CN111349152B - 一种制备胸腺法新的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了一种制备胸腺法新的方法，采用乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物对胸腺法新28肽进行选择性N‑端乙酰化制备胸腺法新。本发明不需要对胸腺法新28肽的其它氨基进行保护，避免了其它乙酰化方法需要的对赖氨酸侧链氨基进行特殊保护会用到的昂贵原料以及繁琐的脱除操作，大大简化了胸腺法新28肽N‑端乙酰化的难度，提高了胸腺法新收率，同时降低了成本，可以为发酵方法制备胸腺法新解决了最后一个阻碍，广泛适合于化学方法合成的28肽胸腺法新和基因重组制备的28肽胸腺法新乙酰化制备胸腺法新。

Description

一种制备胸腺法新的方法
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种制备胸腺法新的方法，尤其涉及一种利用选择性乙酰化法制备胸腺法新的方法
背景技术
胸腺法新(Tαl)是一种酸性多肽，含有28个氨基酸，pI为4.2，相对分子量为3108，N端乙酰化。结构式为：
Figure RE-GDA0002015564420000011
胸腺法新是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强剂。T αl可以恢复T淋巴细胞的功能并促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生。同时还具有刺激血管内皮细胞迁移，促进血管生成和伤口愈合等作用。在临床上经常将Tαl 作为免疫增强剂或免疫调节剂用于各种免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治疗以及乙型肝炎、丙型肝炎、恶性肿瘤的治疗和研究。
目前胸腺法新的合成方法主要采用Fmoc固相合成。由于胸腺法新是困难多肽，在合成过程中形成β折叠，导致合成困难，纯度和产量均较低。采用骨架保护基的方法虽然可以大大改善β折叠的产生，但不能在固相上进行乙酰化，只能采用骨架保护基的方法先合成28肽，然后在液相进行N端乙酰化。而由于胸腺法新序列中包括4个赖氨酸，在进行乙酰化时赖氨酸侧链氨基也会被乙酰化，这又涉及到赖氨酸侧链氨基的正交保护和脱保护步骤，大大加大物料成本和操作难度。
由于化学合成的成本高产量低，而且环境不友好。有很多文献尝试了采用基因工程重组制备胸腺法新。其中大肠杆菌作为基因工程常用菌，具有遗传背景清楚、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单、重组子稳定的特点，因此很多研究者都把大肠杆菌作为首选菌种。但大肠杆菌表达的Tαl虽然与 Tαl具有相同的氨基酸组成，但N端缺少乙酰化修饰，严重限制了基因工程重组制备胸腺法新的应用。到目前为止，仍无基因工程制备的胸腺法新申报药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题提供一种制备胸腺法新的方法，所述方法可以选择性的对通过化学方法合成的28肽胸腺法新和基因重组制备的28肽胸腺法新N端进行乙酰化。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备胸腺法新的方法，包括：
步骤1：乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物与胸腺法新28肽在吡啶/乙酸缓冲液中进行偶联反应，然后去除反应溶剂；
步骤2：取步骤1所得产物与TFA溶液混合得到胸腺法新粗品的TFA溶液；
步骤3：将胸腺法新粗品的TFA溶液加入不良溶剂中沉降，离心分离析出的固体，用不良溶剂洗涤，经氮气吹扫和干燥后制得胸腺法新粗品。
作为优选，所述乙酰水杨醛类似物具有式Ⅰ所示结构，
Figure RE-GDA0002015564420000021
其中，R1独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R2独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3；
R3独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R4独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3。
作为优选，步骤1所述吡啶/乙酸缓冲液为吡啶和乙酸的混合溶液，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:(1～10)。
作为优选，步骤1所述胸腺法新28肽的反应浓度为5～50mM。
作为优选，步骤1所述胸腺法新28肽与乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物的摩尔比为1:(1～10)；步骤1所述偶联反应的时间为2-5h。
作为优选，步骤2所述TFA溶液为含50～100％TFA的水溶液。
作为优选，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入5～15mlTFA 溶液。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤3所述的不良溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、石油醚中的一种或两种以上的混合溶剂。
作为优选，步骤3所述不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的5～15 倍。
进一步的，作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法还包括经反相高效液相色谱纯化后干燥制得胸腺法新精肽的步骤。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种制备胸腺法新的方法采用乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物对胸腺法新28肽进行选择性N-端乙酰化制备胸腺法新。本发明不需要对胸腺法新28肽的其它氨基进行保护，避免了其它乙酰化方法需要的对赖氨酸侧链氨基进行特殊保护会用到的昂贵原料以及繁琐的脱除操作，大大简化了胸腺法新28肽N-端乙酰化的难度，提高了胸腺法新收率，同时降低了成本，可以为发酵方法制备胸腺法新解决了最后一个阻碍，广泛适合于化学方法合成的28肽胸腺法新和基因重组制备的28肽胸腺法新乙酰化制备胸腺法新。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2制备的胸腺法新粗品的质谱检测图；
图2示实施例4制备的胸腺法新粗品的质谱检测图；
图3示实施例6制备的胸腺法新粗品的质谱检测图；
图4示实施例7制备的胸腺法新粗品的质谱检测图；
图5示实施例8制备的胸腺法新粗品的质谱检测图。
具体实施方式
本发明公开了一种制备胸腺法新的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备胸腺法新的方法，包括：
步骤1：乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物与胸腺法新28肽在吡啶/乙酸缓冲液中进行偶联反应，然后去除反应溶剂；
步骤2：取步骤1所得产物与TFA溶液混合得到胸腺法新粗品的TFA溶液；
步骤3：将胸腺法新粗品的TFA溶液加入不良溶剂中沉降，离心分离析出的固体，用不良溶剂洗涤，经氮气吹扫和干燥后制得胸腺法新粗品。
本发明所述方法采用乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物对胸腺法新28肽进行选择性N-端乙酰化制备胸腺法新。
作为优选，所述乙酰水杨醛类似物具有式Ⅰ所示结构，
Figure RE-GDA0002015564420000041
其中，R1独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R2独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3；
R3独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R4独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3。
在一些实施方案，所述乙酰水杨醛可以通过水杨醛与乙酸酐进行乙酰化反应制备得到。具体方法可参照相关手册或文献进行。
在一些实施方案，所述乙酰水杨醛类似物可以通过水杨醛的苯环取代衍生物与乙酸酐进行乙酰化反应制备得到。所述水杨醛的苯环取代衍生物为具有式Ⅱ所示结构的酚：
Figure RE-GDA0002015564420000051
其中，R1独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R2独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3；
R3独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n＝1、2、3或4；
R4独立选自-H，-NO2，-S(＝O)CH3。
在一些实施方案中，所述乙酰水杨醛类似物为4-甲氧基乙酰水杨醛、5- 硝基乙酰水杨醛、4-甲氧基5-硝基乙酰水杨醛或6-甲氧基乙酰水杨醛。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法步骤1所述吡啶/乙酸缓冲液为吡啶和乙酸的混合溶液，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:(1～10)。在一些具体实施例中，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:1。在一些具体实施例中，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:5。在一些具体实施例中，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:2。在一些具体实施例中，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:3。在一些具体实施例中，所述吡啶与乙酸的摩尔比为1:4。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤1所述胸腺法新28肽的反应浓度为5～50mM。在一些具体实施例中，所述胸腺法新28肽的反应浓度为20mM；在一些具体实施例中，所述胸腺法新28肽的反应浓度为30mM；在一些具体实施例中，所述胸腺法新28肽的反应浓度为29mM；在一些具体实施例中，所述胸腺法新28肽的反应浓度为26mM。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤1所述胸腺法新28肽与乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物的摩尔比为1:(1～10)。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤1所述偶联反应的时间为2-5h。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤1所述去除溶剂的方法为减压蒸馏或冻干去除。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤2所述TFA溶液为含 50～100％TFA的水溶液。在一些具体实施例中，所述TFA溶液为含有TFA和 TIS的水溶液，其中TFA：TIS：H2O的体积比为90:5:5。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，所述TFA溶液用量为每1 克胸腺法新28肽加入5～15mlTFA溶液。在一些具体实施例中，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入10mlTFA溶液。在一些具体实施例中，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入8mlTFA溶液。在一些具体实施例中，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入8.7mlTFA溶液。在一些具体实施例中，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入6.7mlTFA 溶液。
本发明所述制备胸腺法新的方法步骤3采用不良溶剂对胸腺法新粗品的 TFA溶液进行沉降。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤3所述的不良溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、石油醚中的一种或两种以上的混合溶剂。在一些具体实施例中，所述的不良溶剂为乙醚；在一些具体实施例中，所述的不良溶剂为甲基叔丁基醚与正己烷体积比为1:1的混合溶剂；在一些具体实施例中，所述的不良溶剂为异丙醚。
作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法，步骤3所述不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的5～15倍。在一些具体实施例中，不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的6.7倍；在一些具体实施例中，不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的10倍。在一些具体实施例中，不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的12倍。在一些具体实施例中，不良溶剂的用量为步骤2 所述TFA溶液的8倍。
进一步的，作为优选，本发明所述制备胸腺法新的方法还包括经反相高效液相色谱纯化后干燥制得胸腺法新精肽的步骤。
在一些实施方案中，所述反相高效液相色谱纯化具体为通过C18柱2次纯化、转盐。在一些具体实施例中，所述第一次纯化条件为流动相A相为 0.1％TFA，B相为乙腈，检测波长220nm，流速80ml/min；所述第二次纯化条件为流动相A相为0.3％醋酸，B相为乙腈，检测波长220nm，流速80ml/min；所述转盐条件为流动相A相为20mM乙酸铵/水溶液，B相为乙腈，检测波长 220nm，流速80ml/min。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种制备胸腺法新的方法采用乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物对胸腺法新28肽进行选择性N-端乙酰化制备胸腺法新。本发明不需要对胸腺法新28肽的其它氨基进行保护，避免了其它乙酰化方法需要的对赖氨酸侧链氨基进行特殊保护会用到的昂贵原料以及繁琐的脱除操作，大大简化了胸腺法新28肽N-端乙酰化的难度，提高了胸腺法新收率，同时降低了成本，可以为发酵方法制备胸腺法新解决了最后一个阻碍，广泛适合于化学方法合成的28肽胸腺法新和基因重组制备的28肽胸腺法新乙酰化制备胸腺法新。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中实施例中所涉及的TFA为三氟乙酸，TIS为三异丙基硅烷。
实施例1、乙酰水杨醛的制备
向100ml圆底烧瓶中加入4.884g/40mmol水杨醛，加30ml二氯甲烷，磁力搅拌溶解。称取6.126g/60mmol乙酸酐和4.746g/60mmol吡啶，室温搅拌3 小时后TLC检测原料消失。将反应体系中加入70ml的1N盐酸中，萃取分离。有机相依次再用1N盐酸萃取2次、水洗一次、饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次后再水洗三次。所得有机相经无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂真空干燥得，白色蜡状固体6.354g，收率96.8％。
实施例2、采用乙酰水杨醛进行N端乙酰化制备胸腺法新粗品
称取胸腺法新28肽(固相偶联制备)1.5g/0.49mmol，加入24.5ml吡啶/ 醋酸溶液(mole:mole＝1:1)中(胸腺法新28肽的反应浓度为0.49mmol/0.024 5L＝20mmol/L)，磁力搅拌溶解后加入0.33g/2mmol乙酰水杨醛，搅拌反应2 h后，反应液减压旋除大部分溶剂，残余粘稠固体加15mlTFA溶液(TFA：T IS：H2O＝90:5:5)，磁力搅拌5分钟后减压旋除约一半TFA。将残余液体倒入100ml乙醚中，离心分离析出的固体，再用适量乙醚洗涤所得固体。氮气吹扫所得固体至干裂后，真空干燥得胸腺法新粗品1.46g，纯度90.23％，质谱检测[M+H]+:3108.598。
实施例3、4-甲氧基乙酰水杨醛的制备
向100ml圆底烧瓶中加入6.1g/40mmol 4-甲氧基水杨醛，加30ml二氯甲烷，磁力搅拌溶解。称取6.1g/60mmol乙酸酐和4.7g/60mmol吡啶，室温搅拌3小时后TLC检测原料消失。将反应体系中加入70ml的1N盐酸中，萃取分离。有机相依次再用1N盐酸萃取2次、水洗一次、饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次后再水洗三次。所得有机相经无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂真空干燥，得白色固体7.54g，收率97.1％。
实施例4、N端乙酰化制备胸腺法新粗品
称取胸腺法新28肽(发酵方法制备)1.5g/0.49mmol，加入16.5ml吡啶/ 醋酸溶液(mole:mole＝1:5)中(胸腺法新28肽的反应浓度为0.49mmol/0.0165L＝30mmol/L)，磁力搅拌溶解后加入0.78g/4mmol 4-甲氧基乙酰水杨醛，搅拌反应5h后，反应液通过冻干除溶剂，所得固体加12ml TFA 溶液(TFA：TIS：H2O＝90:5:5)，磁力搅拌5分钟后将反应液倒入120ml乙醚中，离心分离析出的固体，再用适量乙醚洗涤该固体。氮气吹扫所得固体至干裂后，真空干燥得胸腺法新粗品1.42g，纯度91.01％，质谱检测 [M+H]+:3108.574。
实施例5、5-硝基乙酰水杨醛的制备
向100ml圆底烧瓶中加入6.7g/40mmol 5-硝基水杨醛，加30ml二氯甲烷，磁力搅拌溶解。称取6.1g/60mmol乙酸酐和4.7g/60mmol吡啶，室温搅拌过夜后TLC检测原料消失。将反应体系中加入70ml的1N盐酸中，萃取分离。有机相依次再用1N盐酸萃取2次、水洗一次、饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次后再水洗三次。所得有机相经无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂真空干燥，得黄色固体7.24g，收率86.6％。
实施例6、N端乙酰化制备胸腺法新粗品
称取胸腺法新28肽(发酵方法制备)1.5g/0.49mmol，加入16.8ml吡啶/ 醋酸溶液(mole:mole＝1:2)中(胸腺法新28肽的反应浓度为 0.49mmol/0.0168L＝29mmol/L)，磁力搅拌溶解后加入0.15g/0.72mmol 5-硝基乙酰水杨醛，搅拌反应2h后，反应液通过冻干除溶剂，所得固体加13ml TFA 溶液(TFA：TIS：H2O＝90:5:5)，磁力搅拌5分钟后将反应液倒入120ml甲基叔丁基醚:正己烷＝1:1(V:V)中，离心分离析出的固体，再用适量甲基叔丁基醚洗涤该固体。氮气吹扫所得固体至干裂后，真空干燥得胸腺法新粗品1.38g，纯度89.93％，质谱检测[M+H]+:3108.283。
实施例7、用4-甲氧基5-硝基乙酰水杨醛进行N端乙酰化制备胸腺法新粗品
称取胸腺法新28肽(发酵方法制备)1.5g/0.49mmol，加入16.8ml吡啶/ 醋酸溶液(mole:mole＝1:3)中(胸腺法新28肽的反应浓度为 0.49mmol/0.0168L＝29mmol/L)，磁力搅拌溶解后加入0.21g/0.88mmol 4-甲氧基5-硝基乙酰水杨醛，搅拌反应2h后，反应液通过冻干除溶剂，所得固体加 10ml TFA溶液(TFA：TIS：H2O＝90:5:5)，磁力搅拌5分钟后将反应液倒入 120ml异丙醚中，离心分离析出的固体，再用适量异丙醚洗涤该固体。氮气吹扫所得固体至干裂后，真空干燥得胸腺法新粗品1.35g，纯度91.21％，质谱检测[M+H]+:3108.390。
实施例8、用6-甲氧基乙酰水杨醛进行N端乙酰化制备胸腺法新粗品
称取胸腺法新28肽(发酵方法制备)1.5g/0.49mmol，加入18.8ml吡啶/ 醋酸溶液(mole:mole＝1:4)中(胸腺法新28肽的反应浓度为 0.49mmol/0.0188L＝26mmol/L)，磁力搅拌溶解后加入0.33g/1.7mmol 6-甲氧基乙酰水杨醛，搅拌反应2h后，反应液通过冻干除溶剂，所得固体加10ml TFA 溶液(TFA：TIS：H2O＝90:5:5)，磁力搅拌5分钟后将反应液倒入80ml异丙醚中，离心分离析出的固体，再用适量异丙醚洗涤该固体。氮气吹扫所得固体至干裂后，真空干燥得胸腺法新粗品1.40g，纯度91.32％，质谱检测 [M+H]+:3108.259。
实施例9、纯化制备胸腺法新
将胸腺法新粗品2.4g通过C18柱2次纯化、转盐、冷冻干燥后得到目标产物。第一步纯化条件：流动相A相为0.1％TFA，B相为乙腈，检测波长220nm，流速80ml/min。第二步纯化条件：流动相A相为0.3％醋酸，B相为乙腈，检测波长220nm，流速80ml/min。转盐条件：流动相A相为20mM乙酸铵/水溶液，B相为乙腈，检测波长220nm，流速80ml/min。冷冻干燥后得胸腺法新精肽2.03g，HPLC纯度99.79％。

Claims (6)

1.一种制备胸腺法新的方法，包括：
步骤1：乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物与胸腺法新28肽在吡啶/乙酸缓冲液中进行偶联反应，然后去除反应溶剂；
步骤2：取步骤1所得产物与TFA溶液混合得到胸腺法新粗品的TFA溶液；
步骤3：将胸腺法新粗品的TFA溶液加入不良溶剂中沉降，离心分离析出的固体，用不良溶剂洗涤，经氮气吹扫和干燥后制得胸腺法新粗品；
所述乙酰水杨醛类似物具有式Ⅰ所示结构，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式Ⅰ
其中，R1独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n=1、2、3或4；
R2独立选自-H，-NO2，-S(=O)CH3；
R3独立选自-H，-CnH2n+1，-OCnH2n+1，n=1、2、3或4；
R4独立选自-H，-NO2，-S(=O)CH3；
步骤1所述胸腺法新28肽与乙酰水杨醛或乙酰水杨醛类似物的摩尔比为1:（1~10）；所述反应时间为2-5h；
步骤3所述的不良溶剂为乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、正己烷、石油醚中的一种或两种以上的混合溶剂；
步骤3所述不良溶剂的用量为步骤2所述TFA溶液的5~15倍。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤1所述吡啶/乙酸缓冲液为吡啶和乙酸的混合溶液，摩尔比为1:（1~10）。
3.根据权利要求1所述的方法，步骤1所述胸腺法新28肽的反应浓度为5~50mM。
4.根据权利要求1所述的方法，步骤2所述TFA溶液为含50~100%TFA的水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，所述TFA溶液用量为每1克胸腺法新28肽加入5~15mlTFA溶液。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，还包括经反相高效液相色谱纯化后干燥制得胸腺法新精肽的步骤。
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