CN108059665B - 一种辛卡利特的制备方法 - Google Patents
一种辛卡利特的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108059665B CN108059665B CN201711282755.5A CN201711282755A CN108059665B CN 108059665 B CN108059665 B CN 108059665B CN 201711282755 A CN201711282755 A CN 201711282755A CN 108059665 B CN108059665 B CN 108059665B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sincalide
- phase
- crude
- solution
- mass percentage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/595—Gastrins; Cholecystokinins [CCK]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一种辛卡利特的制备方法,主要解决现有酶法制备存在的试剂难以去除以及化学法存在的产品性能不稳定、收率不理想的技术问题。该方法包括如下步骤:1)将固相合成所得的粗肽用氨水充分溶解,过超滤柱;2)连接超滤柱与高压单泵,选用醋酸水作为淋洗剂,得到去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体;3)对去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.25;4)将辛卡利特粗品中间液体,用固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱,流动相为A相0.2%醋酸水溶液与B相乙腈溶液,纯化得到高纯的醋酸盐形式的辛卡利特液体;5)将得到的醋酸盐形式的辛卡利特液体浓缩冻干,最终得到含量超过98.5%的固体辛卡利特。
Description
技术领域
本发明涉及到多肽药物制备方法领域,尤其涉及到一种固相合成的辛卡利特的制备方法。
背景技术
辛卡利特是一种人工合成的胆囊素八肽,其结构序列为:H-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PHe-NH2,主要用于促胆囊收缩,胆囊诊断试剂,具有胆囊收缩素的全部生物活性。研究表明辛卡利特具有减轻肺脏间质水肿及白细胞浸润,抑制促炎细胞因子生成,改善肺组织结构损伤,改善血流动力学障碍,延缓平均动脉压下降和肺动脉压升高,改善肝肾微循环血流,回复心率,降低肺动脉高压,改善潮气量等作用。临床上可以用来治疗慢性胰腺炎,内毒素血症,内毒素休克,脓毒血症,多器官功能障碍综合症,全身性炎症反应综合征等。
目前市场上已经有一些辛卡利特的制备方法,其中酶法比较多,化学合成方法也有,但是都有一定的片面性。酶法得到的纯品,试剂种类多,不易去除,并且操作步骤相对繁琐;而化学合成方法操作步骤相对简单很多,涉及到的试剂种类也很少。由于辛卡利特该结构序列的特殊性,结构中有磺酸化基团,磺酸化基团不仅不易偶联到氨基酸上面,而且在酸性条件下极其不稳定,容易脱落。这样不仅会造成粗品肽纯度不高,产品不稳定,而且也会大大影响到最终纯品的收率情况,不利于工业化的生产。
而本发明针对这几个方面的缺陷,在对粗品纯化之前增加了一步去盐的处理,聚苯乙烯基质的填料耐碱性,可以保证再对调节pH值过后的辛卡利特液体有很好的吸附洗脱;C18键合的硅胶基质可以在淋洗粗品的时候,去除固相合成中带有的化学试剂以及部分的残基。这种处理方法可以缓解后面纯化流动相条件的选择压力,并且可以减少转盐这一步的操作,使得操作起来更加的简单。其中这两种基质的比例不同,会大大影响造成去盐的程度以及后续纯化得到的产品收率,本发明的优势就是寻得合适的比例分配,在最大程度上保证产品的稳定性,并且提高产品的得率,使得产品能够更有效率的投入工业化的生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以更加稳定得到辛卡利特纯品的方法。主要解决现有酶法制备存在的试剂难以去除以及化学法存在的产品性能不稳定、收率不理想的技术问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
一种固相合成制备辛卡利特的方法,该方法包括以下顺序的制备步骤:
(1)将固相合成所得的粗肽用氨水充分溶解,过装填上层含有聚苯乙烯为基质,下层含有C18硅胶为基质的组装超滤柱;
(2)连接超滤柱与高压泵,调节高压泵的流速,选用醋酸水作为淋洗剂,得到去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体;
(3)对去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体用NH4HCO3溶液调节pH值为弱碱性;
(4)将辛卡利特粗品中间液体,用固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱,流动相为A相质量百分浓度为0.2%的醋酸水溶液与B相乙腈溶液,纯化收集目的峰值的肽溶液;
(5)将得到的高纯的辛卡利特液体浓缩冻干,最终得到醋酸盐形式的辛卡利特固体纯品。
步骤(1)所述的将固相合成所得的粗肽用质量百分浓度为2%的氨水充分溶解。
步骤(1)所述的组装超滤柱为上层含有聚苯乙烯为基质,下层含有C18硅胶为基质,其比例分配为5:2。
步骤(2)所述的高压泵的流速选用5-10ml/min
步骤(2)所述的选用质量百分浓度为0.2%的醋酸水作为淋洗剂。
步骤(3)所述的对去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.25。
步骤(4)所述的将pH值为7.25的辛卡利特粗品中间液体,用固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱,流动相为A相质量百分浓度为0.2%的醋酸水溶液与B相乙腈溶液。
步骤(4)所述的B相乙腈的质量百分浓度为10-65%,优选12%-55%。
本发明的有益效果:最主要的是在纯化之前选择一种合适的去盐方法,先经过超滤柱余高压泵,超滤柱内上层装填聚苯乙烯基质,下层装填C18硅胶基质,同时调节高压泵的流速,选用弱酸质量百分浓度为0.2%的醋酸水作为淋洗剂。通过这两种不同基质的分配比例来更好的调节去盐的效果,用质量百分浓度为0.2%醋酸水这种弱酸溶液作为淋洗剂,不仅为了更好的透过这两种基质,而且也最大程度上保证了产品的稳定性。这种方法的提出可以减轻后续纯化流动相选择的压力,并且可以简化操作步骤,为后续的工业化稳定化的生产,或者制药方面的研究,提出更加宝贵可取的方案。
附图说明
图1为实施例1产物色谱图。
图2为实施例2产物色谱图。
图3为实施例3产物色谱图。
图4为实施例4产物色谱图。
具体实施方式
实施例1
1.粗品样品的去盐处理
(1) 将固相合成所得的粗肽5g用质量百分浓度为1%的氨水500ml充分溶解,待用;
(2)先用直径为2cm的玻璃柱。上层装填聚苯乙烯基质300g,下层装填C18硅胶基质100g,用甲醇浸润整个基质,待用;
(3)连接玻璃柱与高压泵,调节高压泵的流速为5ml/min;
(4)配比醋酸水溶液质量百分浓度为0.15%,体积500ml;
(5)先将甲醇溶液全部抽离基质,将用质量百分浓度为1%的氨水溶液溶解的粗品倒入玻璃柱内,调节高压泵的流速5ml/min待粗品液体透过平顶基质,再加500ml醋酸水继续淋洗,收集产品液体;
(6)测收集后的产品溶液pH值为4.6。
2.纯化
(1) 对收集后的产品液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.1;
(2)纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:5cm×25cm.流动相:A相:质量百分浓度为0.15%的醋酸水溶液,B相:色谱纯乙腈。流速:40-55ml/min。检测波长:220nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:10-60%,梯度处理时间40-60min。进样量为收集后的样品溶液;
(3)纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度60%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为样品溶液,线性梯度洗脱,收集目的峰;
(4)将收集好的样品溶液直接进行减压浓缩冻干,最终得到含有醋酸盐形式的辛卡利特纯品,纯度大于98.5%,收率高达67%以上。(产物色谱见图1)。
实施例2
1.粗品样品的去盐处理
(1)将固相合成所得的粗肽5g用质量百分浓度为1.2%的氨水500ml充分溶解,待用;
(2)先用直径为2cm的玻璃柱。上层装填聚苯乙烯基质350g,下层装填C18硅胶基质150g,用甲醇浸润整个基质,待用;
(3)连接玻璃柱与高压泵,调节高压泵的流速为6.5ml/min;
(4)配比醋酸水溶液质量百分浓度为0.18%,体积500ml;
(5)先将甲醇溶液全部抽离基质,将用质量百分浓度为1%的氨水溶液溶解的粗品倒入玻璃柱内,调节高压泵的流速6.5ml/min待粗品液体透过平顶基质,再加500ml醋酸水继续淋洗,收集产品液体;
(6)测收集后的产品溶液pH值为4.8。
2.纯化
(1) 对收集后的产品液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.08;
(2)纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:5cm×25cm.流动相:A相:质量百分浓度为0.18%的醋酸水溶液,B相:色谱纯乙腈。流速:40-55ml/min。检测波长:220nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:10-65%,梯度处理时间40-60min。进样量为收集后的样品溶液;
(3)纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度60%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为样品溶液,线性梯度洗脱,收集目的峰;
(4)将收集好的样品溶液直接进行减压浓缩冻干,最终得到含有醋酸盐形式的辛卡利特纯品,纯度大于98.5%,收率高达75%以上。(产物色谱见图2)。
实施例3
1.粗品样品的去盐处理
(1)将固相合成所得的粗肽10g用质量百分浓度为1.7%的氨水800ml充分溶解,待用;
(2)先用直径为3cm的不锈钢柱。上层装填聚苯乙烯基质450g,下层装填C18硅胶基质200g,用甲醇浸润整个基质,待用;
(3)连接玻璃柱与高压泵,调节高压泵的流速为10.5ml/min;
(4)配比醋酸水溶液质量百分浓度为0.2%,体积800ml;
(5)先将甲醇溶液全部抽离基质,将用质量百分浓度为1.5%的氨水溶液溶解的粗品倒入玻璃柱内,调节高压泵的流速10.5ml/min待粗品液体透过平顶基质,再加800ml醋酸水继续淋洗,收集产品液体;
(6)测收集后的产品溶液pH值为5.3。
2.纯化
(1) 对收集后的产品液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.2;
(2)纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:10cm×30cm.流动相:A相:质量百分浓度为0.2%的醋酸水溶液,B相:色谱纯乙腈。流速:80-100ml/min。检测波长:220nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:12-65%,梯度处理时间60-80min。进样量为收集后的样品溶液;
(3)纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度70%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为样品溶液,线性梯度洗脱,收集目的峰;
(4)将收集好的样品溶液直接进行减压浓缩冻干,最终得到含有醋酸盐形式的辛卡利特纯品,纯度大于98.5%,收率高达83%以上。(产物色谱见图3)。
实施例4
1.粗品样品的去盐处理
(1)将固相合成所得的粗肽10.5g用质量百分浓度为2%的氨水800ml充分溶解,待用;
(2)先用直径为3cm的不锈钢柱。上层装填聚苯乙烯基质500g,下层装填C18硅胶基质200g,用甲醇浸润整个基质,待用;
(3)连接玻璃柱与高压泵,调节高压泵的流速为10ml/min;
(4)配比醋酸水溶液质量百分浓度为0.2%,体积800ml;
(5)先将甲醇溶液全部抽离基质,将用质量百分浓度为1%的氨水溶液溶解的粗品倒入玻璃柱内,调节高压泵的流速10ml/min待粗品液体透过平顶基质,再加800ml醋酸水继续淋洗,收集产品液体;
(6)测收集后的产品溶液pH值为5.7。
2.纯化
(1) 对收集后的产品液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.25;
(2)纯化条件:色谱柱:以十八烷基硅胶键合硅胶为固定相的色谱柱,柱子直径和长度为:10cm×30cm.流动相:A相:质量百分浓度为0.2%的醋酸水溶液,B相:色谱纯乙腈。流速:80-100ml/min。检测波长:220nm。梯度:流动相B的质量百分浓度:12-55%,梯度处理时间60-80min。进样量为收集后的样品溶液;
(3)纯化过程:将色谱柱用质量百分浓度70%以上的乙腈冲洗干净后上样,上样量为样品溶液,线性梯度洗脱,收集目的峰;
(4)将收集好的样品溶液直接进行减压浓缩冻干,最终得到含有醋酸盐形式的辛卡利特纯品,纯度大于98.5%,收率高达88.5%以上。(产物色谱见图4)。
Claims (5)
1.一种辛卡利特的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将固相合成所得的粗肽用氨水充分溶解,过装填上层含有聚苯乙烯为基质,下层含有C18硅胶为基质的组装超滤柱;所述的聚苯乙烯与C18硅胶其比例分配为5:2;
(2)连接超滤柱与高压泵,调节高压泵的流速,选用醋酸水作为淋洗剂,得到去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体;
(3)对去TFA盐的辛卡利特粗品中间液体用NH4HCO3溶液调节pH值为7.25;
(4)将辛卡利特粗品中间液体,用固定相为十八烷基硅烷键合硅胶的反相硅胶柱,流动相为A相质量百分浓度为0.2%的醋酸水溶液与B相乙腈溶液,纯化收集目的峰值的肽溶液;
(5)将得到的高纯的辛卡利特液体浓缩冻干,最终得到醋酸盐形式的辛卡利特固体纯品。
2.根据权利1所述的方法,其特征在于:所述氨水质量百分浓度为2%。
3.根据权利1所述的方法,其特征在于:所述的高压泵的流速选用5-10ml/min。
4.根据权利1所述的方法,其特征在于:所述的淋洗剂为质量百分浓度为0.2%的醋酸水。
5.根据权利1所述的方法,其特征在于:所述的B相乙腈的质量百分浓度为12%-55%。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711282755.5A CN108059665B (zh) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | 一种辛卡利特的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201711282755.5A CN108059665B (zh) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | 一种辛卡利特的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108059665A CN108059665A (zh) | 2018-05-22 |
CN108059665B true CN108059665B (zh) | 2021-05-18 |
Family
ID=62136182
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201711282755.5A Active CN108059665B (zh) | 2017-12-07 | 2017-12-07 | 一种辛卡利特的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108059665B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116116048B (zh) * | 2023-04-20 | 2023-07-14 | 杭州信海医药科技有限公司 | 一种超滤柱的制备及使用方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103833842A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-06-04 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种辛卡利特的制备方法 |
CN104236984A (zh) * | 2013-06-14 | 2014-12-24 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物样品纯化的装置及其应用 |
-
2017
- 2017-12-07 CN CN201711282755.5A patent/CN108059665B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104236984A (zh) * | 2013-06-14 | 2014-12-24 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种生物样品纯化的装置及其应用 |
CN103833842A (zh) * | 2014-03-20 | 2014-06-04 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种辛卡利特的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108059665A (zh) | 2018-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3064214A1 (en) | Separation and purification method for vancomycin hydrochloride of high purity | |
CN101372504B (zh) | 一种纯化去氨加压素的方法 | |
Winzerling et al. | How to use immobilized metal ion affinity chromatography | |
JP2010501013A (ja) | 水性糖ストリームから有機塩又は有機酸を得る方法 | |
CN107312073A (zh) | 一种纯化分离西曲瑞克的方法 | |
CN108059665B (zh) | 一种辛卡利特的制备方法 | |
CN103833842B (zh) | 一种辛卡利特的制备方法 | |
CN111057142B (zh) | 一种特立帕肽的纯化方法 | |
CN102250235A (zh) | 奈西立肽的制备方法 | |
CN102775475A (zh) | 一种纯化醋酸特利加压素的方法 | |
CN102382188A (zh) | 醋酸卡培立肽的制备方法 | |
CN101463080B (zh) | 一种纯化奈西利肽的方法 | |
CN103694319B (zh) | 一种布舍瑞林的纯化方法 | |
CN110785427A (zh) | 一种长链多肽的纯化方法 | |
CN103880945A (zh) | 制备高纯度胸腺法新的方法 | |
CN113061152B (zh) | 一种利用氨基型树脂分离纯化甘油葡萄糖苷的方法 | |
CN106467561A (zh) | 一种快速分离、纯化人参精氨酸糖苷的方法 | |
CN107118116A (zh) | 一种利用大孔吸附树脂分离纯化5‑氨基戊酸的方法 | |
CN112661836A (zh) | 一种布美诺肽的纯化方法 | |
CN103992378A (zh) | 一种制备醋酸地加瑞克的方法 | |
CN107312072A (zh) | 一种纯化分离阿托西班的方法 | |
CN101456898A (zh) | 一种使用氢键吸附色谱分离纯化多肽的方法 | |
CN110054709B (zh) | 一种高效提取、纯化桦褐孔菌多糖的方法 | |
CN108892711A (zh) | 一种纯化布舍瑞林的方法 | |
CN104744241A (zh) | 一种从柠檬酸发酵液中提纯柠檬酸的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |