CN107312072A - 一种纯化分离阿托西班的方法 - Google Patents

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李雪豪
陈晓航
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Abstract

本发明公开一种纯化分离阿托西班的方法，包括如下步骤：将阿托西班粗品用乙腈水溶液溶解，滤膜过滤，得到粗品溶液待用；使用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液平衡反相色谱柱；将粗品溶液载入反相色谱柱；采用流动相A、流动相B：乙腈进行梯度洗脱，并收集洗脱峰；将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩；将浓缩液转成醋酸盐的肽溶液；将转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，后进行冷冻干燥得到阿托西班成品。可完全分离阿托西班中的毒性杂质：Asp5‑阿托西班和Gly9‑OH‑阿托西班，在提高产品收率的同时提高了药品的安全性。获得的样品稳定性好，可应用于工业化生产。

Description

一种纯化分离阿托西班的方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，具体涉及一种纯化分离阿托西班的方法。
背景技术
阿托西班是一种合成的9肽，英文名为：Atosiban，为一种环状多肽，其序列如下：
c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2
阿托西班是妇产科药物中的一种突破产品，它是一种催产素类似物，是子宫内基蜕膜、胎膜上受体的催产素竞争性拮抗剂，可以直接与催产素竞争催产素受体，抑制催产素和催产素受体结合，从而直接抑制催产素作用于子宫，抑制子宫收缩；也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用，阻断第二信使的生成以及Ca2+的活动，从而间接抑制子宫对催产素的反应，使子宫收缩得到抑制，达到保胎的目的。在中国，年出生率约2000万，按目前临床统计数据，约10-15％的孕妇需要进行保胎治疗，按10％计算，病人数量约为200万。
Gly9-OH-阿托西班和Asp5-阿托西班均有较大的毒性，且在阿托西班合成过程中，上述2种杂质的比例较高。
Gly9-OH-阿托西班序列如下
c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-OH
Asp5-阿托西班序列如下：
c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asp-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2
现有技术中，专利CN103421092采用阳离子交换方法对Gly9-OH-阿托西班杂质进行分离。对Asp5-阿托西班杂质的分离尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种纯化分离阿托西班的方法，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种纯化分离阿托西班的方法，包括如下步骤：
步骤1、将阿托西班粗品用乙腈水溶液溶解，滤膜过滤，得到粗品溶液待用；
步骤2、使用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液平衡反相色谱柱；
步骤3、将步骤1的粗品溶液载入反相色谱柱；
步骤4、采用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液、流动相B：乙腈进行梯度洗脱，并收集洗脱峰；
步骤5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，得到浓缩液待用；
步骤6、将步骤5的浓缩液转成醋酸盐的肽溶液；
步骤7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，后进行冷冻干燥得到阿托西班成品。
进一步地，步骤2和步骤4中流动相A中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.05wt％～6.0wt％，pH值为4.0-6.0。
进一步地，步骤2和步骤4中流动相A中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.1wt％-1.0wt％，pH值为4.5-5.5。
进一步地，步骤4按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由85～65：15～35到45～25：55～75。
进一步地，步骤1中阿托西班粗品纯度不低于55％，Asp5-阿托西班含量不高于2％，Gly9-OH-阿托西班含量不高于5％。
进一步地，步骤1乙腈水溶液为20v/v％乙腈水溶液。
进一步地，步骤1用孔径为0.45μm滤膜过滤。
进一步地，反相色谱柱内的固定相为反相C18填料。
进一步地，步骤6用0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将步骤5的浓缩液上样至反相色谱柱中，0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转成醋酸盐的肽溶液。
进一步地，平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大。
本发明的有益效果：
本发明采用反相C18柱、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾缓冲体系(pH＝4.0-6.0)进行纯化分离。此纯化方法能有效分离阿托西班生产过程中的难分离工艺杂质：Asp5-阿托西班，即阿托西班5号位的氨基酸Asn脱酰胺变成Asp；Gly9-OH-阿托西班，即阿托西班脱酰胺杂质。可有效解决现有技术中由于Asp5-阿托西班和Gly9-OH-阿托西班未有效分离而造成收率低的难题，大大提高了纯化收率，收率高达55％，降低生产成本，且所得阿托西班产物纯度高达99.7％，毒性杂质被完全分离，提高了药品的安全性。获得的产品稳定性好，可应用于工业化生产。此纯化分离方法具有良好的经济价值和广泛的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种纯化分离阿托西班的方法，包括如下步骤：
步骤1、将阿托西班粗品用20v/v％乙腈水溶液溶解，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液待用；其中，阿托西班粗品纯度不低于55％，Asp5-阿托西班含量不高于2％，Gly9-OH-阿托西班含量不高于5％。
步骤2、使用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液平衡反相色谱柱；其中，反相色谱柱内的固定相为反相C18填料；平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，通常2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大即可。
步骤3、将步骤1的粗品溶液载入反相色谱柱。
步骤4、采用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液、流动相B：乙腈，按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由85～65：15～35到45～25：55～75，进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。其中，流动相A中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.05wt％～6.0wt％，pH值为4.0-6.0；盐浓度过低或过高均影响分离效果；pH值过高或过低，亦影响毒性杂质的分离，在此pH值下既可以保证分离度，也可以保证收集液的稳定性。优选地，磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.1wt％-1.0wt％，pH值为4.5-5.5。
步骤5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，得到浓缩液待用。
步骤6、将步骤5的浓缩液转成醋酸盐的肽溶液：用0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将步骤5的浓缩液上样至反相色谱柱中，0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转成醋酸盐的肽溶液。
步骤7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，后进行冷冻干燥得到阿托西班成品。
根据阿托西班序列，采用固相合成法逐步偶联获得阿托西班肽树脂，经裂解后得到450g阿托西班粗品，其纯度为59％，Asp5-阿托西班含量为1.6％，Gly9-阿托西班含量为3.4％，用于以下实施例。
实施例1
1、取阿托西班粗品100g，每克阿托西班粗品溶解于200ml 20v/v％乙腈水溶液中，超声处理，待粗品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2、使用流动相A平衡反相色谱柱，流动相A：0.6wt％磷酸二氢钠水溶液(氢氧化钠调pH值至5.5)，流速800ml/min。检测波长220nm。反相色谱柱规格为：20*25cm，柱内的固定相为反相C18填料。
3、将步骤1的滤液载入到反相色谱柱中。
4、用B(乙腈)％：25-65％(60min)的梯度进行洗脱，收集洗脱峰。
5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，至约50mg/ml后备用。
6、将反相色谱柱用0.3v/v％醋酸水溶液平衡后上样，上样后用0.3v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.3v/v％醋酸水溶液洗脱，收集转成醋酸盐的肽溶液。
7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩至约50mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中，冷冻干燥后得到纯度大于99.7％的阿托西班，收率为49％。本实施例制备的成品阿托西班未检测出Asp5-阿托西班和Gly9-阿托西班。
实施例2
1、取阿托西班粗品80g，每克阿托西班粗品溶解于200ml 20v/v％乙腈水溶液中，超声处理，待粗品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2、使用流动相A平衡反相色谱柱，流动相A：1.0wt％磷酸二氢钠水溶液(磷酸调pH值至4.5)，流速600ml/min。检测波长220nm。反相色谱柱规格为：20*25cm，柱内的固定相为反相C18填料。
3、将步骤1的滤液载入到反相色谱柱中。
4、用B(乙腈)％：21-61％(60min)的梯度进行洗脱，收集洗脱峰。
5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，至约50mg/ml后备用。
6、将反相色谱柱用0.5v/v％醋酸水溶液平衡后上样，上样后用0.5v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.5v/v％醋酸水溶液洗脱，收集转成醋酸盐的肽溶液。
7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩至约50mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中，冷冻干燥后得到纯度大于99.7％的阿托西班，收率为52％。本实施例制备的成品阿托西班未检测出Asp5-阿托西班和Gly9-阿托西班。
实施例3
1、取阿托西班粗品60g，每克阿托西班粗品溶解于200ml20v/v％乙腈水溶液中，超声处理，待样品完全溶解后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2、使用流动相A平衡反相色谱柱，流动相A：0.7wt％磷酸二氢钾水溶液(氢氧化钾调pH值至5.0)，流速1000ml/min。检测波长220nm。反相色谱柱规格为：20*25cm，柱内的固定相为反相C18填料。
3、将步骤1的滤液载入到反相色谱柱中。
4、用B(乙腈)％：25-65％(60min)的梯度进行洗脱，收集洗脱峰。
5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，至约50mg/ml后备用。
6、将反相色谱柱用1v/v％醋酸水溶液平衡后上样，上样后用1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集转成醋酸盐的肽溶液。
7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩至约50mg/ml，转至大小合适的不锈钢盘中，冷冻干燥后得到纯度大于99.7％的阿托西班，收率为55％。本实施例制备的成品阿托西班未检测出Asp5-阿托西班和Gly9-阿托西班。
本发明方法可完全分离阿托西班中的毒性杂质：Asp5-阿托西班和Gly9-OH-阿托西班，在提高产品收率的同时提高了药品的安全性。且此纯化方法下获得的样品稳定性好，可应用于工业化生产。

Claims (10)

1.一种纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、将阿托西班粗品用乙腈水溶液溶解，滤膜过滤，得到粗品溶液待用；
步骤2、使用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液平衡反相色谱柱；
步骤3、将步骤1的粗品溶液载入反相色谱柱；
步骤4、采用流动相A：磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的水溶液、流动相B：乙腈进行梯度洗脱，并收集洗脱峰；
步骤5、将收集的纯度大于99.7％目的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，得到浓缩液待用；
步骤6、将步骤5的浓缩液转成醋酸盐的肽溶液；
步骤7、将步骤6转成醋酸盐的肽溶液于不超过35℃下进行减压旋蒸浓缩，后进行冷冻干燥得到阿托西班成品。
2.根据权利要求1所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤2和步骤4中流动相A中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.05wt％～6.0wt％，pH值为4.0-6.0。
3.根据权利要求1所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤2和步骤4中流动相A中磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的质量浓度为0.1wt％-1.0wt％，pH值为4.5-5.5。
4.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤4按体积分数设置流动相梯度，0到60分钟A：B由85～65：15～35到45～25：55～75。
5.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤1中阿托西班粗品纯度不低于55％，Asp5-阿托西班含量不高于2％，Gly9-OH-阿托西班含量不高于5％。
6.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤1乙腈水溶液为20v/v％乙腈水溶液。
7.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤1用孔径为0.45μm滤膜过滤。
8.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，反相色谱柱内的固定相为反相C18填料。
9.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，步骤6用0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液平衡反相色谱柱后，将步骤5的浓缩液上样至反相色谱柱中，0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液冲洗柱子3个柱体积；再用50％的乙腈和50％的0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液洗脱，收集洗脱液即转成醋酸盐的肽溶液。
10.根据权利要求1或2或3所述的纯化分离阿托西班的方法，其特征在于，平衡、洗脱、冲洗反相色谱柱的流速根据反相色谱柱的规格进行设定，2*25cm反相色谱柱采用5～20ml/min的流速，其它规格的反相色谱柱流速线性放大。
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