KR101868858B1 - 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법 - Google Patents

형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법을 제공하며, 다음 단계를 포함한다: 1) rHSA의 미정제 추출물에 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 1차 생성물 I을 얻는 단계; 2) 1차 생성물 I에 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 2차 생성물 II를 얻는 단계; 3) 2차 생성물 II에 소수성 크로마토그래피를 실행하여 정제된 rHSA를 얻는 단계. 상기 방법은 소수성 크로마토그래피 이전에 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피의 단계를 더 포함할 수 있다.

Description

형질전환 쌀 알곡으로부터 인간 혈청 알부민을 정제하는 방법{Method for Purifying Human Serum Albumin from Transgenic Rice Grain}
본 발명은 바이오기술 분야에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 대용량으로 분리하고 정제하는 방법에 관한 것이다.
인간 혈청 알부민(HSA)은 585개 아미노산으로 이루어지고, 66.5kD의 분자량과 4.7~4.9 사이의 등전점을 가지는 단일 사슬이며, 비-당화 단백질이다. 이는 인간 혈장에서 가장 풍부한 단백질이며, 전체 혈장 단백질의 약 60%를 차지한다. 인간 혈액의 리터당 약 40g의 HSA가 존재한다. 혈장에 존재하는 것을 제외하고, HSA는 또한 조직 및 신체 분비물, 피부 및 림프강에서 발견된다. 정상적인 생리학적 조건하에서, HSA는 혈장 콜로이드 삼투압을 유지하고, 영양분을 제공하고, 상처의 합생을 촉진하고, 담체로서, 혈액에 있는 호르몬, 생물학적 활성 물질 및 약물과 같은 여러 소수성 생물학적 분자의 수송에 참여하는 효과를 가진다. 따라서, HSA는 혈액의 손실, 불에 의한 화상, 물에 의한 화상, 성형수술 및 뇌손상에 의해 유발된 저단백혈증의 치료뿐만 아니라 간경변, 수신증 등의 치료에 임상적으로 주로 사용되는 중요 의학적 단백질이다.
현재, 임상적 용도의 HSA는 인간 혈장의 추출과 분리에 의해 주로 제조된다. 그러나, 이런 제조 방법은 다음 단점을 가진다: 한편으론, 혈장의 원료가 불충분한데, 즉 제한된 혈액 공급은 HSA 및 이의 관련 조합제의 생산 요구를 충족할 수 없으며; 다른 한편으론, 혈액 자체가 잠재적으로 위험 인자가 될 수 있는데, 예를 들어, 혈액은 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 등과 같은 위험한 감염성 병원균을 포함할 수 있으며, 이는 혈장으로부터 추출된 HSA의 사용에 관해 커다란 우려를 일으킨다. 따라서, HSA를 생산하는 다른 방법을 개발하는 것이 시급하다.
현대 DNA 재조합 및 합성 기술의 발전에 의해, 연구자들은 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)의 생산과 사용에 현저한 관심을 가진다. 지금까지, 다양한 발현 시스템이 rHSA의 대량 생산에 실험적으로 사용되었다. 예를 들어, 대장균(colon bacillus)(Latta, M. et al., Bio/Technology, 5:1309-1314, (1987)), 고초균(bacillus subtilis)(Saunders, C. W. et al, J. Bacteriol. 169: 2917-2925, (1987))과 같은 원핵생물, 효모(WO 00/44772, EP0683233A2, US 5612196)와 같은 진핵생물 및 또한 동물 세포의 배양이 rHSA의 생산에 사용되었다. 그러나, 이런 방법은 낮은 발현 수준 또는 높은 생산 비용 때문에 산업적 생산에 적합하지 않다.
본 발명자들의 중국특허출원 No.200510019084.4는 생체반응기로서 쌀 배젖 세포를 사용하는 rHSA를 생산하는 방법을 개시하며, rHSA의 쌀의 배젖 세포의 내막계 속으로의 진입을 매개하고 쌀 배젖의 단백질체에 rHSA를 저장하기 위해 쌀 배젖에서 특이적으로 발현된 프로모터 및 신호 펩타이드를 사용하여, rHSA가 쌀 씨에 막대하게 축적되어 최종적으로 높은 발현 수준에 도달하게 하는 단계를 포함한다. 얻은 rHSA의 발현 수준은 쌀 알곡의 중량을 기초로 적어도 0.3% 이상이다. 상기 방법은 높은 발현 수준과 낮은 비용의 이점을 가지며, 따라서 단백질 약물의 생산을 위한 새로운 전략을 개발할 가능성을 제공한다.
임의의 발현 시스템에 의해 생산된 rHSA는 시장에 들어오기 전에 정제돼야 한다. 정제 기술은 제품의 품질뿐만 아니라 생산 비용에 영향을 미칠 수 있다. 정제 방법의 비용은 전체 생산 비용의 약 80~90%를 차지한다. 현재, 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하기 위한 정제 방법이 존재하지 않는다. 따라서, 본 발명은 쌀 알곡으로부터 rHSA를 정제하기 위한 단순하고 비용 효과적인 정제 방법을 개발하는 것은 기술적으로 어렵고 경제적으로 위험하다.
현재, 효모 및 식물 현탁 세포로부터 rHSA를 추출하기 위한 기술들이 보고되었다. 예를 들어, 중국특허출원 CN101768206A는 효모(Pichia pastoris)에서 발현된 rHSA를 정제하기 위한 방법을 개시하였고, rHSA의 발효액을 세라믹 막으로 여과하고 뒤이어 여과물에 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 정제된 rHSA를 얻는 단계를 포함한다. 그러나, 쌀 알곡, 효모 및 식물 현탁 세포들 사이에 불순물들의 상당한 차이 때문에, 이런 종래기술은 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하는데 바로 사용될 수 없다. 따라서, 쌀 알곡으로부터 rHSA를 분리하고 정제하여 높은 수율과 높은 순도로 rHSA를 생산하기 위한 단순하고 효과적인 방법을 개발하는 것이 바람직하며, 이것이 미래의 산업화 생산을 위한 기초를 제공할 것이다.
본 발명의 목적은 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 대용량으로 분리하고 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 성취하기 위해서, 본 발명은 다음 기술적 해결책을 제공한다.
형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 분리하고 정제하는 방법은 연속적으로 다음 단계를 포함한다:
1) 재조합 인간 혈청 알부민의 미정제 추출물에 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 1차 생성물 I을 얻는 단계;
2) 1차 생성물 I에 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 2차 생성물 II를 얻는 단계;
3) 2차 생성물 II에 소수성 크로마토그래피를 실행하여 정제된 재조합 인간 혈청 알부민을 얻는 단계.
단계 1)에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어(Sphere) S, 누비아(Nuvia) S, 캡토(Capto) MMC, MacroPrep-CM으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 강한 양이온 크로마토그래피 수지상에서 실행될 수 있다. UNO 스피어 S 또는 캡토 MMC가 바람직하다.
양이온 교환 크로마토그래피는 pH 구배 용출(gradient elution) 또는 NaCl 농도 구배 용출을 사용할 수 있다. pH 구배 용출이 바람직하다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피용 용출 버퍼는 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 5.2의 pH를 가진다.
단계 2)에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스 FF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 강한 음이온 크로마토그래피 수지상에서 실행될 수 있다. Q 세파로스 FF가 바람직하다.
한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피용 용출 버퍼는 인산염 버퍼, 0.2M 염화나트륨을 포함하며 7.5의 pH를 가진다.
단계 3)에서, 소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행될 수 있다. 페닐 세파로스 HP가 바람직하다.
소수성 크로마토그래피 컬럼으로부터의 표적 단백질을 포함하는 용출액은 울트라-여과 농축 및 동결 건조와 같은 공지된 기술에 의해 최종 제품으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 단계 3)의 소수성 크로마토그래피 이전에 2차 생성물 II에 Macro-prep 세라믹 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피를 실행하는 단계를 포함할 수 있다. 즉, 이런 실시태양에서, 표적 단백질을 포함하는 2차 생성물은 단계 3)으로서 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 크로마토그래피를 거친 후 단계 4)로서 소수성 크로마토그래피를 거쳐 정제된 표적 단백질을 얻었다.
세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 I 및 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 II로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행될 수 있다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I이 바람직하다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 로딩 버퍼는 아세트산염 버퍼를 포함하며, 5.0 미만의 pH를 가진다.
양이온 교환 크로마토그래피에 사용된 표적 단백질을 용출하기 위한 용출 버퍼는 아세트산염 버퍼 및 염화나트륨 또는 인산염 버퍼 및 염화나트륨을 포함할 수 있고, 5.0~6.7의 pH를 가진다. 바람직하게는 염화나트륨의 농도는 0.25M이며 용출 버퍼의 pH는 5.2이다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 UNO 스피어 S 또는 캡토 MMC 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며, 5.2의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 누비아 S 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨를 포함하며, 5.0 또는 5.2의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 캡토 MMC 상에서 실행되며, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 6.7의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.
한 실시태양에서, 양이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 MaccroPrep-CM 상에서 실행되며, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 0.1M 염화나트륨을 포함하며 6.5의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.
한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 Q 세파로스 FF 상에서 실행되며, 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 용출 버퍼가 사용된다.
한 실시태양에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 DEAE 세파로스 FF 상에서 실행되며, 인산염 버퍼, 0.1M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 세척 버퍼가 불순물들을 제거하는데 사용되며; 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가진 용출 버퍼가 표적 단백질들을 용출하는데 사용된다.
한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피에 의해 정제될 rHSA-포함 분획은 황산 암모늄을 더 포함할 수 있다. 황산 암모늄의 농도는 0.1M 내지 1M일 수 있다.
한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 페닐 세파로스 HP 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.4M이다.
한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 페닐 세파로스 FF 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.1M이다.
한 실시태양에서, 소수성 크로마토그래피는 크로마토그래피 매질로서 MacroPrep-t-부틸 상에서 실행되며, 정제될 rHSA-포함 분획에서 황산 암모늄의 농도는 0.6M 내지 1.0M이다.
한 실시태양에서, Macro-prep 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 7.0~7.5의 pH를 가진 인산염 버퍼를 포함하는 용출 버퍼를 사용하여 표적 단백질을 용출한다.
본 발명의 상기 rHSA는 본 출원인에 의해 출원된 중국특허출원 No. 200510019084.4에 개시된 생체반응기로서 쌀의 배젖 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 형질전환 쌀에서 발현된 rHSA는 본 출원인에 의해 출원된 중국특허출원 No. 201010597544.2에 개시된 방법에 의해 추출될 수 있으며, 바람직하게는 다음 단계를 포함한다:
i) rHSA를 포함하는 제분된 형질전환 쌀을 추출 버퍼와 1:5의 w/v(kg/l) 비율로 혼합하고, 1~1.5시간 동안 55~60℃에서 추출하여 혼합물 I를 얻는 단계; 추출 버퍼는 10~30mM 인산염 버퍼, 10~20mM 아세트산 나트륨, 15~30mM 황산 암모늄 및 5~20mM 카프릴산 나트륨을 포함하며 6.5~8의 pH를 가진다;
ii) 단계 i)의 혼합물 I의 pH를 4.0~4.5로 조절하고 이를 3~12시간 동안 침전하여 혼합물 II를 얻는 단계;
iii) 단계 ii)의 혼합물 II를 여과하여 전분 또는 비-표적 단백질을 제거한 후 여과물을 수집하여 고농도의 rHSA를 포함하는 미정제 추출물을 얻는 단계.
한 실시태양에서, 상기 여과는 필터 천 형태 플레이트-프레임 프레스 필터에 의한 압력 여과에 의한 여과 후, 폴리에터설폰 속 빈 섬유막을 사용하는 미세 여과에 의한 여과 단계를 포함한다. 상기 속 빈 섬유막은 0.20㎛~0.45㎛, 바람직하게는 0.22㎛의 구멍 크기를 가진다.
본 발명의 기술적 해결책은 다음 이점을 가진다:
1. 쌀 알곡에서 비교적 높은 함량의 안료 및 폴리사카라이드에 대해서, 본 발명에서 제 1 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피가 사용되어 rHSA를 포획하거나 결합하는 로딩 용량을 효과적으로 향상시키며, 이것이 크로마토그래픽 효율을 증가시킨다. 반대로, 제 1 단계로서 음이온 교환 크로마토그래피가 사용된 경우, rHSA를 포획하는 로딩 용량은 이론적 용량의 단지 약 20%이다. 한편, UNO 스피어 S 및 캡토-MMC는 수산화나트륨에서도 뛰어난 안정성과 긴 수명의 특징을 가지며, 이것이 크로마토그래피 매질의 저하 기간을 연장하며 본 발명에서 살균 작업을 단순화하며, 마지막으로 표적 단백질의 비용을 감소시킨다.
2. 음이온 교환 크로마토그래피가 본 발명에서 제 2 단계로 사용된다. 용출 조건을 최적화한 후, 쌀 알곡에서 비-표적 단백질의 80% 이상이 제거될 수 있어서, 효과적으로 비-표적 단백질을 제거하고 rHSA를 회수한다. 안료 및 폴리사카라이드가 제 1 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 쌀 알곡으로부터 제거되었기 때문에, 음이온 교환 크로마토그래피에서 로딩 용량과 정제 효율에 대한 이들의 영향이 제거되었다.
3. Macro-prep 세라믹 수산회인회석 크로마토그래피가 본 발명에서 제 3 단계로서 사용되어 다이머 및 폴리머를 제거하는데 rHSA가 주사약으로 사용될 때 많은 다이머 또는 폴리머가 알레르기 반응을 일으킬 수 있기 때문이다. 이 단계는 순도를 현저하게 개선하여 임상적 응용분야 등을 위한 높은 순도의 필요조건을 충족한다.
4. 소수성 크로마토그래피가 본 발명에서 최종 단계로 사용된다. 3단계 크로마토그래피 절차 이후, 표적 생성물의 HPLC 순도는 약 99.0%에 도달할 수 있다.
도 1은 1차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: UNO 스피어 S 매질, B: 누비아 S 매질, C: 캡토 MMC 매질 및 D: MacroPrep-CM 매질.
도 2는 상이한 유속(300cm/h, 600cm/h)에서 누비아 S 매질 및 UNO 스피어 S 매질 사이의 rHSA 추출물에 대한 로딩 용량(부피)의 비교 그래프를 도시한다.
도 3은 1차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: UNO 스피어 Q 매질, B: 세파로스 FF 매질.
도 4는 투석 이전 또는 이후 Q 세파로스 FF 매질의 rHSA 추출물에 대한 로딩 용량 및 rHSA 추출물에서 폴리사카라이드의 함량을 도시하는 변화 차트이다.
도 5는 2차 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: Q 세파로스 FF 매질, B: DEAE 세파로스 FF 매질.
도 6은 최종 정제로서 상이한 크로마토그래피 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 분획들의 SDS-PAGE의 이미지이며, A: 페닐 세파로스 HP 매질, B: 페닐 세파로스 FF 매질, C: Macro Prep-t-부틸 매질.
도 7은 미정제 rHSA 추출물에 크로마토그래피 매질로서 UNO 스피어 S(A), Q 세파로스 FF(B) 및 페닐 세파로스 HP(C) 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.
도 8은 본 발명의 한 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물(HPLC-SEC)의 HPLC 크로마토그램이다.
도 9는 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 매질 상에서 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피를 실행함으로써 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 11은 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 매질 상에서 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피를 실행하고 페닐 세파로스 HP 매질 상에서 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 얻은 용출물 분획의 SDS-PAGE의 이미지이다.
도 12는 본 발명의 다른 실시태양에 따라 얻은 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램이다.
상기 도면에서, S: 로딩 샘플, FT: 투과 유체, Elu: rHSA-포함 용출물, Elu 1: 비-표적 단백질 용출물, Elu 2: rHSA 용출물, CIP: 클리닝-인-플레이스(cleaning-in-place) 분획.
본 발명의 특징들과 이점들은 다음 실시예들로부터 추가로 이해될 수 있다. 실시예들은 단지 예시적이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석돼지 않아야 한다.
양이온 교환 크로마토그래피에서 크로마토그래피 매질와 용출 조건의 선택
본 발명은 양이온 교환 수지의 크로마토그래피를 Bio-RAD에 의해 제조된 UNO 스피어 S, 누비아 S, 캡토 MMC 및 등을 포함하는 높은 작업 유속을 가지는 것으로 정의한다.
캡토 MMC, 누비아 S 및 UNO 스피어 S의 각각이 rHSA의 정제에 사용되었다는 것이 실험에 의해 발견되었다. 캡토 MMC는 단백질 정제에 대해 최고의 효과를 가지며, UNO 스피어 S 및 누비아 S가 그 뒤를 잇는다. 누비아 S 및 UNO 스피어 S의 단백질 정제에 대한 효과들 사이에 현저한 차이가 없다. 그러나, 동일한 작업 유속 조건하에서, UNO 스피어 S의 로딩 용량은 캡토 MMC의 로딩 용량보다 1.5배 크며; UNO 스피어 S는 캡토 MMC와 동일한 작업 유속을 가지며; UNO 스피어 S는 고농도의 수산화나트륨에서도 뛰어난 안정성을 가지며 캡토 MMC와 비교하여 더 나은 세정 과정, 더 긴 작업 수명 및 더 낮은 비용을 가진다.
누비아 S 및 UNO 스피어 S는 유사한 특성을 가지나 리간드의 확장 및 기질 입자 크기에 차이를 가진다. 이들 개개의 최적 작업 유속하에서, 누비아 S의 로딩 용량은 UNO 스피어 S의 로딩 용량보다 1.4배 크다; 그러나, 누비아 S의 작업 유속은 UNO 스피어 S의 작업 유속보다 약 절반 작다. 대신에, UNO 스피어 S는 동일한 유속에서 누비아 S보다 큰 로딩 용량을 가지며, 둘 다는 거의 동일한 정제 능력을 가진다.
다양한 인자들의 관점에서, UNO 스피어 S는 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서 바람직하게 사용된다.
rHSA-포함 추출물은 비교적 낮은 pH(pH = 4.4)에서 UNO 스피어 S를 채운 컬럼 상에 로딩되어 rHSA가 매질 상에 완전히 흡수되는 것을 보장하며, 기본 용출 조건을 알기 위해 각각 pH 구배 용출 버퍼 및 NaCl 구배 용출 버퍼에 의해 용출된다.
결과는 pH 구배 용출에서, UNO 스피어 S 컬럼 상에 흡수된 rHSA는 용출 버퍼의 pH가 5.5 초과일 때 약간 탈착되어, 로딩 버퍼의 pH는 5.5를 초과하지 않아야 한다는 것을 나타내며; 용출 버퍼의 pH가 5.68일 때, rHSA는 컬럼으로부터 완전히 탈착된다. 따라서 UNO 스피어 S 컬럼상의 rHSA는 pH 구배 용출에 매우 민감하다.
NaCl 농도 구배 용출에서, 표적 단백질 rHSA는 농도 구배가 35% 내지 60% 1M 염화나트륨(NaCl)일 때 탈착되어, UNO 스피어 S 컬럼상의 rHSA가 NaCl 농도 구배 용출에 민감하지 않다는 것을 나타낸다. 결과는 pH 구배 및 NaCl 구배 모두가 rHSA를 용출하는데 사용될 수 있다는 것을 증명한다. 또한, pH 구배는 더 높은 민감성과 더 적은 부피의 용출 버퍼로 rHSA를 용출한다. 반대로, NaCl 구배는 rHSA를 쉽게 용출할 수 없고 고농도의 NaCl과 더 큰 부피의 용출 버퍼를 필요로 한다.
정제 효율과 회수율을 고려하면, 바람직한 용출 버퍼는 0.25M NaCl를 포함하는 인산염 버퍼(pH 5.2)이다.
음이온 교환 크로마토그래피에 대한 크로마토그래피 매질와 용출 조건의 선택
양이온 교환 수지와 같이, 음이온 교환 수지는 rHSA의 정제에 사용될 수 있다. 본 발명은 음이온 교환 수지의 크로마토그래피 매질을 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF, DEAE 세파로스 FF 등을 포함하는 높은 유속 및 높은 로딩 용량을 가지는 것으로 정의한다.
실험에 의해 UNO 스피어 Q, Q 세파로스 FF 및 DEAE 세파로스 FF의 각각은 rHSA의 정제에 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. UNO 스피어 Q는 Q 세파로스 FF보다 빠른 유속을 가지나 Q 세파로스 FF는 UNO 스피어 Q보다 더 나은 정제 효율을 가지며; DEAE 세파로스 FF는 유사한 정제 효율을 가지나 Q 세파로스 FF와 비교하여 더 느린 유속을 가진다.
상기한 대로, 양이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서, UNO 스피어 S는 캡토 MMC보다 약간 더 나쁜 정제 능력을 가진다. 그러나, 실험에 의해 이런 부작용은 전체 정제 능력의 개선에 의해 제거될 수 있다는 것이 증명되었다. UNO 스피어 S는 후속 음이온 교환 크로마토그래피에 대해 부작용을 일으키지 않을 것이다. 바람직한 실시태양에서, Q 세파로스 FF는 음이온 교환 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질로서 바람직하게 사용되며 표적 단백질을 용출하기 위한 용출 버퍼는 인산염 버퍼 및 0.2M NaCl을 포함하며 6.8의 pH를 가진다.
음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피의 순서의 결정
음이온- 및 양이온-교환 크로마토그래피 모두는 rHSA의 1차 정제로 사용될 수 있으나, 실험들에 의해 Q 세파로스 FF 음이온 교환 수지가 1차 정제 단계에 사용될 때, 이의 로딩 용량은 이론적 용량보다 훨씬 더 낮다는 것이 발견되었다. 이는 쌀 알곡에 다량으로 존재하는 가용성 폴리사카라이드와 핵산과 관련이 있을 수 있다. 가용성 폴리사카라이드와 핵산은 음전하를 포함하기 때문에, Q 세파로스 FF와 결합하여 이의 로딩 용량을 감소시킬 수 있다. 실험에 의해 rHSA 추출물에서 가용성 폴리사카라이드의 함량은 투석에 의해 감소될 수 있어서, Q 세파로스 FF의 로딩 용량을 증가시킨다는 것이 증명되었다.
반대로, UNO 스피어 S, 누비아 S 및 캡토 MMC와 같은 양이온 교환 크로마토그래피 매질는 가용성 폴리사카라이드 또는 핵산과 결합하지 않아서, 로딩 용량의 감소를 유발하는 것을 피한다. 따라서, 본 발명에서 양이온 교환 크로마토그래피가 1차 정제로 결정되고 음이온 교환 크로마토그래피가 2차 정제로 결정된다.
소수성 크로마토그래피용 크로마토그래피 매질의 선택
본 발명은 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF(LS), macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸을 포함하는, 정제 단계를 위한 유사한 특성을 가진 다양한 소수성 크로마토그래피 매질를 사용한다.
페닐 세파로스 HP는 강한 소수성과 뛰어난 정제 능력을 가진다. 미정제 추출물로부터 대부분의 비-표적 단백질과 다른 불순물을 제거하는 능력은 정제 효율에 중요하나, 미세한 입자 크기, 낮은 유속 및 특별한 작업 모드 때문에 이런 크로마토그래피의 응용분야에서 일부 불편함이 존재한다.
페닐 세파로스 HP와 비교하여, 페닐 세파로스 FF(LS)는 동일한 리간드와 기질을 가지나, 상이한 지름의 구형 기질과 상이한 밀도의 리간드를 가진다. 페닐 세파로스 FF(LS)의 기질의 평균 입자 크기는 페닐 세파로스 HP의 기질의 평균 입자 크기보다 3배 더 크며 따라서 전자가 더 높은 작업 유속을 가진다. rHSA의 생산에 사용될 때, 페닐 세파로스 FF가 생산 기간을 단축할 수 있다. MacroPrep-부틸은 페닐 세파로스 FF와 페닐 세파로스 HP보다 약한 소수성을 갖는 반면 MacroPrep-메틸은 MacroPrep-부틸보다 더 약한 소수성을 가진다.
페닐 세파로스 FF는 페닐 세파로스 HP와 동일한 작업 모드에서 실험적으로 수행되어 투과 유체를 수집한다. 로딩 샘플에서 염의 농도의 선택에서, 샘플이 평형 버퍼(25mM PB, 0.5M(NH4)2SO4, pH 6.8)와 함께 로딩되고 100% 물로 용출될 때, 50% 이상의 rHSA가 컬럼 상에 유지된다는 것이 발견되었다. 결과로서 평형 버퍼의 염 농도는 감소돼야 한다.
UNO 스피어 S 및 Q 세파로스 FF 컬럼에 의해 여과된 샘플들에 황산 암모늄을 첨가하여 페닐 세파로스 FF(LS) 컬럼 상에 로딩되기 전에 각각 0.2M 및 0.1M로 황산 암모늄의 농도를 조절한다. 투과 유체와 정제수 용출물을 수집하여 SDS-PAGE 탐지를 실행한다. 결과는 페닐 세파로스 FF(LS)가 페닐 세파로스 HP보다 강한 소수성을 가지며 로딩 샘플에서 황산 암모늄의 농도가 0.1M로 낮은 경우에도 샘플에서 비-표적 단백질을 제거하는 좋은 효과를 가진다는 것을 나타낸다. 페닐 세파로스 FF(LS)에 의해 얻은 생성물은 93.5%의 순도를 가진다. 그러나, 여전히 30%의 rHSA가 페닐 세파로스 FF(LS) 컬럼 상에서 사라진다. 상기 실험은 황산암모늄 대신에 염화나트륨을 사용하여 실행되며, 유사한 결과를 얻는다. 비록 컬럼 상에서 rHSA의 손실이 감소하나, 생성물의 HPLC 순도는 여전히 약 93%이다.
UNO 스피어 S 및 Q 세파로스 FF 컬럼에 의해 여과된 샘플들에 황산 암모늄을 첨가하여 macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸 컬럼 상에 로딩되기 전에 각각 1M, 0.8M 또는 0.6M로 황산 암모늄의 농도를 조절한다. 투과 유체와 정제수 용출물을 수집하여 SDS-PAGE 탐지를 실행한다. 결과는 macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸은 나쁜 소수성을 가진다는 것을 나타낸다. 둘 다는 rHSA에 대해 나쁜 정제 능력을 가지며, 얻은 rHSA는 HPLC에 의해 90%의 순도를 가진다.
어떤 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 또는 타입 II를 선택하기 위해서, Bio Rad로부터의 두 타입의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석을 비교하였다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I이 타입 II보다 훨씬 좋다는 것을 발견하였다. Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 크로마토그래피 이후, 모노머 함량은 98.998%까지 도달할 수 있다.
상기한 대로, 다른 크로마토그래피 매질가 페닐 세파로스 HP에 비해 빠른 작업 유속의 이점을 가지나, 이들은 페닐 세파로스 HP에 필적할만한 정제 효율을 얻을 수 없다. 페닐 세파로스 HP는 비교적 낮은 작업율을 가지나, 표적 단백질이 98% 초과의 순도를 가진다는 것을 보장할 수 있다. 따라서 페닐 세파로스 HP는 소수성 크로마토그래피용 매질로서 바람직하게 사용된다.
실시예
재료 및 장비
필터 천 타입 플레이트-프레임 필터 프레스, 타입: XMS4/500-UB, Shanghai Tianli Filter Press Co., Ltd(China)에 의해 제조; 0.20㎛ 속 빈 섬유막, Huzhou Kelu Membrane Technology Co., Ltd(China)로부터 구입가능;
UNO 스피어 S, 누비아 S, 캡토 MMC, MacroPrep-CM, MacroPrep-메틸, MacroPrep-부틸 매질, BIO-RAD(US)로부터 구입가능;
Q 세파로스, 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, DEAE-세파로스 FF 매질, GE Healthcare(US)로부터 구입가능;
C10/19, XK16/20 크로마토그래피 컬럼, GE Healthcare(US)로부터 구입가능;
생물학적 15/200 크로마토그래피 컬럼, BIO-RAD(US)로부터 구입가능;
실시예 1: 형질전환 쌀 알곡으로부터 rHSA 의 추출
본 발명자들의 중국특허출원 No.200510019084에 개시된 방법에 따라 형질전환 쌀을 제조할 수 있다. 패디 쌀을 껍질을 벗겨 절반 연마된 쌀을 얻었고 제분하여 80~100 메시의 분말도를 가진 제분된 쌀을 얻었다. 제분된 쌀을 1:5(w/v, kg/L)의 비로 추출 버퍼와 혼합하고, 60℃에서 1.5시간 동안 추출하였다. 추출 버퍼의 구성요소는 25mM 인산염 버퍼, 20mM 아세트산 나트륨, 10mM 황산 암모늄, 10mM 카프릴산 나트륨이며; pH 7.5를 가진다. 얻은 혼합물을 아세트산으로 pH 4.5로 조절하고 적어도 3시간 동안 방치하여 비-표적 단백질을 침전시켰다. 그런 후에 얻은 혼합물을 연속적으로 플레이트-프레임 프레스 필터(필터 천 형태)를 사용하는 압력 여과하고 0.22㎛의 구멍 크기를 가진 속 빈 섬유 컬럼에 의해 미세 여과하여, rHSA를 포함하는 상층액을 얻었다. rHSA의 농도는 약 0.66mg/mL이었다.
실시예 2: 1차 정제로서 양이온 교환 크로마토그래피
1. UNO 스피어 S 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 8.7ml의 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.1ms/cm의 전도도 및 4.53의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.2, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1a에 도시되었다.
2. 누비아 S 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 9.3ml의 누비아 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.0, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1b에 도시되었다.
3. 캡토 MMC 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 15.1ml의 캡토 MMC 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5이며 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 300cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.7, 염화나트륨 58.44g/L)로 용출하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 58.55g/L, pH 6.7)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1c에 도시되었다.
4. MacroPrep-CM 매질 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 10ml의 MacroPrep-CM 매질로 채우고 200cm/h의 유속에서 300ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5이며 안정해질 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.3ms/cm의 전도도 및 4.56의 pH를 가진다. 로딩 후, 샘플을 200cm/h의 유속에서 세척 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.7, 염화나트륨 58.44g/L)로 용출하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 5.84g/L, pH 6.5)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 1d에 도시되었다.
5. 누비아 S 매질 및 UNO 스피어 S 매질 사이의 로딩 능력의 비교
두 XK16/100 컬럼을 각각 약 5ml의 누비아 S 및 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH를 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 rHSA 추출물 샘플을 각각 300cm/h의 유속에서 누비아 S 컬럼 및 UNO 스피어 S 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 누비아 S 또는 UNO 스피어 S의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였다.
또한, UNO 스피어 S를 300cm/h의 유속에서 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산을 첨가하여 pH 4.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 4.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 rHSA 추출물 샘플을 각각 600cm/h의 유속에서 UNO 스피어 S 컬럼 상에 로딩하였고 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 600cm/h의 유속에서 UNO 스피어 S의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 계산하였다. 로딩 용량의 비교는 도 2에 도시되었다.
실시예 3: 1차 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피
1. UNO 스피어 Q 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피
생물학적 15/200 컬럼을 약 10ml의 UNO 스피어 Q 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.5로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.5일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.5로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 300cm/h의 유속에서 UNO 스피어 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 세척 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 세척하여 불순물을 제거한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 23.36g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 3a에 도시되었다.
2. Q 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피
생물학적 15/200 컬럼을 약 10ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 6.8로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플을 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 5.84g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 3b에 도시되었다.
3. Q 세파로스 FF의 실제 로딩 용량에 대한 검사
10/100 컬럼을 각각 약 5ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0이며 안정할 때까지 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.5로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만이며 전체 부피가 1000ml일 때까지 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였다. 그런 후에 수지를 재생하였다.
실시예 1에서 얻은 250ml의 rHSA 추출물 샘플을 pH 7.0으로 조절하고 버퍼로 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 희석하고 GE 30KD 막 카세트를 통해 400ml로 농축하였다. 황산-페놀 방법을 사용하여 투석 이전 및 이후 폴리사카라이드의 함량을 측정하였다. 그런 후에 샘플을 평형화된 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩하였다. 흡수값이 10%만큼 플래토(plateau)를 초과할 때까지 샘플 로딩 동안 UV280의 흡수값을 기록하였다. 샘플 부피를 기록하고 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF의 밀리리터당 실제 로딩 용량을 각각 계산하였고 폴리사카라이드의 함량 변화를 도 4에 도시되었다.
실시예 4: 2차 정제로서 음이온 교환 크로마토그래피
실시예 2에서 얻은 rHSA-포함 분획을 다음 실험에서 사용하기 위해 두 개의 동일한 부분으로 나눴다.
1. Q 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피
15/200 컬럼을 약 7ml의 Q 세파로스 FF로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 상기 분획의 한 부분을 pH 7.0으로 조절하고 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 버퍼로 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 Q 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 5a에 도시되었다.
2. DEAE 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 음이온 교환 크로마토그래피
생물학적 15/200 컬럼을 약 8ml의 DEAE 세파로스 FF로 채우고 300cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 수산화나트륨 또는 염산을 첨가하여 pH를 7.0로 조절하였다)로 유출물의 pH가 7.0일 때까지 평형화하였다. 상기 분획의 다른 부분을 pH 7.5로 조절하고 전도도가 10.0ms 미만일 때까지 버퍼로 희석하였다. 샘플을 300cm/h의 유속에서 DEAE 세파로스 FF 컬럼 상에 로딩한 후 용출 버퍼(인산이수소나트륨 0.3g/L, 인산수소이나트륨 3.5g/L, 염화나트륨 11.68g/L)로 용출하여 rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영동도는 도 5b에 도시되었다.
실시예 5: 최종 정제로서 소수성 크로마토그래피
1. 페닐 세파로스 HP 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 8ml의 페닐 세파로스 HP로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 66g/L)로 평형화하였다. 실시예 4에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(0.4M)을 첨가하여 전도도를 80.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6a에 도시되었다.
2. 페닐 세파로스 FF 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 10ml의 페닐 세파로스 FF로 채우고 150cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 13.2g/L)로 평형화하였다. 실시예 4에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(0.1M)을 첨가하여 전도도를 80.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 150cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6b에 도시되었다.
3. MacroPrep-t-부틸 매질 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피
15/200 컬럼을 약 6ml의 MacroPrep-t-부틸로 채우고 150cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 13.2g/L)로 평형화하였다. 실시예 3에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획(Q 세파로스 FF)에 황산암모늄(각각 1.0M, 0.8M, 0.6M)을 첨가하여 전도도를 각각 130.0ms, 90.0ms, 70.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 150cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영동도는 도 6c에 도시되었다.
실시예 6: rHSA -포함 추출물로부터 rHSA 의 분리 및 정제
단계 1): 1차 정제로서 UNO 스피어 S 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 12ml의 UNO 스피어 S 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 500ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 4.5)로 평형화하였다. 실시예 1에서 얻은 300ml의 rHSA-포함 추출물 샘플을 600cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 6.5ms/cm의 전도도와 4.5의 pH를 가진다. 로딩 이후, 샘플을 200cm/h의 유속에서 용출 버퍼(아세트산나트륨 2g/L, 아세트산, pH 5.0, 염화나트륨 14.61g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하여 rHSA를 포함하는 분획을 얻었다. 전기영도도는 도 7a에 도시되었다.
단계 2): 2차 정제로서 Q 세파로스 FF 상에서 실행된 양이온 교환 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 13ml의 Q 세파로스 FF 매질로 채우고 300cm/h의 유속에서 400ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 6.51g/L, 인산이수소나트륨 0.72g/L, pH 6.8)로 평형화하였다. 이전 단계에서 얻은 rHSA-포함 분획을 약 200ml로 희석하며 10.0ms 미만의 전도도를 가지며 300cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플은 8.3ms/cm의 전도도와 6.8의 pH를 가진다. 로딩 이후, 샘플을 100cm/h의 유속에서 용출 버퍼(인산수소이나트륨 6.51g/L, 인산이수소나트륨 0.72g/L, 염화나트륨 11.69g/L)로 용출하였다. 용출액을 수집하고 SDS-PAGE로 관찰하였다. rHSA-포함 분획을 수집하였다. 전기영도도는 도 7b에 도시되었다.
단계 3): 최종 정제로서 페닐 세파로스 HP 상에서 실행된 소수성 크로마토그래피
XK16/100 컬럼을 약 12ml의 페닐 세파로스 HP 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(무수 아세트산나트륨 2.32g/L, 인산이수소나트륨 2.81g/L, 황산암모늄 66g/L)로 평형화하였다. 이전 단계에서 얻은 20ml의 rHSA-포함 분획에 황산암모늄을 첨가하여 전도도를 90.0ms로 만들었다. 그런 후에 샘플을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 로딩하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 전기영도도는 도 7c에 도시되었다. 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램은 도 8에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 99%(모노머 플러스 다이머 및 폴리머) 초과의 순도를 가진다.
실시예 7: rHSA -포함 추출물로부터 rHSA 의 분리 및 정제
이 실시예는 실시예 1로부터의 미정제 rHSA 추출물에 각각 UNO 스피어 S, Q 세파로스 FF, Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 및 페닐 세파로스 HP 상에서 실행된, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 연속적으로 실행하여 rHSA를 분리하고 정제하는 네 단계 방법을 사용한다. 본 발명에서 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피는 실시예 6과 동일하다.
CHT 컬럼을 약 15ml의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 I 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(20mM 인산나트륨 + 50mM 염화나트륨, pH 7.5)로 평형화하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 rHSA-포함 분획을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 샘플은 26ms/cm의 전도도와 7.4~7.6의 pH를 가졌다. 로딩 이후, 샘플을 용출 버퍼(500mM 인산나트륨, pH 7.5)로 용출하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. rHSA 정제 용량은 ≤30mg/g CHT I로 측정하였고 rHSA의 회복 속도는 최대 ≥80%였다. 마지막으로, CHT 세라믹 수산회인회석 컬럼을 pH 7.0의 500mM 인산나트륨 버퍼의 3~5 컬럼 부피로 재생해야한다. 컬럼은 원하는 경우 1~2N NaOH로 살균될 수 있고 0.1N NaOH에 저장될 수 있다. 전기영동도는 도 9에 도시되었다.
그런 후에, 위에서 얻은 rHSA-포함 분획에 실시예 6과 유사한 절차에 따라 소수성 크로마토그래피를 실행하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 정제된 rHSA 생성물의 HPLC 크로마토그램은 도 10에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 약 99%(단지 모노머)의 순도를 가진다.
실시예 8: rHSA -포함 추출물로부터 rHSA 의 분리 및 정제
이 실시예는 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피가 크로마토그래피 매질로서 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 상에서 실행된 것을 제외하고 실시예 7과 동일한 방법으로 실행하였다.
CHT 컬럼을 약 15ml의 Macro-prep 세라믹 수산화인회석 타입 II 매질로 채우고 100cm/h의 유속에서 200ml의 평형 버퍼(20mM 인산나트륨 + 50mM 염화나트륨, pH 7.0)로 평형화하였다. 음이온 교환 크로마토그래피로부터 얻은 rHSA-포함 분획을 100cm/h의 유속에서 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 샘플은 26ms/cm의 전도도와 7.4~7.6의 pH를 가졌다. 로딩 이후, 샘플을 용출 버퍼(500mM 인산나트륨, pH 7.0)로 용출하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. rHSA 정제 용량은 ≤25mg/g CHT II로 측정하였고 rHSA의 회복 속도는 최대 ≥85%였다. 마지막으로, CHT 세라믹 수산회인회석 컬럼을 pH 7.0의 500mM 인산나트륨 버퍼의 3~5 컬럼 부피로 재생해야한다. 컬럼은 원하는 경우 1~2N NaOH로 살균될 수 있고 0.1N NaOH에 저장될 수 있다.
그런 후에, 위에서 얻은 rHSA-포함 분획에 실시예 7과 유사한 절차에 따라 소수성 크로마토그래피를 실행하였다. 투과 유체를 수집하여 rHSA-포함 분획을 얻었다. 크로마토그램은 도 11에 도시되었다. 정제된 rHSA의 HPLC 크로마토그램은 도 12에 도시되었다. rHSA는 HPLC에 의해 약 99%(단지 모노머)의 순도를 가진다.
실시예 6~8의 결과로부터 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 최종 rHSA 생성물에서 모노머 함량을 효과적으로 증가시켜서, 최대 약 99% 순도를 가능하게 한다는 것을 알 수 있다. 또한, 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP 단계에서 사용된 방식과 동일하게 다른 정제된 rHSA를 위한 플로우-스루(flow-through) 방식을 사용했기 때문에 간단하게 작동되며 용출 용액은 염 농도와 pH 값을 조절하지 않고 상용가능하다. 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피에 의해, 정제된 rHSA는 임상적 용도를 위한 필요조건을 충족할 수 있다.

Claims (23)

  1. 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민(rHSA)을 분리하고 정제하는 방법으로서, 상기 방법은
    1) 재조합 인간 혈청 알부민의 미정제 추출물에 양이온 교환 크로마토그래피를 실행하여 1차 생성물 I을 얻는 단계;
    2) 1차 생성물 I에 음이온 교환 크로마토그래피를 실행하여, 재조합 인간 혈청 알부민을 함유하는 2차 생성물 II를 얻는 단계로서, 2차 생성물 II에 황산 암모늄(ammonium sulfate)이 0.1M 내지 1M의 농도로 첨가되는 것인 단계;
    3) 2차 생성물 II에 소수성 크로마토그래피를 실행하여, 재조합 인간 혈청 알부민이 소수성 크로마토그래피의 수지에 흡착되지 않는 조건 하에서 정제된 재조합 인간 혈청 알부민을 얻는 단계
    를 차례로 포함하고,
    단계 3)의 소수성 크로마토그래피 이전에 2차 생성물 II에 세라믹 수산화인회석 크로마토그래피를 실행하는 단계를 더 포함하는 것인 형질전환 쌀 알곡으로부터 재조합 인간 혈청 알부민을 분리하고 정제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 UNO 스피어 S, 캡토 MMC, 누비아 S 및 MacroPrep-CM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 UNO 스피어 S 또는 캡토 MMC 상에서 실행되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피는 Q 세파로스 FF, UNO 스피어 Q 및 DEAE 세파로스 FF로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행되는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피는 Q 세파로스 FF 상에서 실행되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP, 페닐 세파로스 FF, macro-prep t-부틸 및 macro-prep 메틸로 이루어진 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행되는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP 상에서 실행되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    세라믹 수산화인회석 크로마토그래피는 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 I 및 Macro-prep 세라믹 수산회인회석 타입 II로부터 선택된 크로마토그래피 매질 상에서 실행되는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    재조합 인간 혈청 알부민의 상기 미정제 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법:
    i) 재조합 인간 혈청 알부민을 함유하는 제분된 형질전환 쌀 알곡을 추출 버퍼와 1:5의 w/v(kg/l) 비율로 혼합하고, 1~1.5시간 동안 55~60℃에서 추출하여 혼합물 I를 얻는 단계; 추출 버퍼는 10~30mM 인산염 버퍼, 10~20mM 아세트산 나트륨, 15~30mM 황산 암모늄 및 5~20mM 카프릴산 나트륨을 포함하며 6.5~8의 pH를 가진다;
    ii) 단계 i)의 혼합물 I의 pH를 4.0~4.5로 조절하고 이를 3~12시간 동안 침전하여 혼합물 II를 얻는 단계;
    iii) 단계 ii)의 혼합물 II를 여과한 후 여과물을 수집하여 고농도의 재조합 인간 혈청 알부민을 포함하는 미정제 추출물을 얻는 단계; 상기 여과는 필터 천 형태 플레이트-프레임 필터에 의한 압력 여과에 의한 여과 후, 0.20㎛~0.45㎛의 구멍 크기를 가진 폴리에터설폰 속 빈 섬유막을 사용하는 미세 여과에 의한 여과 단계를 포함한다.
  10. 제 1 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 5.0 미만의 pH를 가진 아세트산염 버퍼를 포함하는 로딩 버퍼를 사용하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 아세트산염 버퍼 및 염화나트륨, 또는 인산염 버퍼 및 염화나트륨을 포함하며; 5.0~6.7의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하는 방법.
  12. 제 2 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 UNO 스피어 S 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며, 5.2의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하는 방법.
  13. 제 2 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 누비아 S 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며, 5.0의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하는 방법.
  14. 제 2 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 캡토 MMC 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가지는 세척 버퍼를 사용하여 비-표적 단백질을 제거하고, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며, 6.7의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하여 재조합 인간 혈청 알부민을 용출하는 방법.
  15. 제 2 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피는 MacroPrep-CM 상에서 실행되며 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며 4.7의 pH를 가지는 세척 버퍼를 사용하여 비-표적 단백질을 제거하고, 아세트산염 버퍼, 1M 염화나트륨을 포함하며, 6.5의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하여 재조합 인간 혈청 알부민을 용출하는 방법.
  16. 제 4 항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피는 Q 세파로스 FF 상에서 실행되며 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하는 방법.
  17. 제 4 항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE 세파로스 FF 상에서 실행되며 인산염 버퍼, 0.1M 염화나트륨을 포함하며 6.0~7.0의 pH를 가지는 세척 버퍼를 사용하여 비-표적 단백질을 제거하고, 인산염 버퍼, 0.25M 염화나트륨을 포함하며, 6.0~7.0의 pH를 가지는 용출 버퍼를 사용하여 재조합 인간 혈청 알부민을 용출하는 방법.
  18. 제 6 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피에서, 정제될 2차 생성물 II은 0.1M 내지 1M의 농도로 황산 암모늄을 더 포함하는 방법.
  19. 제 6 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 HP 상에서 실행되며, 정제될 2차 생성물 II은 0.4M의 농도로 황산 암모늄을 더 포함하는 방법.
  20. 제 6 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피는 페닐 세파로스 FF 상에서 실행되며, 정제될 2차 생성물 II은 0.1M의 농도로 황산 암모늄을 더 포함하는 방법.
  21. 제 6 항에 있어서,
    소수성 크로마토그래피는 MacroPrep-t-부틸 상에서 실행되며, 정제될 2차 생성물 II은 0.6M 내지 1.0M의 농도로 황산 암모늄을 더 포함하는 방법.
  22. 제 8 항에 있어서,
    세라믹 수산회인회석 크로마토그래피는 7.0~7.5의 pH를 가진 인산염 버퍼를 포함하는 용출 버퍼를 사용하는 방법.
  23. 삭제
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