CN109134468A

CN109134468A - 提高枯草芽孢杆菌维生素b2产量的方法

Info

Publication number: CN109134468A
Application number: CN201810849520.8A
Authority: CN
Inventors: 胡勇干; 杨明玉; 刘延茂; 周秀桃
Original assignee: GUANGJI PHARMACEUTICAL (MENGZHOU) CO Ltd
Current assignee: GUANGJI PHARMACEUTICAL (MENGZHOU) CO Ltd
Priority date: 2018-07-28
Filing date: 2018-07-28
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体公开一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，包括以下步骤：1）在低于30℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至11‑12；2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝；3）依次采用离心分离和膜过滤对絮凝后的发酵液进行固液分离；4）将步骤3）固液分离得到的清液酸化、并加入晶种结晶，得到粗结晶，再经过多次再结晶，得到的晶体经水洗、烘干，得到成品。本发明通过对发酵液的提取步骤进行优化，提高维生素B₂的产量。

Description

提高枯草芽孢杆菌维生素B2产量的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法。

背景技术

维生素B₂又名核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。主要用于防治核黄素缺乏症，如口角炎、唇炎、舌炎和眼结膜炎等。近年来，也有研究表明，核黄素还具有利尿、降血脂和改善心脏功能等作用。核黄素的合成主要有化学合成法和微生物发酵法，由于化学合成法较为复杂而且生产成本较高，目前核黄素主要采用微生物发酵法进行生产。

枯草芽孢杆菌是常用的工业化发酵生产核黄素的菌株的一种。这些工程菌具有发酵周期短（2-3天）、原料要求简单、产量高的优点，在核黄素的微生物发酵生产中显示了强大的生命力。核黄素的分离提取方法主要有：重金属盐沉淀法、Morehouse法、酸溶法和碱溶法。目前工业生产中多采用后两种方法。由于酸溶法能耗较大，总收率较低，因此，许多生产商开始把注意力投入碱溶法，也有利用碱溶法和酸溶法相结合的提取工艺。

虽然从发酵液中提取核黄素方法众多，但是收率不是很高，分析其主要原因是过程很长，各个过程中都有结晶母液出现，而母液中核黄素含量很高，并不是简单按核黄素的溶解度而存在，远远高于其溶解度，因此母液的回收没有处理好，其收率损失相应地增大；其次，固体杂质的分离很困难，并且这种困难贯穿于整个过程。在杂质分离过程中，由于碱溶后菌体细胞破裂，产生很多胶体物质，导致溶液粘度上升，且菌体本身细小，用传统板框过滤很困难，用膜分离的方法易堵塞膜孔，浓缩比低，膜清洗复原困难，导致成本很高。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，通过对发酵液的提取步骤进行优化，提高维生素B₂的产量。

本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，包括以下步骤：

1）在低于30℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至11-12；

2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝；

3）依次采用离心分离和膜过滤对絮凝后的发酵液进行固液分离；

4）将步骤3）固液分离得到的清液酸化、并加入晶种结晶，得到粗结晶，再经过多次再结晶，得到的晶体经水洗、烘干，得到成品。

根据本发明，经研究发现用碱液调节发酵液的pH时，当pH高于10之后，pH的上升幅度减缓，当发酵液pH值接近10.5后，再上升就十分困难，这是由于在加碱过程中，菌体细胞在碱性条件下极不稳定，很容易被破碎，细胞内的胶体大分子释放到溶液中，一方面导致溶液粘度大幅度上升，另一方面菌体的破裂使发酵液形成大的缓冲系统，使发酵液pH值上升缓慢。因此，本发明采用在强制搅拌下，快速加入碱液，尽可能防止菌体破裂，采用该方法不仅可减少菌体破裂，降低发酵液粘度，还能显著减少碱用量。

另外，核黄素在碱性条件下对光、对热不稳定，在中性溶液中见光分解为光色素和核糖；而在碱性溶液中见光分解为光黄素，并且随着温度升高，其分解量增加；经实验研究表明：核黄素在不同温度下的保留量的确是随着温度升高而降低，当温度高于30℃之后，核黄素分解加速，保留量迅速减少，可见，温度对核黄素稳定性的影响是十分显著的。因此，本发明限定碱处理过程中的温度不高于30℃。

在相同温度和作用时间下，发酵液pH值越高，核黄素保留量越少，即稳定性越差；而且，pH值越高，核黄素保留量随作用时间延长减少得也越快，另外综合pH对核黄素溶解度的影响，选择pH值为10-12，步骤1）中，优选控制碱处理过程的时间小于40min。

根据本发明，絮凝作用应在最适宜温度条件下进行，通常适度提高温度有利于絮凝效果，其主要原因是：首先，温度升高使得体系中的胶体性质发生变化，促进絮团的生成和沉淀；其次，温度升高，料液粘度变小，使絮团容易沉淀；再次，温度升高分子运动速度加快，加速了絮团形成速度。但是，温度过高时，化学反应速度过快，形成的絮凝体细小，并使絮凝体的水合作用增加，同时能耗增大；温度过低，絮凝剂的水解反应变慢，水解时间过长，效率降低；同时温度低，发酵液粘度变大，也会增加水对絮凝体的撕裂作用，使絮凝体变得细小，不易分离。同时考虑到核黄素的稳定性以及絮凝作用的性质，优选絮凝温度低于30℃。

絮凝是—个复杂的化学动力学过程，搅拌方式对絮凝效果有很大的影响。搅拌的目的在于使絮凝剂在发酵液中分散均匀，以便和发酵液充分接触。如果搅拌速度慢且时间短，即搅拌不充分，则絮凝剂和菌体微粒不能充分混合，从而影响絮凝效果。但如果形成絮团后仍然快速地长时间搅拌，则会使已形成的絮团发生破碎，影响絮凝效果。因此，选择合适的搅拌速度与时间，对于加速絮凝作用，充分发挥絮凝剂效果是十分重要的。优选地，搅拌速度为40-80r/min，搅拌时间为2-4min。进一步优选地，搅拌速度为60r/min，搅拌时间为3min。

本发明中，絮凝剂优选为氯化钙和磷酸氢二钠，采用氯化钙和磷酸氢二钠作为絮凝剂能生成庞大的凝胶沉淀即磷酸钙沉淀，能把蛋白质、菌体、菌体碎片及其它不溶性粒子吸附其中，并且多余的磷酸根还能去除钙、镁离子。优选地，磷酸氢二钠与氯化钙的质量比为1︰1.5~4，进一步优选为1︰3。絮凝剂的用量为0.5-2wt%，优选为1.5wt%。沉降时间为20-40min，30min沉降效果最好。

根据本发明，由于发酵液粘度大，悬浮菌体及其碎片等体积微小，相对密度与水接近，采用普通的滤纸过滤和抽空过滤分离时存在困难，无法进行，显然不可取。而离心分离具有时间短，分离效果好，为提高最终核黄素的纯度，优选固液分离方式为离心分离之后，再进行膜过滤。

优选地，离心分离的转速为2000-4000r/min，离心时间为5-10min。

本发明中，采用盐酸溶液将清液的pH值调节至4-5，加入晶种，混匀后放置12-24h。

优选地，盐酸溶液的浓度为5-7mol/L，采用缓慢滴加的方式对清液的pH进行调节，滴加过程中的搅拌速度为300-700r/min。

本发明中可选用干燥的核黄素标准品少许，加入少量水，搅拌，低速离心除去大颗粒，将其倒入待结晶的絮凝清液中，轻轻混匀后放置结晶。离心分离结晶后母液，得核黄素粗结晶，然后经过多次再结晶，优选采用5-6倍晶体体积的蒸馏水对晶体进行水洗，再在70-90℃下烘干，优选为80℃。

按照本发明的一种优选实施方式，提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法包括：从核黄素的稳定性出发，碱溶处理过程中加碱量应选择pH值为11.2，温度低于30℃，碱处理过程小于40min；絮凝时选用配比为1︰3的Na₂HPO₄和CaCl₂作为絮凝剂，添加量为1.5wt%，絮凝温度低于30℃，搅拌速度为60r/min，搅拌时间为3min。固液分离采用转速为3000r/min，离心分离时间为5min。酸化结晶时采用6mol/L的盐酸溶液调节固液分离所得清液的pH值至4.5左右，加酸速度要慢，搅拌速度300-700r/min。

本发明还包括其它能够实现维生素B₂分离提取的工艺参数，均属于本领域的常规技术手段。

本发明的方法通过控制枯草芽孢杆菌维生素B₂的提纯步骤工艺，制得的粗品的收率达到95.3%，维生素B₂产品纯度达到99.5%以上，综合收率大于86.8%，生产成本和产品质量均有较大优势，实现维生素B₂产量的提高。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1-3用于说明本发明的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法。

实施例1

一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，包括以下步骤：

1）在28℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至10.5，控制碱处理过程的时间为35min；

2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝，絮凝步骤的条件包括：温度为28℃，搅拌速度为60r/min，搅拌时间为3min，沉降时间为30min；选用的絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠与氯化钙的质量比为1︰3，絮凝剂的用量为1.5wt%；

3）依次采用离心分离和膜过滤对絮凝后的发酵液进行固液分离；离心分离的转速为3000r/min，离心时间为5min，

4）将步骤3）固液分离得到的清液酸化、并加入晶种结晶，混匀后放置20h，分离得到粗结晶，再经过多次再结晶，得到的晶体经水洗、烘干，得到成品；采用盐酸溶液将清液的pH值调节至4.5，盐酸溶液的浓度为6mol/L，采用缓慢滴加的方式加入清液，滴加过程中的搅拌速度为500r/min，采用5-6倍晶体体积的蒸馏水对晶体进行水洗，再在80℃下烘干。

采用上述方法制得的维生素B₂产品纯度为99.8%，综合收率为88.2%。

实施例2

1）在25℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至11.2，控制碱处理过程的时间为30min；

2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝，絮凝步骤的条件包括：温度为28℃，搅拌速度为40r/min，搅拌时间为4min，沉降时间为40min；选用的絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠与氯化钙的质量比为1︰4，絮凝剂的用量为1wt%；

3）依次采用离心分离和膜过滤对絮凝后的发酵液进行固液分离；离心分离的转速为2000r/min，离心时间为8min，

4）将步骤3）固液分离得到的清液酸化、并加入晶种结晶，混匀后放置15h，分离得到粗结晶，再经过多次再结晶，得到的晶体经水洗、烘干，得到成品；采用盐酸溶液将清液的pH值调节至4，盐酸溶液的浓度为5mol/L，采用缓慢滴加的方式加入清液，滴加过程中的搅拌速度为300r/min，采用5-6倍晶体体积的蒸馏水对晶体进行水洗，再在75℃下烘干。

采用上述方法制得的维生素B₂产品纯度为99.6%，综合收率为87.6%。

实施例3

1）在26℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至11.7，控制碱处理过程的时间25min；

2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝，絮凝步骤的条件包括：温度为28℃，搅拌速度为80r/min，搅拌时间为2min，沉降时间为20min；选用的絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠与氯化钙的质量比为1︰2，絮凝剂的用量为2wt%；

3）依次采用离心分离和膜过滤对絮凝后的发酵液进行固液分离；离心分离的转速为4000r/min，离心时间为5min，

4）将步骤3）固液分离得到的清液酸化、并加入晶种结晶，混匀后放置24h，分离得到粗结晶，再经过多次再结晶，得到的晶体经水洗、烘干，得到成品；采用盐酸溶液将清液的pH值调节至5，盐酸溶液的浓度为7mol/L，采用缓慢滴加的方式加入清液，滴加过程中的搅拌速度为700r/min，采用5-6倍晶体体积的蒸馏水对晶体进行水洗，再在85℃下烘干。

采用上述方法制得的维生素B₂产品纯度为99.5%，综合收率为87.2%。

以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的实施例。在不偏离所说明实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）在低于30℃、避光和强制搅拌下，将碱液快速加入发酵液，使发酵液的pH值调节至10-12；

2）将碱处理后的发酵液加入絮凝剂进行絮凝；

2.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：步骤1）中，控制碱处理过程的时间小于40min。

3.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：絮凝步骤的条件包括：温度低于30℃，搅拌速度为40-80r/min，搅拌时间为2-4min，沉降时间为20-40min。

4.根据权利要求1或3所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：絮凝剂为氯化钙和磷酸氢二钠，磷酸氢二钠与氯化钙的质量比为1︰1.5~4，絮凝剂的用量为0.5-2wt%。

5.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：离心分离的转速为2000-4000r/min，离心时间为5-10min。

6.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：采用盐酸溶液将清液的pH值调节至4-5，加入晶种，混匀后放置12-24h。

7.根据权利要求6所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：盐酸溶液的浓度为5-7mol/L，采用缓慢滴加的方式对清液的pH进行调节，滴加过程中的搅拌速度为300-700r/min。

8.根据权利要求1所述的提高枯草芽孢杆菌维生素B₂产量的方法，其特征在于：采用5-6倍晶体体积的蒸馏水对晶体进行水洗，再在70-90℃下烘干。