CN104561157A - 发酵法生产γ-氨基丁酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发酵法生产γ-氨基丁酸，包括以下步骤：将种子以？0.5%？接种量接种至？3？L？发酵培养基，发酵结束；于发酵液中直接投加L-谷氨酸，进行催化反应；按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min？以进行脱色，待浓缩液体积浓缩至15-19L时，停止浓缩，向浓缩液中加入3倍体积？95％的乙醇，过滤收集晶体，得到γ-？氨基丁酸成品。本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、易掌握，γ-？氨基丁酸制备过程中催化液总回收率为95.7-96.4％，产物纯度为99.3％，生产周期短，大大提高了发酵法生产γ-氨基丁酸的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
Description
（一）技术领域
本发明涉及γ-氨基丁酸，具体涉及发酵法生产γ-氨基丁酸。
（二）背景技术
γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，它是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，具有极其重要的生理功能，它能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。γ-氨基丁酸属强神经抑制性氨基酸，具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用。它是抑制性神经递质（Inhibitory Neurotransmitter），可以抑制动物的活动，减少能量的消耗。
γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。
化学合成法多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的γ-氨基丁酸不能用于食品，也不能被认为是一种天然食品添加剂。
生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法。在早期的研究中，发酵法生产γ-氨基丁酸以大肠杆菌为生产菌，发酵培养基为麸皮水解液、玉米浆、蛋白胨、矿物质等。在发酵过程中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，再分离纯化得到GABA制品。但是，若要进行食品开发，使用大肠杆菌无疑存在安全性方面的种种问题。根据最新的研究报道和专利文献，乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等一些安全性高的微生物在γ-氨基丁酸类食品的制备中已有应用，这就使得生物合成的γ-氨基丁酸制品能用作高档功能性保健食品的配料。
2013年09月18，公布的一种利用微生物发酵法生产 γ- 氨基丁酸的方法，公开了一种枯草芽孢杆菌（菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为 2011 年12 月 08 号，菌种保藏编号为 CGMCC No. 5550，菌种分类命名为枯草芽孢杆菌，英文名称为Bacillus subtilis）。通过微生物（枯草芽孢杆菌）发酵法生产 γ- 氨基丁酸， γ- 氨基丁酸含量不低于 55%。
但是上述发酵法生产γ-氨基丁酸，周期均过长，严重影响对γ-氨基丁酸供应，需要改进。
（三）发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种发酵法生产γ-氨基丁酸，操作方便，过程易于控制，反应时间短，产物纯度高，有利于工业化生产。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种发酵法生产γ-氨基丁酸，其特殊之处在于：包括以下步骤：
（1）种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，1.5% 琼脂粉，pH 7.0，
枯草芽孢杆菌的种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0，121℃下灭菌 20 min ，培养温度为 37℃，
从平板上挑取一单菌落，接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中，于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h；
（2）枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基，发酵培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5g/L，氯化钙0.1g/L， Zn2+0.08-0.1g/L ，FeCl3 0.1-0.4g/L ，pH 自然，在转速 600rpm，通气量1.0 vvm，35-37℃，培养 0.4-2h 后，发酵结束；
（3）催化反应：
发酵结束后，于发酵液中直接投加w/v为60-65% 的L-谷氨酸，调节pH为4.5～4.8 进行催化反应，反应条件为 30-35℃催化 0.5-2h；
（4）脱色、提纯：催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min，灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温，处理液按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min 以进行脱色，将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜，控制膜管压力在0-0.3MPa 之间，流速 65L/h，收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为240L/h，收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为 250L/h，弃流出液，待浓缩液体积浓缩至15-19L时，停止浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入 3 倍体积 95％的乙醇，4℃静置0.8-1.5h，过滤收集晶体，再按 10ml/g 比例加入 95％乙醇，40℃搅拌10min，过滤收集晶体 ；将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min，得到 γ- 氨基丁酸成品。
本发明的有益效果：本发明用于生产乳果低聚糖操作简单、作用条件温和、易掌握，γ- 氨基丁酸制备过程中催化液总回收率为95.7-96.4％，产物纯度为 99.3％，生产周期短，大大提高了发酵法生产γ-氨基丁酸的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
（四）具体实施方式
实施例 1
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸，包括以下步骤：
（1）种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，1.5% 琼脂粉，pH 7.0，
枯草芽孢杆菌的种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0，121℃下灭菌 20 min ，培养温度为 37℃，
从平板上挑取一单菌落，接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中，于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h；
（2）枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基，发酵培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5g/L，氯化钙0.1g/L， Zn2+0.08g/L ，FeCl3 0.28g/L ，pH 自然，在转速 600rpm，通气量1.0 vvm，37℃，培养 0.4h 后，发酵结束；
（3）催化反应：
发酵结束后，于发酵液中直接投加w/v为60% 的L-谷氨酸，调节pH为4.5～4.8 进行催化反应，反应条件为 30℃催化 2h；
（4）脱色、提纯：催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min，灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温，处理液按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min 以进行脱色，将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜，控制膜管压力在0-0.3MPa 之间，流速 65L/h，收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为240L/h，收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为 250L/h，弃流出液，待浓缩液体积浓缩至15L时，停止浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入 3 倍体积 95％的乙醇，4℃静置0.8h，过滤收集晶体，再按 10ml/g 比例加入 95％乙醇，40℃搅拌10min，过滤收集晶体 ；将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min，得到 γ- 氨基丁酸成品。
实施例 2
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸，包括以下步骤：
（1）种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，1.5% 琼脂粉，pH 7.0，
枯草芽孢杆菌的种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0，121℃下灭菌 20 min ，培养温度为 37℃，
从平板上挑取一单菌落，接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中，于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h；
（2）枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基，发酵培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5g/L，氯化钙0.1g/L， Zn2+0.1g/L ，FeCl3 0.4g/L ，pH 自然，在转速 600rpm，通气量1.0 vvm，35℃，培养 1h 后，发酵结束；
（3）催化反应：
发酵结束后，于发酵液中直接投加w/v为65% 的L-谷氨酸，调节pH为4.5～4.8 进行催化反应，反应条件为 32℃催化 0.5h；
（4）脱色、提纯：催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min，灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温，处理液按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min 以进行脱色，将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜，控制膜管压力在0-0.3MPa 之间，流速 65L/h，收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为240L/h，收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为 250L/h，弃流出液，待浓缩液体积浓缩至15-19L时，停止浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入 3 倍体积 95％的乙醇，4℃静置1h，过滤收集晶体，再按 10ml/g 比例加入 95％乙醇，40℃搅拌10min，过滤收集晶体 ；将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min，得到 γ- 氨基丁酸成品。
实施例 3
本实施例发酵法生产γ-氨基丁酸，包括以下步骤：
（1）种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，1.5% 琼脂粉，pH 7.0，
枯草芽孢杆菌的种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0，121℃下灭菌 20 min ，培养温度为 37℃，
从平板上挑取一单菌落，接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中，于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h；
（2）枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基，发酵培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5g/L，氯化钙0.1g/L， Zn2+0.09g/L ，FeCl3 0.1g/L ，pH 自然，在转速 600rpm，通气量1.0 vvm，36℃，培养2h 后，发酵结束；
（3）催化反应：
发酵结束后，于发酵液中直接投加w/v为62.5% 的L-谷氨酸，调节pH为4.5～4.8 进行催化反应，反应条件为35℃催化 1h；
（4）脱色、提纯：催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min，灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温，处理液按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min 以进行脱色，将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜，控制膜管压力在0-0.3MPa 之间，流速 65L/h，收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为240L/h，收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为 250L/h，弃流出液，待浓缩液体积浓缩至15-19L时，停止浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入 3 倍体积 95％的乙醇，4℃静置1.5h，过滤收集晶体，再按 10ml/g 比例加入 95％乙醇，40℃搅拌10min，过滤收集晶体 ；将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min，得到 γ- 氨基丁酸成品。
Zn2+可以为ZnSO4、ZnCl2。
Claims (1)
1.一种发酵法生产γ-氨基丁酸，其特征在于：包括以下步骤：
（1）种子培养
枯草芽孢杆菌的平板培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，1.5% 琼脂粉，pH 7.0，
枯草芽孢杆菌的种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5 g/L，pH 7.0，121℃下灭菌 20 min ，培养温度为 37℃，
从平板上挑取一单菌落，接种至装有 150 ml 种子培养基的 500 ml 三角瓶中，于摇床上 200 rpm 37℃振摇培养 14 h；
（2）枯草芽孢杆菌的分批发酵
将种子以 0.5% 接种量接种至 3 L 发酵培养基，发酵培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 5 g/L，氯化钠 5g/L，氯化钙0.1g/L， Zn2+0.08-0.1g/L ，FeCl3 0.1-0.4g/L ，pH 自然，在转速 600rpm，通气量1.0 vvm，35-37℃，培养 0.4-2h 后，发酵结束；
（3）催化反应：
发酵结束后，于发酵液中直接投加w/v为60-65% 的L-谷氨酸，调节pH为4.5～4.8 进行催化反应，反应条件为 30-35℃催化 0.5-2h；
（4）脱色、提纯：催化液在发酵罐中升温至 121℃灭菌 30min，灭菌结束后通过发酵罐夹套循环水冷却至常温，处理液按照10％添加量添加孔径小于30nm的活性炭，90℃处理20min 以进行脱色，将脱色液流过孔径 0.2μm 的陶瓷微滤膜，控制膜管压力在0-0.3MPa 之间，流速 65L/h，收集的滤液通过管道流入装有截留分子量 300 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为240L/h，收集流出液通过管道流入装有截留分子量 100 道尔顿以下的高分子纳滤膜的膜管中，控制膜管压力在 0-1.5MPa 之间，流速为 250L/h，弃流出液，待浓缩液体积浓缩至15-19L时，停止浓缩，得浓缩液，向浓缩液中加入 3 倍体积 95％的乙醇，4℃静置0.8-1.5h，过滤收集晶体，再按 10ml/g 比例加入 95％乙醇，40℃搅拌10min，过滤收集晶体 ；将收集的晶体 100℃沸腾干燥20min，得到 γ- 氨基丁酸成品。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |