CN103467593B - 一种胸腺法新的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胸腺法新的纯化方法，其特征包括以下步骤：步骤1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节pH3-5；步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相色谱柱；步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相色谱柱中；步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。

Description

一种胸腺法新的纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽类药物的纯化方法，特别涉及一种胸腺法新的纯化方法。
背景技术：
胸腺法新，英名为：Thymalfasin，为线性多肽，结构式如下：
可简写为： 
N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH 
胸腺法新(Thymosin α1，也称胸腺肽α1)是胸腺素主要生物活性成分，为体内重要免疫调节物质，是氮端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽。研究表明，胸腺法新促进骨髓干细胞发育分化为原淋巴细胞及前淋巴细胞；诱导T淋巴细胞分化与成熟，使已成熟的T细胞进一步分化为几个不同的亚群，如杀伤细胞、记忆细胞、效应细胞、辅 导T淋巴细胞等，并产生各种可溶性介质；增强淋巴细胞对有丝分裂素的反应，并可增加淋巴组织的蛋白质和核酸的合成；增加r-IFN、a-IFN、IL-2、IL-3和淋巴毒素的生成，增强抗病毒和抗肿瘤的免疫反应；抑制自身免疫反应；恢复抑制性T细胞的功能。目前胸腺法新已被广泛应用于临床，治疗多种疾病，如用于慢性乙型肝炎的治疗；用于丙型肝炎、肝细胞癌、恶性黑色素瘤的治疗；用于治疗感染性疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤等的治疗。
有关合成胸腺法新的纯化，国内已有多个专利进行的报道。中国专利CN201210052504公开了一种胸腺法新的纯化方法，具体步骤包括活性炭吸附过滤、中性氧化铝色谱柱分离、超滤膜浓缩、乙醚沉降离心洗涤、干燥。
中国专利CN201110186259采用反相C18填料，依次采用0.1%TFA/乙腈、0.2%磷酸/乙腈和水/乙腈分别对胸腺法新粗肽进行第一次、第二次纯化和转盐制备。产品冻干后纯度达99%以上。
中国专利CN201010566609首先采用离子交换色谱纯化合成的粗肽；再用反相液相色谱进一步纯化；最后采用滤膜进行纳滤一步完成浓缩及转盐。其特点在于以纳滤代替传统的旋蒸浓缩和色谱法转盐操作。
中国专利CN200910304817提供了一种胸腺法新脱盐工艺。其工艺步骤为：将酸化后的胸腺肽α1溶液与阳离子交换树脂混合后先用水洗脱离子交换树脂，再用碱性溶液洗脱交换树脂，收集在230nm波长处有吸收的洗脱液，最后经浓缩干燥，得胸腺法新。具有样品处 理量大，脱盐效率好，可重复上样，适合于工业化大生产的特点。现有胸腺法新的固相合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已知的杂质包括：D-Asn28-胸腺法新、Asp28-胸腺法新、di-Ala4-胸腺法新等，未知杂质还有很多。有关杂质中D-Asn28-胸腺法新，结构如下：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-D-Asn-OH 
该杂质为毒性最大的杂质之一，而且极其不稳定，易变色，该杂质的存在严重影响胸腺法新的色泽，含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.3%以下。本发明人研究发现，该杂质用现有技术的手段很难除去，有些方法虽可以去除部分，但去除效果不理想，难以达到优质标准级别同时容易造成胸腺法新本身收率降低。为此，本发明人重点研究如何去除杂质D-Asn28-胸腺法新而不影响胸腺法新的收率问题。
本发明人用现有的纯化方法，对用固相合成法制备的胸腺法新进行了纯化，发现杂质D-Asn28-胸腺法新的含量均无法达到预订目标0.3%。为此，本发明人对胸腺法新的纯化方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高收率、高纯度以及低杂质的胸腺法新的纯化方法。本发明需要解决的技术问题是：选择一种胸腺法新的纯化方法，解决(1)胸腺法新成品纯度不高，(2)胸腺法新成品收率不 高，(3)胸腺法新与杂质D-Asn28-胸腺法新不能有效分离的问题。
本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc：芴甲氧羰基 
Fmoc-AA-OH：Nα-芴甲氧羰基保护的氨基酸
tBu：叔丁基
Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯骈三唑
DIC：N，N′-二异丙基碳二亚胺
Asp：天冬氨酸 
Glu:谷氨酸
Ala：丙氨酸
Val：缬氨酸
Leu：亮氨酸
Lys：赖氨酸
Ile：异亮氨酸 
Ser：丝氨酸
Thr：苏氨酸
Ala-Ala：丙氨酰丙氨酸
DMF：N，N′-二甲基甲酰胺
Piperidine：六氢吡啶 
Fmoc-Rink Amide MBHA resin：用Fmoc保护的Rink氨甲基树脂
TFA：三氟醋酸 
TIS：三异丙基硅烷
MeOH：甲醇
DCM：二氯甲烷 
本发明的技术方案为：
使用聚合物反相填料柱可以使胸腺法新与杂质D-Asn28-胸腺法新得到有效分离。
为此本发明提供一种胸腺法新的纯化方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，将胸腺法新粗品用水溶解，调节pH到3-4；
步骤2，按体积分数设置梯度，使用流动相A冲洗聚合物反相色谱柱；步骤3，将步骤1溶液载入聚合物反相色谱柱中；
步骤4，按体积分数设置梯度，洗脱梯度的初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。分部收集洗脱馏分；
步骤5，将洗脱馏分经过干燥得到纯品胸腺法新。
聚合物反相填料柱为(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；
流动相：A为0.3%醋酸水溶液;
流动相B为乙腈；
梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，
检测波长为220nm。
优选的操作步骤如下：
步骤1，样品处理： 
将1g的胸腺法新粗肽溶解于50ml纯净水中，用氨水调节pH为3-4。
步骤2，平衡
按体积分数设置梯度，使用100%的流动相A冲洗色谱柱10min；
步骤3，上样
将样品溶液载入色谱柱中；
步骤4，洗脱
按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%，分部收集洗脱馏分。
步骤5，冻干
将洗脱馏分经过冻干得到纯品胸腺法新。
以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
采用中国专利CN201210052504方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.77%
采用中国专利CN201110186259方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.33%
采用中国专利CN201010566609方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.45%
采用中国专利CN CN200910304817方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.69%
采用本发明的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量为0.13%。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1、聚合物反相填料的选择：
UniPSTM10-100；UniPSTM20-300
2、流动相的选择：
醋酸水溶液/乙腈；TFA水溶液/乙腈
3、梯度洗脱程序的选择：
梯度程序为:（1）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。（2）按体积分数设置梯度，初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。
为此提出了6种实验条件： 
实验条件1：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
实验条件2：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增 至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
实验条件3：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
实验条件4：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.1%TFA水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
实验条件5：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
实验条件6：聚合物反相填料柱(UniPSTM20-300，50mm×250mm)；流动相：A为：0.3%HAc水溶液;B为：乙腈；梯度程序为:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至20%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%。流速为：80mL／min，检测波长为220nm；
采用实验条件1的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.14%
采用实验条件2的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.21%
采用实验条件3的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.25%
采用实验条件4的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.35%
采用实验条件5的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.15%
采用实验条件6的方法纯化粗品胸腺法新，测定杂质D-Asn28-胸腺法新的含量如下：0.19%
以上结果表明，实验条件1的纯化效果最优。
本发明方法得到的胸腺法新40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有关物质，试验结果如下
时间，天 外观、性状 有关物质
0 为白色粉末 未见杂质斑点
10 为白色粉末 未见杂质斑点
30 为白色粉末 未见杂质斑点
60 为白色粉末 未见杂质斑点
90 为白色粉末 未见杂质斑点
现有技术得到的胸腺法新40℃恒温箱放置，观察外观及性状，检测有 关物质，试验结果如下
时间，天 外观、性状 有关物质
0 为白色粉末 未见杂质斑点
10 为白色粉末 未见杂质斑点
30 为白色粉末 未见杂质斑点
60 为白色粉末 未见杂质斑点
90 为浅黄色粉末 可见杂质斑点
本发明的有益效果是：提供了一种高纯度（99.5%）、高收率（80%以上）以及低杂质（D-Asn28-胸腺法新含量小于0.3%）的胸腺法新纯化方法。
附图说明：
图1粗肽的HPLC图谱
检测方法均如下：
色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；
流动相B：乙腈；
洗脱流速：1ml/min；
检测波长：210nm；
洗脱梯度： 
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 86 14
32 80 20
33 86 14
45 86 14
 图2纯化后胸腺法新HPLC
检测方法均如下：
色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；
流动相B：乙腈；
洗脱流速：1ml/min；
检测波长：210nm；
洗脱梯度： 
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 86 14
32 80 20
33 86 14
45 86 14
图3对照品胸腺法新HPLC
检测方法均如下：
色谱柱：Waters X-bridge5μm C18(250mm×4.6mm)色谱柱或相当柱；
流动相A：0.1%三乙胺磷酸调pH2.0；
流动相B：乙腈；
洗脱流速：1ml/min；
检测波长：210nm；
洗脱梯度： 
时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%）
0 86 14
32 80 20
33 86 14
45 86 14
具体实施方式：
实施例1：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）制备
步骤1
Fmoc-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
称取Rink Amide MBHA树脂（替代度0.45mmol/g）（2.67g，1.0equiv）加入固相合成管中，加入DCM（10mL），控温10-30℃搅拌溶胀30min，抽滤除去液体。再加入DMF（10mL×2）洗涤。量取20%（v/v，下同）Piperidine/DMF溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应5min，抽滤除去液体。再次量取20%Piperidine/DMF溶液（9.0mL），加入固相合成管内，控温20-30℃搅拌反应10min，抽滤除去液体。量取DMF（10mL×7）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。另称取Fmoc-Asp-OtBu（1.97g，4equiv），Cl-HOBt（0.82g，4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至0-10℃，加入DIC（0.89mL，4.8equiv），搅拌，控温0-10℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测呈阴性。
步骤2
H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
将步骤1产物氨基酸树脂按照相同方法脱去Fmoc。称取Fmoc-AA-OH（4equiv），Cl-HOBt（4equiv）加入烧杯。量取DMF/DCM=1/1混合溶剂（6.5mL）加入烧杯，搅拌完全溶解后用冰盐浴冷却至5-10℃，加入DIC（4.8equiv），搅拌，控温5-25℃反应5min，然后将此反应液加入到固相合成管内，3h后抽滤除去液体。量取DMF（12mL×3）加入固相合成管洗涤后抽滤除去液体。茚三酮检测，如结果为阳性，则重复进行偶联一次。所有氨基酸偶联结束后，再进行去Fmoc操作，并用DMF洗涤7遍。
步骤3
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp(RinkAmide-MBHA-Resin)-OtBu合成
往步骤2所得产物肽树脂中加入含有Ac2O（0.57mL，5equiv）、吡啶(0.48mL,5equiv)的DMF（8mL），于15-20℃，反应1h后抽滤除去液体，再依次用DMF（18mL×3）、MeOH（18mL×2）、DCM（20mL×2）、MeOH（18mL×2）洗涤树脂。取出胸腺法新肽树脂，干燥后得7.20g。
步骤4
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）合成
量取TFA（68mL）、TIS（4.0mL）依次加入到100mL三口瓶中，，搅拌混匀，冷却至15-20℃，将步骤3所得肽树脂加入三口瓶中。升温到25-30℃反应1h后停止搅拌。将反应液过滤，并用TFA（5mL×2）洗涤树脂，合并后取滤液，置旋转蒸发仪中减压蒸馏除去大部分TFA。将所得残留液加入到预冷至-10～-5℃甲基叔丁基醚（120mL）中，进行沉降。所得悬浊液经重复离心、甲基叔丁基醚洗涤6遍后，得到糊状粗肽，减压干燥后得粗肽4.22g。粗肽HPLC见图谱1。取粗肽样品适量进行外标法定量，计算后得粗肽中含胸腺法新2.25g，合成收率：60.3%。
步骤5
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH（胸腺法新）RP-HPLC纯化
称取步骤4所得粗肽2.06g用纯净水35mL溶解，调节pH到3.50，充分搅拌后，过滤，得粗肽溶液。采取发明方法进行纯化制备，条件如下：色谱柱：聚合物反相填料柱(UniPSTM10-100，50mm×250mm)；流动相A：0.3%醋酸水溶液;流动相B：乙腈；梯度程序:初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%， 然后在30分钟内将流动相B比例增至40%；流速为：80mL／min；检测波长为220nm。纯化后，并冻干得去氨加压素0.90g，杂质D-Asn28-胸腺法新含量为0.14%，胸腺法新含量：99.78%，见图2。纯化收率为80%。
胸腺法新的含量测定方法：
粗肽中胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量×胸腺法新粗肽主峰面积/胸腺法新对照品峰面积×100%=86.31%×922.469×8.98/854.044×15.70=53.32%
注：胸腺法新对照品和胸腺法新粗肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。
胸腺法新对照品浓度：8.98mg/ml
胸腺法新对照品峰面积：854.044mAU*min（图3）
胸腺法新对照品含量：86.31%
胸腺法新粗肽配制浓度：15.70mg/ml
胸腺法新粗肽主峰面积：922.469mAU*min（图1）
本发明方法纯化后胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量×胸腺法新精肽峰面积/胸腺法新对照品峰面积×100%=86.31%×1176.377×8.98/854.044×10.70=99.78%
注：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。
胸腺法新对照品浓度：8.98mg/ml
胸腺法新对照品峰面积：854.044mAU*min（图3）
胸腺法新对照品含量：86.31%
胸腺法新精肽配制浓度：10.70mg/ml
胸腺法新精肽峰面积：1176.377mAU*min（图2）
本发明方法纯化后D-Asn28-胸腺法新的含量=胸腺法新对照品含量×D-Asn28-胸腺法新峰面积×校正因子/胸腺法新对照品峰面积×100%=86.31%×1.583×1.04×8.98/854.044×10.70=0.14%
注：胸腺法新对照品和胸腺法新精肽的检测条件和进样量一致，都为：25μl。校正因子D-Asn28-胸腺法新的校正因子＝1.04。
胸腺法新对照品浓度：8.98mg/ml
胸腺法新对照品峰面积：854.044mAU*min（图3）
胸腺法新对照品含量：86.31%
胸腺法新精肽配制浓度：10.70mg/ml
D-Asn28-胸腺法新峰面积：1.583mAU*min（图2） 。

Claims (1)

1.一种纯化胸腺法新的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
称取含有杂质D-Asn28-的胸腺法新粗肽2.06g用纯净水35mL溶解，调节pH到3.50，充分搅拌后，过滤，得粗肽溶液，然后进行过柱纯化，条件如下：色谱柱：聚合物反相填料柱 UniPSTM10-100，50mm ×250 mm；流动相A：0.3%醋酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度程序：初始状态流动相B为5%，保持2分钟，然后在5分钟内将流动相B比例增至25%，然后在30分钟内将流动相B比例增至40%；流速为：80 mL／min；检测波长为220 nm，纯化后，并冻干得到胸腺法新0.90g。
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