CN103833842A - 一种辛卡利特的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种辛卡利特的制备方法。该方法包括：固相合成Fmoc-Phe-树脂；按照辛卡利特肽序，在Fmoc-Phe-树脂上依次偶联氨基酸，制得辛卡利特肽树脂；辛卡利特肽树脂经裂解、沉淀，制得辛卡利特粗品；辛卡利特粗品经溶解、纯化、转盐、冻干，即得。本发明的偶联剂可提高偶联效果，降低因-Tyr（SO3Na）偶联困难而产生的副产物含量。裂解采用盐浴的方式，可防止磺酰基团的脱落，因此，本发明提供的方法可以在保证辛卡利特产品的纯度不降低的前提下，提高产品的稳定性。以本发明提供方法制备的辛卡利特收率可达42%，纯度>99%；配制成水溶液放置48h后，杂质含量未见明显增多。

Description

一种辛卡利特的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种辛卡利特的制备方法。
背景技术
胆囊收缩素（CCK）是一种具有多种分子形式且具有双重分布的脑肠肽，由33个氨基酸组成，具有激素和神经递质的作用。辛卡利特（sincalide）为一八肽分子，是胆囊收缩素的一个片段，具有胆囊收缩素的全部生物活性。其在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第二位酪氨酸上连接有磺酰基团，CAS号为：25126-32-3，分子式为C49H62N10O16S3，分子量1143.27，具有如式I所示结构。
Figure BDA0000479709270000011
研究表明：辛卡利特具有减轻肺脏间质水肿及白细胞浸润，抑制促炎细胞因子生成，改善肺组织结构损伤，改善血流动力学障碍，延缓平均动脉压下降和肺动脉压升高，改善肝、肾微循环血流，恢复心率，降低肺动脉高压，改善潮气量等作用。用于预防和治疗内毒素血症、内毒素休克、脓毒血症、多器官功能障碍综合征(MODS)、全身性炎症反应综合征（SIRS）、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等炎症与免疫性疾病。
目前，辛卡利特的制备方法主要有酶法和化学法两种。其中，酶法合成由于涉及酶制剂种类比较多、酶制剂价格昂贵，且中间产物分离困难、制备周期长，目前已不再使用酶法制备辛卡利特。化学合成是目前常用的辛卡利特制备方法。但是由于辛卡利特第二位酪氨酸上连接有一个磺酰基团，在化学合成的过程中对这个基团的处理通常有两种方式，其一为在预先合成的多肽肽序上进行磺酸化，但这种方法磺酸化的过程十分复杂，中间产物的分离不易，收率很低；其二为采用含有磺酸基团的酪氨酸作为原料进行合成，但这种方式偶联困难，且需格外注意防止磺酸基团的脱落，在偶联或树脂裂解的过程中易产生大量副产物，从而导致产品的纯度较低、稳定性不佳。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种辛卡利特的制备方法，该方法制备的辛卡利特产品在保证纯度的同时性质更加稳定。
本发明提供了一种辛卡利特的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：固相合成Fmoc-Phe-树脂；
步骤2：在Fmoc-Phe-树脂上依次偶联-Asp、-Met、-Trp、-Gly、-Met、-Tyr（SO3Na）、-Asp，制得辛卡利特肽树脂；
步骤3：辛卡利特肽树脂经裂解、沉淀，制得辛卡利特粗品；
步骤4：辛卡利特粗品经溶解、纯化、转盐、冻干，即得；
偶联的偶联剂为HBTU、HOBT与DIPEA的混合物或PyAOP、HOAt与DIPEA的混合物；
裂解的条件为：于-5℃～10℃盐浴30min～120min。
本发明采用的偶联剂可以提高偶联效果，更重要的是降低了现有技术中由于-Tyr（SO3Na）偶联困难而产生的副产物的含量。提高了辛卡利特产品的纯度和稳定性。裂解采用盐浴的方式，可以有效防止磺酰基团的脱落，进一步的提高了辛卡利特产品的纯度以及稳定性。
作为优选，-Asp的侧链保护基为OtBu，Trp的侧链保护基为Boc。
优选的，偶联-Asp采用Fmoc-Asp（OtBu）-OH；偶联-Met采用Fmoc-Met-OH；偶联-Trp采用Fmoc-Trp（Boc）-OH；偶联-Gly采用Fmoc-Gly-OH；偶联-Tyr（SO3Na）采用Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH。
作为优选，偶联-Tyr（SO3Na）采用的偶联剂为PyAOP、HOAt与DIPEA的混合物，其中PyAOP、HOAt与DIPEA的质量比为1:1.2:2。
作为优选，偶联的时间为1h～4h，温度为18～30℃。
作为优选，偶联-Tyr（SO3Na）时，-Tyr（SO3Na）与树脂的摩尔比为2:1。
Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH原料来源不易，价格较高，而采用本发明提供的偶联方法，可以大大提高偶联效率，从而降低了Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH的使用量，节约了成本。
作为优选，裂解的裂解液的裂解液采用TFA与CH2Cl2的混合物，其中TFA与CH2Cl2的体积比为（70～95）:（30～5）。
作为优选，树脂为sieber Amide树脂、Rink Amide树脂、MBHA Resin树脂或Rink amide-MBHA Resin树脂。
优选的，树脂为sieber Amide树脂。
sieber Amide树脂作为载体，可使多肽更容易裂解，避免了长时间的裂解过程，从而避免了多肽受裂解液的作用而导致磺酰基团脱落。
作为优选，树脂的替代度为0.1mmol/g～1.0mmol/g。
作为优选，沉淀采用无水乙醚。
作为优选，溶解的溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈的体积百分数为10%～50%，溶剂的pH值为5.0～10.0。
优选的，pH值的调节采用氨水。
作为优选，纯化采用反向HPLC法。
优选的，纯化采用柱子的填料采用键合基团为C1、C4、C8或C18的硅胶柱。
更优选的，纯化采用C4硅胶柱。
优选的，反向HPLC的流动相A相为磷酸盐溶液、醋酸盐溶液、枸橼酸盐溶液或盐酸盐溶液。
优选的，反向HPLC的流动相A相的浓度为10mM～100mM，pH值为5.0～8.0。
更优选的，流动相A相为pH值为7.0的磷酸盐溶液。
采用pH值为7.0的磷酸盐溶液作为流动相A相，出峰较窄，后处理容易。
作为优选，转盐具体转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐，铵盐或无盐。
作为优选，转为无盐或钠盐。
作为优选，转盐色谱的柱子填料为聚合物微球。
优选的，聚合物微球为单分散性聚合物微球。
选用聚合物微球作为转盐色谱的柱填料可以避免硅胶填料在pH较高的条件下被水解。
作为优选，转盐色谱流动相A相的pH值为7.0～9.0。
优选的，转盐色谱流动相A相的pH值为8.0。
优选的，转盐色谱流动相A相为氨水溶液或稀NaOH溶液。
本发明提供了一种辛卡利特的制备方法，包括：固相合成Fmoc-Phe-树脂；按照辛卡利特肽序，在Fmoc-Phe-树脂上依次偶联-Asp、-Met、-Trp、-Gly、-Met、-Tyr（SO3Na）、-Asp，制得辛卡利特肽树脂；辛卡利特肽树脂经裂解、沉淀，制得辛卡利特粗品；辛卡利特粗品经溶解、纯化、转盐、冻干，即得。本发明采用的偶联剂可以提高偶联效果，降低现有技术中由于-Tyr（SO3Na）偶联困难而产生的副产物的含量。裂解采用盐浴的方式，可以有效防止磺酰基团的脱落，因此，本发明提供的方法可以在保证辛卡利特产品的纯度不降低的前提下，提高产品的稳定性。实验表明，采用本发明提供方法制备的辛卡利特收率可达42%，纯度>99%；本发明提供方法制备的辛卡利特在配制成水溶液放置48小时后，杂质含量未见明显增多。
附图说明
图1示本发明实施例16制得的辛卡利特的HPLC检测谱图；
图2示以本发明实施例16制得辛卡利特配制的溶液室温放置48小时后的HPLC检测谱图；
图3示对照辛卡利特配置的溶液室温放置48小时后的HPLC检测谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种辛卡利特的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
转盐色谱柱填料购自苏州纳微生物科技有限公司，型号为Uni30BPC。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Fmoc-Phe-Sieber Amide树脂的制备
在200mL的反应柱中加入20gSieber Amide树脂（1.0mmol/g）,加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Phe-OH（60mmol），HOBt（60mmol）用适量的DMF溶解，冰水浴下加入DIC（60mmol），活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。抽掉反应液，DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.90mmol/g。
实施例2：Fmoc-Phe-Rink Amide树脂的制备
在500mL的反应柱中加入50g Rink Amide树脂（0.8mmol/g）,加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Phe-OH（120mmol），HOBt（180mmol）用适量的DMF溶解,冰水浴下加入DIC（200mmol）,活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。抽掉反应液，DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.60mmol/g。
实施例3：Fmoc-Phe-MBHA Resin树脂的制备
在500ml的反应柱中加入50g MBHA Resin树脂（0.3mmol/g）,加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Phe-OH（150mmol），HOBt（180mmol）用适量的DMF溶解,冰水浴下加入DIC（180mmol）,活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。抽掉反应液，DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.29mmol/g。
实施例4：Fmoc-Phe-Rink amide-MBHA树脂的制备
在10L的反应柱中加入1000g Rink amide-MBHA树脂（0.58mmol/g）,加入DMF溶胀30分钟，溶胀完后，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Phe-OH（1800mmol），HOBt（1800mmol）用适量的DMF溶解,冰水浴下加入DIC（2700mmol）,活化3分钟，加入上述的反应柱中，室温下搅拌反应120min。反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次。用Kaiser试剂检测反应，20%的乙酸酐或者吡啶进行封闭2小时。抽掉反应液，DMF洗涤三次，DCM洗涤三次，取少量树脂用甲醇收缩三次，用真空抽干，测树脂替代度为0.55mmol/g。
实施例5：辛卡利特树脂的制备
用实施例1的Fmoc-Phe-SieberAmide树脂30mmol，将Fmoc-Asp（OtBu）-OH（120mmol），HBTU（120mmol），HOBt（120mmol），DIPEA（240mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，按照上述偶联Fmoc-Asp（OtBu）-OH的方法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Gly-OH，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH（60mmol），PyAOP(72mmol),HOAT(72mmol),DIPEA(120mmol)加入上述反应柱中，室温下搅拌反应2h，用Kaiser试剂检测反应透明后开始偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，偶联方法同偶联第2-6个氨基酸方法相同。将得到的肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到辛卡利特树脂42g。
实施例6：辛卡利特树脂的制备
用实施例1的Fmoc-Phe-Sieber Amide树脂30mmol，将Fmoc-Asp（OtBu）-OH（120mmol），HBTU（120mmol），HOBt（120mmol），DIPEA（240mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，按照上述偶联Fmoc-Asp（OtBu）-OH的方法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Gly-OH，用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次。将Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH（60mmol），PyAOP(72mmol),HOAT(72mmol),DIPEA(120mmol)加入上述反应柱中，室温下搅拌反应2h，用Kaiser试剂检测反应透明后开始偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，偶联方法同偶联第2-6个氨基酸方法相同。将得到的肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到辛卡利特树脂45g。
实施例7：辛卡利特树脂的制备
用实施例2的Fmoc-Phe-Rink Amide树脂55mmol，将Fmoc-Asp（OtBu）-OH（220mmol），HBTU（220mmol），HOBt（220mmol），DIPEA（440mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，按照上述偶联Fmoc-Asp（OtBu）-OH的方法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Gly-OH。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH（110mmol），PyAOP(132mmol),HOAT(132mmol)，DIPEA(220mmol)加入上述反应柱中，室温下搅拌反应2h，用Kaiser试剂检测反应透明后开始偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，偶联方法同偶联第2～6个氨基酸方法相同。将得到的肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到辛卡利特树脂79g。实施例8：辛卡利特树脂的制备
用实施例3的Fmoc-Phe-MBHA Resin树脂55mmol，将Fmoc-Asp（OtBu）-OH（220mmol），HBTU（220mmol），HOBt（220mmol），DIPEA（440mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，按照上述偶联Fmoc-Asp（OtBu）-OH的方法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Gly-OH。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH（110mmol），PyAOP(132mmol)，HOAT(132mmol)，DIPEA(220mmol)加入上述反应柱中，室温下搅拌反应2h，用Kaiser试剂检测反应透明后开始偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，偶联方法同偶联第2-6个氨基酸方法相同。将得到的肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到辛卡利特树脂84g。
实施例9：辛卡利特树脂的制备
用实施例4的Fmoc-Phe-Rink amide-MBHA树脂1200mmol，将Fmoc-Asp（OtBu）-OH（6000mmol），HBTU（6000mmol），HOBt（6000mmol），DIPEA（12000mmol）用适量DMF溶解后加入上述反应柱中，室温下氮气搅拌120分钟。用Kaiser试剂检测反应完后，真空抽去反应液，用DMF洗涤三次，DCM洗涤三次。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，按照上述偶联Fmoc-Asp（OtBu）-OH的方法，依次偶联Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp（Boc）-OH，Fmoc-Gly-OH。用20%六氢吡啶/DMF(V:V)溶液脱除Fmoc保护基团。用DMF洗涤三次，再用DCM洗涤三次，将Fmoc-Tyr（SO3Na）-OH（2400mmol），PyAOP(2880mmol),HOAT(2880mmol),DIPEA(4800mmol)加入上述反应柱中，室温下搅拌反应2h，用Kaiser试剂检测反应透明后开始偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，偶联方法同偶联第2～6个氨基酸方法相同。将得到的肽树脂用甲醇收缩三次，真空干燥得到辛卡利特树脂1650g。
实施例10：辛卡利特树脂的裂解
将实施例5得到的42g辛卡利特树脂加入到500mL烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：CH2Cl2=90:10,V:V），-2℃盐浴下反应1小时，滤掉树脂，滤液加入到1L乙醚中，静置2小时，离心，得到辛卡利特粗肽20.1克，HPLC纯度为57.8%。
实施例11：辛卡利特树脂的裂解
将实施例6得到的79g辛卡利特树脂加入到1.0L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：CH2Cl2=90:10,V:V）,0℃盐浴下反应1小时，滤掉树脂，滤液加入到1L乙醚中，静置2小时，离心，得到辛卡利特粗肽22.5克，HPLC纯度为50.9%。
实施例12：辛卡利特树脂的裂解
取实施例7中的50g辛卡利特树脂加入到1.0L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：CH2Cl2=,70:30,V:V），-5℃盐浴下反应1小时，滤掉树脂，滤液加入到10L乙醚中，静置2小时，离心，得到辛卡利特粗肽0.8克，HPLC纯度为52.1%。
实施例13：辛卡利特树脂的裂解
取实施例8中的50g辛卡利特树脂加入到1.0L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：CH2Cl2=95:5,V:V），10℃盐浴下反应1小时，滤掉树脂，滤液加入到10L乙醚中，静置2小时，离心，得到辛卡利特粗肽0.32克，HPLC纯度为52.1%。
实施例14：辛卡利特树脂的裂解
取实施例9中的500g辛卡利特树脂加入到10L烧瓶中，加入配置好的裂解液（TFA：CH2Cl2=90:10,V:V）,0℃盐浴下反应1小时，滤掉树脂，滤液加入到10L乙醚中，静置2小时，离心，得到辛卡利特粗肽160克，HPLC纯度为52.1%。
实施例15：辛卡利特粗肽纯化与转盐
将实施例10得到的20.1g粗肽，加入50mL乙腈和120mL水，用氨水调pH值至9.0，超声至辛卡利特粗肽全部溶解，静置24h，过滤，检测色谱纯度为57.8%。辛卡利特溶液以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
Figure BDA0000479709270000091
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2%，pH值6.50的磷酸二氢钠为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
Figure BDA0000479709270000092
辛卡利特，得到纯度大于99%的辛卡利特溶液，待转为稳定的无盐。
以装有聚合物微球填料，直径为100mm的色谱柱为固定相，以pH为8.0的稀氨水溶液为A1相，以纯水作为A2相，以纯乙腈为流动相B相，按照
Figure BDA0000479709270000093
等度洗脱15min→95%A2+5%B等度15min→50%A2+50%B等度洗脱至样品完全下柱。得到纯度大于99%，常规条件下非常稳定的辛卡利特样品，经旋蒸浓缩，冻干得到辛卡利特纯品8.5g，总收率为38%。
实施例16：辛卡利特粗肽纯化与转盐
将实施例11得到的22.5g粗肽，加入50ml乙腈和120ml水，用氨水调pH值至9.0，超声至辛卡利特粗肽全部溶解，静置24h，过滤，检测色谱纯度为58.8%。辛卡利特溶液以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C4，
Figure BDA0000479709270000101
10μ）的填料，直径100mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2%，pH值7.00的磷酸二氢钠为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
Figure BDA0000479709270000102
辛卡利特，得到纯度大于99%的辛卡利特溶液，待转为稳定的无盐。
以装有聚合物微球填料，直径为100mm的色谱柱为固定相，以pH为8.0的稀氨水溶液为A1相，以纯水作为A2相，以纯乙腈为流动相B相，按照
Figure BDA0000479709270000103
等度洗脱15min→95%A2+5%B等度15min→50%A2+50%B等度洗脱至样品完全下柱。得到纯度大于99%，常规条件下非常稳定的辛卡利特样品，经旋蒸浓缩，冻干得到辛卡利特纯品9.2g，总收率为42%。
实施例17：辛卡利特粗肽纯化与转盐
取实施例14得到的100g粗肽，加入300ml乙腈和700ml水，用氨水调pH值至9.0，超声至辛卡利特粗肽全部溶解，静置24h，过滤，检测色谱纯度为59.2%。辛卡利特溶液以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C4，
Figure BDA0000479709270000104
10μ）的填料，直径150mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2%，pH值7.00的磷酸二氢钠为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
Figure BDA0000479709270000105
辛卡利特，得到纯度大于99%的辛卡利特溶液，待转为稳定的钠盐。
以装有聚合物微球填料，直径为150mm的色谱柱为固定相，以pH为8.0的氢氧化钠溶液为A以纯乙腈为流动相B相，按照
Figure BDA0000479709270000106
Figure BDA0000479709270000107
等度洗脱15min→50%A2+50%B等度洗脱至样品完全下柱。得到纯度大于99%，常规条件下非常稳定的辛卡利特样品，经旋蒸浓缩，冻干得到辛卡利特纯品39.5g,，总收率为38%。
实施例18：辛卡利特粗肽纯化与转盐
取实施例14得到的100g粗肽，加入300ml乙腈和700ml水，用氨水调pH值至9.0，超声至辛卡利特粗肽全部溶解，静置24h，过滤，检测色谱纯度为59.2%。辛卡利特溶液以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C18，
Figure BDA0000479709270000111
10μ）的填料，直径150mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2%，pH值7.00的磷酸二氢钠为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
Figure BDA0000479709270000112
辛卡利特，得到纯度大于99%的辛卡利特溶液，待转为稳定的钠盐。
以装有聚合物微球填料，直径为150mm的色谱柱为固定相，以pH为8.0的氢氧化钠溶液为A相，以纯乙腈为流动相B相，按照
Figure BDA0000479709270000114
等度洗脱15min→50%A+50%B等度洗脱至样品完全下柱。得到纯度大于99%，常规条件下非常稳定的辛卡利特样品，经旋蒸浓缩，冻干得到辛卡利特纯品38.5g，总收率为37%。
实施例19：辛卡利特粗肽纯化与转盐
取实施例14得到的100g粗肽，加入300ml乙腈和700ml水，用氨水调pH值至9.0，超声至辛卡利特粗肽全部溶解，静置24h，过滤，检测色谱纯度为59.2%。辛卡利特溶液以装有十八烷基硅烷键合硅胶（C8，10μ）的填料，直径150mm的反相色谱柱为固定相，以浓度0.2%，pH值7.00的磷酸二氢钠为流动相A相，以纯乙腈溶液为流动相B相的反相色谱条件分离
Figure BDA0000479709270000116
辛卡利特，得到纯度大于99%的辛卡利特溶液，待转为稳定的无盐。
以装有聚合物微球填料，直径为150mm的色谱柱为固定相，以pH为8.0的氢氧化钠溶液为A相，以纯乙腈为流动相B相，按照
Figure BDA0000479709270000117
Figure BDA0000479709270000118
等度洗脱15min→50%A+50%B等度洗脱至样品完全下柱。得到纯度大于99%，常规条件下非常稳定的辛卡利特样品，经旋蒸浓缩，冻干得到辛卡利特纯品38.5g，总收率为37%。
实施例20：本发明提供方法制备的辛卡利特与市售辛卡利特检测
取购自的辛卡利特为对照，本发明实施例16制得的辛卡利特为样品，进行质量检测。
检测采用HPLC的方式，首先，分别取新鲜配制的辛卡利特样品与对照溶液进行检测，室温放置48h后，再次以HPLC对样品与对照溶液进行检测。检测程序一致。检测结果如图1～3所示。
其中，图1示本发明实施例16制得的辛卡利特的HPLC检测谱图；
图2示以本发明实施例16制得辛卡利特配制的溶液室温放置48小时后的HPLC检测谱图；
图3示对照辛卡利特配置的溶液室温放置48小时后的HPLC检测谱图。
如图所示，图1～3分别在8.677min处、8.679min处、8.669min处有峰，表明，在相同的HPLC检测程序下，本发明制备的辛卡利特的出峰时间与对照辛卡利特样品一致，表明本发明成功制备出了辛卡利特。
比较图2与图3，可见，本发明提供的辛卡利特在放置48小时后，杂质含量没有明显增加，而对照辛卡利特样品放置48小时后，杂质峰（位于9.258min处）明显升高。表明，本发明提供方法制备辛卡利特性质更加稳定。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种辛卡利特的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：固相合成Fmoc-Phe-树脂；
步骤2：在所述Fmoc-Phe-树脂上依次偶联-Asp、-Met、-Trp、-Gly、-Met、-Tyr（SO3Na）、-Asp，制得辛卡利特肽树脂；
步骤3：所述辛卡利特肽树脂经裂解、沉淀，制得辛卡利特粗品；
步骤4：所述辛卡利特粗品经溶解、纯化、转盐、冻干，即得；
所述偶联的偶联剂为HBTU、HOBT与DIPEA的混合物或PyAOP、HOAt与DIPEA的混合物；
所述裂解的条件为：于-5℃～10℃盐浴30min～120min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，偶联所述-Tyr（SO3Na）采用的偶联剂为PyAOP、HOAt与DIPEA的混合物，所述偶联剂中PyAOP、HOAt与DIPEA的摩尔比为1:1.2:2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解的裂解液采用TFA与CH2Cl2的混合物，所述裂解液中TFA与CH2Cl2的体积比为（70～95）:（30～5）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂为sieber Amide树脂、Rink Amide树脂、MBHA Resin树脂或Rink amide-MBHA Resin。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂的替代度为0.1mmol/g～1.0mmol/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀采用无水乙醚。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解的溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈的体积百分数为10%～50%，所述溶剂的pH值为5～10。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pH值的调节采用氨水。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化采用反向HPLC法。
10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述转盐具体转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐、铵盐或无盐。
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