利要求2或3所述的一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：测定所述谷氨酸脱羧酶活性的方法包括:首先将200μL 0.1mol谷氨酸或谷氨酸钠溶液和100μL待测谷氨酸脱羧酶液在30℃反应0.5h，然后将反应液置于冰浴中，并加入200μL 0.2 mol/L pH 9.0的硼酸缓冲液终止反应，再加入1.0mL 6%苯酚和400μL次氯酸钠溶液，充分振荡后，在沸水浴中反应10 min，然后迅速在冰浴中冷却20 min，于分光光度计上在630nm处测定吸光值。
5.根据权利要求1所述的一种利用香蕉生物酶法生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：在步骤（2）中，所述谷氨酸、谷氨酸钠采用分批添加的方式。
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| Title |
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| 张术聪: "固定化植物乳杆菌合成γ－氨基丁酸及分离纯化的初步研究", 《中国优秀硕士论文全文数据库 工程科技I辑》, no. 2, 15 February 2012 (2012-02-15), pages 12 * |
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