CN103102417B - 一种重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种分离纯化重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的方法，该方法包括将含CHO细胞表达重组人干扰素α2b-CTP的澄清丰收液采用以下层析方法（a）蓝胶染料亲和层析；（b）阳离子层析；（c）阴离子层析进行纯化。蓝胶染料亲和层析能使丰收液无需稀释直接上柱进行纯化，并稳定重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白，阳离子层析可以去除非干扰素类杂蛋白，阴离子层析可去除与目的蛋白同源的不同糖基化程度的干扰素类杂蛋白。

Description

一种重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的纯化方法

技术领域

 本发明属于蛋白质纯化领域。本发明适用于重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的少量制备及大规模生产纯化。

背景技术

重组人干扰素α2b被广泛应用于临床疾病的治疗中。作为一种广谱的细胞因子类抗病毒药物，它对如乙型肝炎、尖锐湿疣等有很好的疗效，同时重组人干扰素α2b还具有抗增殖的作用，它对多种肿瘤也有较好治疗效果。但重组人干扰素α2b的副作用较多，半衰期短，给病人增加了疾病之外的痛苦的同时，也影响了其疗效的发挥。重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白是为使干扰素在体内获得较长半衰期而开发的新型干扰素。CTP为人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽，该肽链可以增加重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白唾液酸含量并提高蛋白质糖基化程度，增加分子量，因此可以获得更长的药物体内半衰期。延长半衰期减少注射频率，可以很大程度上减少病人的额外痛苦，进而更好的发挥了治疗能力。重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白采用真核表达体系，因为其主要部分为干扰素，所以主要表现为干扰素的理化性质，同时又因为真核表达体系的翻译修饰功能而具有了糖基化修饰。

200710099325.X公开了一种由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白，该融合蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有干扰素α2b活性的由(a)衍生的蛋白质。与已公开的同类融合蛋白(如美国HGS公司的Albuferon)不同，该融合蛋白中干扰素部分处于融合蛋白的N末端而人血清白蛋白部分处于融合蛋白的C末端。由于以上改进使得该融合蛋白比Albuferon具有更好的均一性，更高的稳定性和更高的回收率。该融合蛋白也具有长效性，可用于治疗多种肿瘤及病毒性疾病，但这种蛋白分子量较大，不利于到达靶位发挥作用。

200480039723.7公开了纯化β-干扰素的方法，该方法包括进行亲和层析和阳离子交换层析，其中亲和层析包括：将含有 β-干扰素的培养物吸附到平衡的亲和层析柱上，接着用平衡缓冲液洗涤；用洗涤缓冲液A和洗涤缓冲液B洗涤柱子，所述洗涤缓冲液A的pH为 6.5-7.5，包含30-60重量％的丙二醇，所述洗涤缓冲液B的pH为6.5-7.5，包含10-30重量％的丙二醇和1-2M NaCl；用pH为6.5-7.5的包含40-60 重量％的丙二醇和1-2M NaCl的缓冲液洗脱包含人β-干扰素的级分。这种用于纯化干扰素的方法步骤较多，比较繁琐，不利于大规模工业生产的经济要求。

 2002108974.4公开了一种酵母表达重组人干扰素α2b的纯化方法，该重组人干扰素α2b采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体表达系统，目标蛋白重组人干扰素α2b不需要复性，其生物比活性可达到1.0×10⁹单位/毫克蛋白，低毒副作用；在纯化过程中，不需要价值昂贵的单抗柱，即可从发酵液中提取获得纯度达95％以上的目标蛋白重组人干扰素α2b，降低了生产成本。我们采用的哺乳动物细胞培养表达干扰素从理论上要优于酵母表达，而哺乳动物细胞有大量的水解酶，在酸性条件下，这些酶极容易被激活，进而破坏目的蛋白，所以要在第一步层析时将这些酶尽可能除去，而专利2002108974.4所采用的层析方法做不到这一点。

    综上，本发明在经济与技术角度上都显著优于已有专利，尤其对真核细胞培养的不同糖基化程度的蛋白有很好的分离效果。

发明内容

 本发明的目的之一是提供一种适合于大规模纯化真核细胞表达的重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的纯化方法，同时这种方法用于分离不同糖基化程度的重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白。可通过以下步骤实现：

含有重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的丰收液，离心去沉淀后，对上清进行超滤浓缩，浓缩后的上清经

（a）蓝胶染料亲和层析；

（b）阳离子层析；

（c）阴离子层析。

本发明的方法步骤（a）蓝胶染料亲和层析可允许丰收液上清不需稀释直接上样，这一优点因可有效减少上样液总体积进而拥有更低成本。

本发明的一个目的是去除蛋白水解酶。步骤（b）阳离子层析，是主要的去除杂蛋白的步骤，其主要的层析操作pH在酸性范围内，但由于哺乳动物细胞有死亡后会释放大量的水解酶，而这些酶在酸性条件下会被激活，进而破坏目的蛋白，所以为防止这一情况的发生，先采用步骤（a）蓝胶染料亲和层析，首先将一些水解酶先行去除。

蓝胶染料亲和层析常被用来纯化干扰素，其所使用的介质举例有Blue Sepharose 6 Fast Flow、Blue Sepharose CL-6B、HiTrap Blue HP等几种类型的填料。干扰素可以结合到Cibacron Blue F3G-A,这是一种合成的多环染料，其作用类似于芳香族的阴离子配基，通过静电力和/ 或疏水相互作用结合干扰素。利用蓝胶染料亲和层析，这一过程很容易放大生产。

丰收液经澄清处理后，经截留分子量为1万的超滤膜包超滤浓缩，不需稀释直接经蓝胶染料亲和层析。

蓝胶染料亲和层析说明书推荐上样液中有约0.15 M NaCl，这有助于排除部分非特异性吸附蛋白，而丰收液的电导相当于0.12 M NaCl,所以不需要额外加盐。蓝胶染料亲和层析纯化白蛋白推荐的pH为7.0。重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白要求在pH5.5-8.5，优选pH7.0-8.0。

    步骤（a）蓝胶染料亲和层析的净化可通过用3-4倍体积的70%的乙醇或者30%异丙醇冲洗柱子，去除结合很强的疏水性蛋白、脂蛋白和脂质等物质。另外也可以选择两倍柱体积的碱性或者酸性去污剂溶液，例如0.1%的非离子去污剂在1M乙酸溶液中，以较低的流速流过柱子，接下来用5倍柱体积的70%的乙醇出去残留的去污剂。立即用结合缓冲液再次平衡柱子。

步骤（a）蓝胶染料亲和层析不同pH层析效果不同，随pH升高染料配基与重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白结合力减弱，但洗脱回收率提高，步骤（a）洗脱盐浓度为0.5-2MNaCl，优选1.0-1.5 M NaCl。由于洗脱液中含有较高浓度的盐，会影响蛋白的稳定性，并且含高浓度盐的蛋白溶液不能直接进行步骤（b）阳离子层析，所以经步骤（a）蓝胶染料亲和层析后的洗脱液要经过脱盐处理。

    经步骤（a）蓝胶染料亲和层析的脱盐处理的方法是采用超滤置换法，其中超滤膜包的截留分子量为1万，超滤过程中控制进口端压力小于1.5bar。超滤的置换溶液为50mMpH7.1的PB缓冲液。等体积置换5-8次。

步骤（b）阳离子层析，包括使用强阳离子、弱阳离子型介质和复合型阳离子层析介质。

强阳离子如SP及性质相似的任何一种介质，弱阳离子如CM及性质相似的任何一种介质，复合型阳离子如MMC及性质相似的任何一种介质。

步骤（a）蓝胶染料亲和层析洗脱液超滤脱盐后，用醋酸调pH3.5-5.0，此时会出现大量沉淀，离心除去沉淀，上清经步骤（b）阳离子层析进一步纯化。许多资料表明大肠杆菌的蛋白在pH3.5-5.0间会发生沉淀现象，本发明展现这一现象也同样存在于真核的哺乳动物细胞蛋白中，强阳离子层析作为一个重要的去除杂蛋白的步骤，很大程度上也是利用了这一酸沉淀现象。

酸沉淀过程要求pH变化要缓慢，因为酸沉时有可能使目的蛋白共沉。酸沉淀后蛋白溶液要快速离心去除沉淀后经步骤（b）阳离子层析进一步纯化。

    本发明的另一目的是进一步降低终产品的细胞色素含量。以便进一步提高终产品的蛋白纯度，这一目的可由前述方法的弱阳离子交换介质来实现。

    步骤（b）阳离子层析，阳离子层析可以使用强阳离子、弱阳离子型介质和复合型阳离子层析介质。所有类型都要求在pH3.5-5.0之间进行层析过程，因为重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的等电点在这一区间内，如果超出等电点范围，如大于pH5.0，则载量会很快下降，不利于大规模操作。

对比层析过程，强阳离子层析的效果要好于弱阳离子层析，因为强阳离子交换剂填料的带电性质不随pH的改变而变化，而且由于电荷相互作用没有任何中间形式，因而相互作用机制简单，在高或低pH条件下，样品结合能力仍然保持。

步骤（b）阳离子层析，层析pH要求在3.5-5.0，优选pH4.2-4.7。因为虽然重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的等电点在pH3.5-5.0之间，但在这一pH范围内阳离子层析介质仍有较高的载量，可以满足大规模生产的要求，而且在这一pH范围内，可以在通过酸沉淀的方法去除大量的杂蛋白后，直接进行阳离子层析。

上述步骤（b）阳离子层析，层析pH优选4.2-4.7。因为在这段通过酸沉淀的方法所沉淀的杂蛋白最多，最有利于蛋白纯化，而且在pH4.2-4.7，蛋白比较稳定。

步骤（b）阳离子层析，先通过梯度洗脱确定目的蛋白的洗脱盐浓度范围，这一实验利用了GE公司的AKTApurifier系统，设定的盐浓度范围为0-0.5 MNaCl，结果当洗脱盐浓度升到0.1MNaCl时，目的蛋白开始被洗脱，当盐浓度升到0.2MNaCl时，目的蛋白洗脱完毕。在梯度洗脱的结果之上进行阶段洗脱实验，最终确定最佳层析预洗盐浓度为0.06 M NaCl，最佳层析洗脱盐浓度为0.12-0.16 M NaCl

步骤（b）阳离子层析的净化可通过1MNaOH处理1-2小时，用纯水冲洗去NaOH，再用1MnaCl冲洗，使分离柱处于良好状态，再用纯水冲洗分离柱直至电导为0 ms/cm 。

步骤（b）阳离子层析洗脱液在用Tris调pH大于6.0后可以较长时间存放于4℃或-30℃。

步骤（b）阳离子层析洗脱液在进行步骤（c）阴离子层析之前要将其置换为阴离子层析所使用的平衡液。这是因为如果步骤（c）直接上样则在平衡时，层析柱里的pH会大幅度降低，进而导致已经结合的目的蛋白解离，被冲出层析柱。置换可以采用凝胶层析介质，如G25等。

步骤（c）阴离子层析的目的主要是去除重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的同源杂蛋白，同时去除聚体和痕量杂质，尤其是如小分子片段类杂质。使用的介质为粒径小于40μm的阴离子型介质。举例如Q Sepharose High Performance、SOURCE 15Q等。

步骤（c）阴离子层析中柱效对层析效果影响显著。柱效也称为理论塔板数，在任何情况下，完美填充的分离柱对于分辨率十分重要。如果分离柱填充的不均匀，压得太松或太紧，或含有气泡，则会导致分离柱中不正常通道的产生及峰变宽现象，从而降低分辨率。重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的同源杂蛋白的理化性质十分相近，差别十分微小，如果没有好的分辨率，就无法进行分离。因此装柱效果的好坏直接决定了这一步分离同源杂蛋白的效果。进而决定最终的纯化结果。

步骤（c）阴离子层析的层析pH要求在5.0-8.0，优选pH5.5-6.5。当pH太低时，蛋白与填料的结合能力减弱，载量下降，同时分离效果降低，当pH较高时，虽然载量较高，但分离效果也同样降低，所以优选pH6.0。

步骤（c）阴离子层析，先通过梯度洗脱确定目的蛋白的洗脱盐浓度范围，这一实验利用了GE公司的AKTApurifier系统，层析pH选择在5.0-8.0，设定的盐浓度范围为0-0.4 M NaCl，结果当洗脱盐浓度升到0.12MNaCl时，目的蛋白开始被洗脱，出现几个连续的峰，当盐浓度升到0.28 M NaCl时，目的蛋白洗脱完毕。在梯度洗脱的层析图谱和电泳结果之上进行阶段洗脱实验，最终确定最佳层析盐浓度范围为0.14-0.28 MNaCl，最优为0.14-0.17 M NaCl预洗，0.17-0.25 M NaCl洗脱。

步骤（c）阴离子层析，强阴离子层析的效果要好于弱阴离子层析，因为强阴离子交换剂填料的带电性质不随pH的改变而变化，而且由于电荷相互作用没有任何中间形式，因而相互作用机制简单，在高或低pH条件下，样品结合能力仍然保持。

步骤（c）要求填料要有非常好的选择性，好的选择性（样品峰之间的分离的程度）对于决定分辨率而言是一个比柱效更加重要的因素，它不仅取决于填料的性质，而且还与所带功能团的数目有关。这也是Q-HP有较高分离度的原因。

步骤（c）阴离子层析的净化可通过1 M NaOH处理1-2小时，用纯水冲洗去NaOH，再用1 M NaCl冲洗，使分离柱处于良好状态，再用纯水冲洗分离柱直至电导为0ms/cm 。

    本发明包括使用与上诉相似的介质，即建立在一般结构基础上的介质，不限于提及的例子，如Q-HP、SOURCE15Q可被理解为性质相似的任意介质。

附图说明

  图1蓝胶染料亲和层析的结果，1B组分含有重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白，图中峰1B包含着重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白，可以与代表着杂质部分的峰1A明显分离开。

    图2组分1B在阳离子层析的结果，具体为图1中组分1B通过  CM-FF层析柱由离子作用进行分离，图2中2B为目标峰。

    图3组分2B在阴离子层析的结果，具体为图2中组分2B通过  Q-HP层析柱由离子作用进行分离，图3中3B为目标峰。

  图4本发明经前两步纯化所得主要组分的电泳分析，即SDS-PAGE（12%）电泳分析结果。点样量为10μg蛋白，考马斯亮蓝染色。样品顺序为1发酵上清2蓝胶染料未结合部分3蓝胶染料洗脱部分4阳离子上样液（调酸上清）5调酸沉淀6阳离子洗脱部分箭头所指为目的蛋白。

图5本发明第三步纯化所得主要组分的电泳分析，即SDS-PAGE（12%）电泳分析结果。点样量为10μg蛋白，考马斯亮蓝染色。样品顺序为1阴离子预洗部分2阴离子洗脱部分，箭头所指为目的蛋白。

实施例

    下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解为实施例仅用来说明本发明，并不用于限制本发明的应用范围。

材料和方法

    含重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的丰收液由CHO细胞培养两周左右收获。

    各种样品的蛋白浓度用Bradford法测定。

    超滤系统应用MilliPore Retentate，膜包截留分子量为1万；离心机为SORVALL RC12BP

    电泳分析应用BIO-RAD的Miniprotean Terra cell电泳系统，采用SDS-PAGE方法，所制胶为12%，点样量为10μg蛋白，考马斯亮蓝染色。

    介质和层析系统：层析分离实验应用AKTA^TMPurifier系统，在室温下约22℃下进行。步骤（a）蓝胶染料亲和层析采用GE公司的Blue Sepharose 6 Fast Flow，步骤（b）阳离子层析采用GE公司的CM-FF，步骤（c）阴离子层析采用GE公司的Q-HP。步骤（b）与步骤（c）之间的置换采用GE公司的G25。新购介质摇成悬液后装入XK26/20层析柱中， 柱床体积为40ml，用纯化水以300ml/min的线性流速冲洗填料原有溶液，直至完全替换填料原有溶液。然后在上样前用合适的缓冲液平衡。每步层析所需缓冲液的总量随介质不同而变化，详见表1。

  缓冲液：

  缓冲液A：50 mM Tris-Hcl,70 mM Nacl pH=7.5

  配制：500 ml 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与300 ml 0.1 mol/L 盐酸混匀后，加入4.095 g Nacl，再水稀释至1000 ml。

    缓冲液B：50 mM Tris-Hcl ,1.1 M Nacl pH=7.5

配制：500 ml 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与300 ml 0.1 mol/L 盐酸混匀后，加入64.35g Nacl，再水稀释至1000 ml。

缓冲液C：50 mM Tris-Hcl pH=7.1

配制：500 ml 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与457 ml 0.1 mol/L 盐酸混匀后，再水稀释至1000 ml。

缓冲液D：25 mM HAC-NaAC, pH=4.8

配制：28 ml 的1 M的NaAC与40 ml的1 M的HAC混合，用注射用水稀释至1.0 L。

缓冲液E：25 mM HAC-NaAC,60 mM Nacl pH=4.8

配制：28 ml 的1 M的NaAC与40ml的1M的HAC混合，加入3.51 g Nacl，用注射用水稀释至1.0 L。

缓冲液F：28 mM HAC-NaAC,120 mM Nacl pH=4.8

配制：28 ml 的1 M的NaAC与40ml的1M的HAC混合，加入7.02 g Nacl，用注射用水稀释至1.0 L。

缓冲液G：50 mM Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ pH=5.5

配制：200 ml 0.2 M Na₂HPO₄和45 ml 0.2 M NaH₂PO₄混合，用注射用水定容至1.0 L。

缓冲液H：50mM Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ ,140 mM Nacl pH=5.5

配制：200 ml 0.2 M Na₂HPO₄和45 ml 0.2 M NaH₂PO₄混合，加入8.19 g Nacl，用注射用水定容至1.0 L。

缓冲液I：50mM Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ ,180mM Nacl pH=5.5

配制：200 ml 0.2 M Na₂HPO₄和45 m l0.2 M NaH₂PO₄混合，加入10.53 g Nacl，用注射用水定容至1.0 L。

溶液J：0.1 M NaOH

溶液K：1.0 M NaOH

    表1：每一层析步骤所需平衡、预洗、洗脱、再生溶液的体积（柱体积）

实施例步骤（a）蓝胶染料亲和层析初步纯化

    丰收液用SORVALL离心机以4700rpm离心15min，离心后上清经0.22μm的格式滤器过滤，用MilliPore的超滤系统超滤，超滤浓缩后的上清上样，上样前Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱用3倍柱体积缓冲液A平衡，上样结束后用3倍柱体积缓冲液A洗涤，结合部分用2倍体积缓冲液B洗脱，蓝胶染料亲和层析的结果见图1。丰收液和洗脱部分各留1ml作为分析用样品。

    再生处理：使用后的柱子通入2倍柱体积的溶液J，之后快速用5倍柱体积注射用水冲洗，至电导为0ms/cm。

实施例步骤（b）阳离子层析中度纯化

    上一步得到的洗脱样品，用超滤系统脱盐，方法是先加入等体积的缓冲液C，然后超滤至总体积的1/2，再加入等体积的缓冲液C在超滤，如此反复5次。超滤后的样品用醋酸调pH=4.8，用SORVALL离心机以4700rpm离心30min，去沉淀，上清上样，上样前CM-FF层析柱用4倍柱体积缓冲液D平衡，上样结束后用2倍柱体积缓冲液D洗涤，结合部分先用2倍体积缓冲液E预洗，后用4倍体积缓冲液F洗脱，阳离子层析的结果见图2。上样液和洗脱部分各留1ml作为分析用样品。

    再生处理：使用后的柱子通入2倍柱体积的溶液J，一天后用5倍柱体积注射用水冲洗，至电导为0ms/cm。

实施例步骤（c）阴离子层析精细纯化

    上一步得到的洗脱样品，用G25置换溶液使洗脱样品最终缓冲液为G。样品上样，上样前Q-HP用3倍柱体积缓冲液G平衡，上样结束后用2倍柱体积缓冲液G洗涤，结合部分先用4倍体积缓冲液H预洗，后用2倍体积缓冲液I洗脱，阴离子层析的结果见图3。上样液和洗脱部分各留1ml作为分析用样品。

再生处理：与实施例步骤（b）相同。电泳分析结果见图4、图5。

Claims (1)

1.一种重组人干扰素α2b-CTP融合蛋白的纯化方法，其步骤如下

步骤(a)蓝胶染料亲和层析初步纯化

丰收液用SORVALL离心机以4700rpm离心15min，离心后上清经0.22μm的格式滤器过滤，用MilliPore的超滤系统超滤，超滤浓缩后的上清上样，上样前Blue Sepharose 6Fast Flow层析柱用3倍柱体积缓冲液A平衡，上样结束后用3倍柱体积缓冲液A洗涤，结合部分用2倍体积缓冲液B洗脱，

再生处理：使用后的柱子通入2倍柱体积的溶液J，之后快速用5倍柱体积注射用水冲洗，至电导为0ms/cm，

步骤(b)阳离子层析中度纯化

上一步得到的洗脱样品，用超滤系统脱盐，方法是先加入等体积的缓冲液C，然后超滤至总体积的1/2，再加入等体积的缓冲液C在超滤，如此反复5次，超滤后的样品用醋酸调pH＝4.8，用SORVALL离心机以4700rpm离心30min，去沉淀，上清上样，上样前CM-FF层析柱用4倍柱体积缓冲液D平衡，上样结束后用2倍柱体积缓冲液D洗涤，结合部分先用2倍体积缓冲液E预洗，后用4倍体积缓冲液F洗脱，

再生处理：使用后的柱子通入2倍柱体积的溶液J，一天后用5倍柱体积注射用水冲洗，至电导为0ms/cm，

步骤(c)阴离子层析精细纯化

上一步得到的洗脱样品，用G25置换溶液使洗脱样品最终缓冲液为G，样品上样，上样前Q-HP用3倍柱体积缓冲液G平衡，上样结束后用2倍柱体积缓冲液G洗涤，结合部分先用4倍体积缓冲液H预洗，后用2倍体积缓冲液I洗脱，

其中所述缓冲液和溶液分别为：

缓冲液A：50mM Tris-Hcl,70mM Nacl pH＝7.5

缓冲液B：50mM Tris-Hcl,1.1M Nacl pH＝7.5

缓冲液C：50mM Tris-Hcl pH＝7.1

缓冲液D：25mM HAC-NaAC,pH＝4.8

缓冲液E：25mM HAC-NaAC,60mM Nacl pH＝4.8

缓冲液F：28mM HAC-NaAC,120mM Nacl pH＝4.8

缓冲液G：50mM Na2HPO4-NaH2PO4 pH＝5.5

缓冲液H：50mM Na2HPO4-NaH2PO4,140mM Nacl pH＝5.5

缓冲液I：50mM Na2HPO4-NaH2PO4,180mM Nacl pH＝5.5

溶液J：0.1M NaOH。