CN111036078B - 一种GnRH拮抗剂的后处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GnRH拮抗剂的后处理方法，利用纳滤工艺结合后续的冻干工艺对GnRH拮抗剂进行浓缩处理。本发明可提高产品纯度与收率，简化步骤，降低成本，得到水分、醋酸和光密度可控的稳定产品，更加适用于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种GnRH拮抗剂的后处理方法。属于生物医药技术领域。
背景技术
GnRH拮抗剂是人工合成的促性腺激素释放激素类似物，通过抑制睾丸素来抑制前列腺癌增生和转移。GnRH拮抗剂主要包括阿巴瑞克、西曲瑞克、Nal-Glu、加尼瑞克和地加瑞克等。本发明涉及到的后处理方法主要是指纯化后样品溶液的浓缩方法和冻干工艺，后处理方法是制备GnRH拮抗剂原料药过程中非常重要的环节，会直接影响药物活性成分的质量。
现有技术中，专利CN102428097是利用过柱浓缩+真空旋蒸的方式对地加瑞克纯化后样品进行浓缩，然后冻干，专利CN201380028448则提出了三种浓缩方式，分别是通过真空旋蒸，过柱浓缩或者冻干来达到纯化后样品浓缩的目的，最后利用冻干得到合格的药物活性成分。
专利CN201380028448中虽然提到了三种浓缩方式，但是在利用真空旋蒸对样品进行浓缩时，浓缩速度较慢，效率低，浓缩时间长，旋蒸温度相对较高可能会引起样品的降解，因此并不适合大规模工业化生产；采用冻干的方式来对样品进行浓缩，不仅耗时，而且对冻干机的性能有很高的要求，同样不适合工业化生产；过柱浓缩的方法虽然在一定程度上可以达到浓缩的目的，但是缺点也很明显，过柱浓缩过程中涉及到有机溶剂的使用，对人类健康和自然环境都会造成危害，而且过柱浓缩过程中样品必然存在一定的损失，同时废液的处理也直接增加了浓缩的成本。而专利CN102428097中提到的过柱浓缩+真空旋蒸的方式不仅步骤繁琐，还增加了有机溶剂的使用，浓缩成本更高。特别要注意的是，GnRH拮抗剂因粘度较大，上述几种后处理方法在使用过程中样品会发生自聚反应，合成中的自聚将引入新的杂质，影响药物纯度，增加患者风险，虽然合成中发生自聚后加入醋酸可以解聚，但是否能解聚完全，样品是否稳定也是需要重点考虑的问题。
结合上述问题，本发明创造性地利用纳滤技术对GnRH拮抗剂纯化后样品进行浓缩的同时，在纳滤过程中加入适量醋酸以防止样品发生自聚反应，从而达到浓缩的目的，并根据冻干要求将样品纳滤到需要的浓度。在纳滤过程中不涉及到乙醇和乙腈等有机溶剂的使用，成本更低，收率更高，样品更加稳定，更加适用于大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用纳滤技术对GnRH拮抗剂纯化后样品进行浓缩的方法，以克服现有技术中上述提到的不足。
本发明提供的GnRH拮抗剂的后处理方法，包括以下步骤：
(1)纳滤前准备，安装纳滤膜，用纯化水清洗纳滤机，准备纳滤；
(2)开始纳滤，控制样品溶液温度，并在纳滤过程中加入适量醋酸，控制样品溶液醋酸含量；
(3)纳滤结束，排放出所有样品纳滤溶液，用醋酸水溶液对纳滤后溶液进行稀释，控制样品浓度；
(4)上冻干，将纳滤浓缩后样品溶液倒入冻干盘，控制溶液厚度，后进行预冻，控制预冻温度；
(5)升华干燥；
(6)解析干燥；
(7)下冻干，将样品分装入库。
在一些实施方案中，上述步骤(1)中所述纳滤膜特征为：孔径1-20nm，截留分子量200～1000道尔顿。
在一些实施方案中，上述步骤(2)中所述样品溶液温度为：0℃～35℃。
在一些实施方案中，上述步骤(2)中所述样品溶液醋酸含量为：0％～50％。
在一些实施方案中，上述步骤(3)中所述样品浓度为：5g/L～75g/L。
在一些实施方案中，上述步骤(4)中所述溶液厚度为：0.5～2.5cm。
在一些实施方案中，上述步骤(4)中所述预冻温度为：-65℃～-25℃。
在一些实施方案中，上述步骤(5)，其特征为：升华干燥温度为-15℃～15℃，升华干燥时间为10h～35h。
在一些实施方案中，上述步骤(6)，其特征为：解析干燥温度为15℃～40℃，解析干燥时间为5h～30h。
在一些实施方案中，上述步骤(7)，其特征为：控制环境温度为15℃～35℃，环境湿度为0％～60％。
如前所述的方法中，纳滤膜选自聚酰胺纳滤膜、聚醚砜纳滤膜、醋酸纤维素纳滤膜、聚乙烯醇纳滤膜、聚哌嗪纳滤膜。
如前所述的方法中，GnRH拮抗剂选自以下物质：地加瑞克、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、Nal-Glu。。
与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
与真空旋蒸浓缩相比，本专利所用纳滤工艺浓缩时间更短，效率和产能更高，相对较低的浓缩温度使样品更加稳定，更加适合于大规模工业化生产；而与过柱浓缩+真空旋蒸浓缩工艺相比，本专利所用纳滤工艺避免了乙腈等有机溶剂的使用，步骤更为简单，成本更低，收率可以达到93％以上，而且浓缩后可以达到的样品浓度更高。更重要的是纳滤过程中加入醋酸可以有效防止样品发生自聚反应，使样品更加稳定。与现有技术相比，纳滤工艺结合后续的冻干工艺不仅可以得到水分、醋酸和光密度可控的样品，而且成本更低，样品更加稳定，更加适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明中技术方案的应用作进一步详细的说明，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明。实施例不应限定为对保护范围的限制。
实施例1
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚酰胺纳滤膜，准备纳滤；
(2)取地加瑞克样品溶液20L，加入10.7L醋酸使样品溶液中醋酸含量为35％，开始纳滤；
(3)纳滤结束后排放出纳滤液，用35％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用35％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为15g/L，醋酸含量为35％，纳滤时长4h；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为0.65cm，然后进行预冻，预冻温度-35℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-10℃，升华干燥时间为15h；
(6)解析干燥，解析干燥温度20℃，解析干燥时间10h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为15℃，环境湿度为60％。
冻干后收集样品，其中水分6.6％，醋酸7.8％，光密度0.02，浓缩收率94.26％。
实施例2
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚醚砜纳滤膜，准备纳滤；
(2)地加瑞克样品溶液30L，加入醋酸3.3L使样品溶液中醋酸含量为10％，开始纳滤；
(3)纳滤6h后排放出纳滤液，用10％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用10％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为15g/L，醋酸含量为10％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为0.65cm，然后进行预冻，预冻温度-35℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为0℃，升华干燥时间为15h；
(6)解析干燥，解析干燥温度30℃，解析干燥时间10h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为15℃，环境湿度为60％。
冻干后收集样品，其中水分8.6％，醋酸8.8％，光密度0.02，浓缩收率94.56％。
实施例3
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚酰胺纳滤膜，准备纳滤；
(2)加尼瑞克样品溶液体积为30L，加入醋酸3.3L使样品溶液中醋酸含量为10％，开始纳滤。纳滤到样品溶液体积为15L时，加入3L醋酸控制样品溶液中醋酸含量为25％，然后继续纳滤；
(3)纳滤6.5h后排放出纳滤液，用25％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用25％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为26g/L，醋酸含量为25％。
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为0.85cm，然后进行预冻，预冻温度-40℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-5℃，升华干燥时间为20h；
(6)解析干燥，解析干燥温度29℃，解析干燥时间10h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为25℃，环境湿度为55％。
冻干后收集样品，其中水分8.6％，醋酸8.3％，光密度0.02，浓缩收率93.58％。
实施例4
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚酰胺纳滤膜，准备纳滤；
(2)取阿巴瑞克样品溶液30L，加入醋酸1.5L使样品溶液中醋酸含量为5％，开始纳滤，纳滤到样品溶液体积为15L时，加入醋酸1.8L使使样品溶液中醋酸含量为15％，继续纳滤；
(3)纳滤7h后排放出纳滤液，用15％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用15％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为10g/L，醋酸含量为15％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为0.85cm，然后进行预冻，预冻温度-35℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-20℃，升华干燥时间为15h；
(6)解析干燥，解析干燥温度25℃，解析干燥时间10h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为15℃，环境湿度为39％。
冻干后样品分析如下，其中水分7.6％，醋酸9.3％，光密度0.02，浓缩收率97.02％。
实施例5
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为醋酸纤维素纳滤膜，准备纳滤；
(2)地加瑞克样品溶液30L，加入醋酸1.5L使样品溶液中醋酸含量为5％，开始纳滤，纳滤到样品溶液体积为15L时，加入醋酸1.8L使使样品溶液中醋酸含量为15％，继续纳滤，纳滤到样品溶液体积为7.5L时，加入醋酸1.6L使使样品溶液中醋酸含量为30％，继续纳滤；
(3)纳滤7h后排放出纳滤液，用30％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，混合后样品浓度为30g/L，醋酸含量为30％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为1.0cm，然后进行预冻，预冻温度-45℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-5℃，升华干燥时间为20h；
(6)解析干燥，解析干燥温度27℃，解析干燥时间15h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为23℃，环境湿度为44％。
冻干后样品分析如下，其中水分7.1％，醋酸8.6％，光密度0.02，浓缩收率97.19％。
实施例6
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚醚砜纳滤膜，准备纳滤；
(2)地加瑞克样品溶液30L，加入醋酸1.5L使样品溶液中醋酸含量为5％，开始纳滤。纳滤到样品溶液体积为15L时，加入醋酸1.8L使使样品溶液中醋酸含量为15％，继续纳滤；。纳滤到样品溶液体积为7.5L时，加入醋酸3.2L使使样品溶液中醋酸含量为40％，继续纳滤；
(3)纳滤结束后排放出纳滤液，用40％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，混合后样品浓度为40g/L，醋酸含量为40％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为1.8cm，然后进行预冻，预冻温度-60℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-13℃，升华干燥时间为35h；
(6)解析干燥，解析干燥温度35℃，解析干燥时间15h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为35℃，环境湿度为35％。
冻干后样品分析如下，其中水分12.6％，醋酸16.3％，光密度0.02，浓缩收率95.33％。
实施例7
(1)纳滤前准备，将纯化后的加尼瑞克样品溶液中加入水，纳滤膜材质为聚乙烯醇纳滤膜，控制溶液中的乙腈含量为2％；
(2)加尼瑞克样品溶液40L，加入醋酸4.5L使样品溶液中醋酸含量为10％，开始纳滤；
(3)纳滤6h后排放出纳滤液，用10％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用10％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为15g/L，醋酸含量为10％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为1.25cm，然后进行预冻，预冻温度-40℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-5℃，升华干燥时间为15h；
(6)解析干燥，解析干燥温度28℃，解析干燥时间15h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为26℃，环境湿度为51％。
冻干后样品进行分析，其中水分7.7％，醋酸7.9％，光密度0.06，浓缩收率98.02％。
实施例8
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚酰胺纳滤膜，准备纳滤；
(2)加尼瑞克样品溶液30L，加入醋酸1.5L使样品溶液中醋酸含量为5％，开始纳滤，纳滤到样品溶液体积为15L时，加入醋酸1.8L使使样品溶液中醋酸含量为15％，继续纳滤；
(3)纳滤7h后排放出纳滤液，用15％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用15％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为10g/L，醋酸含量为15％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为1.5cm，然后进行预冻，预冻温度-28℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-15℃，升华干燥时间为20h；
(6)解析干燥，解析干燥温度15℃，解析干燥时间12h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为20℃，环境湿度为42％。
冻干后收集样品，其中水分9.6％，醋酸7.3％，光密度0.09，浓缩收率94.39％。
实施例9
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚酰胺纳滤膜，准备纳滤；
(2)西曲瑞克样品溶液40L，加入21.5L醋酸使样品溶液中醋酸含量为35％，开始纳滤；
(3)纳滤结束后排放出纳滤液，用35％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，然后用35％醋酸水溶液进行稀释，稀释后样品浓度为15g/L，醋酸含量为35％，纳滤时长4h；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为0.80cm，然后进行预冻，预冻温度-55℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-20℃，升华干燥时间为25h；
(6)解析干燥，解析干燥温度30℃，解析干燥时间20h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为20℃，环境湿度为45％。
冻干后收集样品，其中水分5.6％，醋酸10.8％，光密度0.12，浓缩收率95.89％。
实施例10
(1)纳滤前准备，用纯化水清洗纳滤机，纳滤膜材质为聚醚砜纳滤膜，准备纳滤；
(2)西曲瑞克样品溶液40L，加入醋酸2.1L使样品溶液中醋酸含量为5％，开始纳滤，纳滤到样品溶液体积为20L时，加入醋酸2.4L使样品溶液中醋酸含量为15％，继续纳滤，纳滤到样品溶液体积为10L时，加入醋酸2.2L使样品溶液中醋酸含量为30％，继续纳滤；
(3)纳滤7.5h后排放出纳滤液，用30％醋酸水溶液清洗纳滤机，混合纳滤液和清洗液，混合后样品浓度为30g/L，醋酸含量为30％；
(4)将稀释后样品倒入冻干盘，样品溶液厚度为1.15cm，然后进行预冻，预冻温度-43℃；
(5)升华干燥，升华干燥温度为-15℃，升华干燥时间为25h；
(6)解析干燥，解析干燥温度20℃，解析干燥时间10h；
(7)下冻干，分装入库，环境温度为35℃，环境湿度为55％。
冻干后收集样品，其中水分5.1％，醋酸6.6％，光密度0.06，浓缩收率94.19％。
对比例1
取纯化后的地加瑞克样品溶液共16L，含地加瑞克48g，进行真空旋蒸浓缩，通过真空旋蒸除去样品溶液中的有机溶剂，该步骤优选BUCHI旋转蒸发仪，浓缩过程用时9h，浓缩后样品加入适量醋酸解聚，然后过滤上冻干，条件如下：
a.真空浓缩温度：35℃；
b.真空浓缩时间：11h；
c.样品溶液中醋酸浓度为24％；
d.冻干前地加瑞克样品浓度为18g/L；
浓缩后样品进行冻干步骤，其中冻干溶液厚度为0.75cm，升华温度-5℃，解析干燥温度25℃。浓缩收率93.5％，冻干后样品利用上述方法进行检测，其中水分8.5％，醋酸10.5％，光密度0.12。
对比例2
取纯化后的地加瑞克样品8.0L，加水稀释之后用于反相色谱柱，然后用15％的醋酸水溶液：乙腈＝40:60的溶液洗脱地加瑞克样品，收集合格馏分，随后将馏分通过真空旋蒸的方式进行浓缩以除去里面的乙腈，过滤上冻干，其中冻干溶液厚度为0.75cm，升华温度-8℃，解析干燥温度23℃。冻干后样品利用实施例1中的方法进行检测，其中浓缩收率通过标定为85.25％，水分9.5％，醋酸12.5％，光密度0.06。
对比例3
纯化后的加尼瑞克样品4.0L，加水稀释之后用于反相色谱柱，然后用10％的醋酸水溶液：乙醇＝50:50的溶液洗脱加尼瑞克样品，收集合格馏分，随后将馏分通过真空旋蒸的方式进行浓缩以除去里面的乙醇，过滤上冻干，其中冻干溶液厚度为0.55cm，升华温度-12℃，解析干燥温度20℃。冻干后样品利用实施例1中的方法进行检测，其中浓缩收率通过标定为81.82％，水分6.5％，醋酸7.5％，光密度0.18。
对比例4
取纯化后的阿巴瑞克样品溶液共30L，含阿巴瑞克68g，进行真空旋蒸浓缩，通过真空旋蒸除去样品溶液中的有机溶剂，该步骤优选BUCHI旋转蒸发仪，浓缩过程用时15h，浓缩后样品加入适量醋酸解聚，然后过滤上冻干，条件如下：
a.真空浓缩温度：28℃；
b.真空浓缩时间：15h；
c.样品溶液中醋酸浓度为12％；
d.冻干前阿巴瑞克样品浓度为35g/L；
浓缩后样品进行冻干步骤，其中冻干溶液厚度为0.75cm，升华温度-15℃，解析干燥温度27℃。浓缩收率92.9％，其中水分7.5％，醋酸8.7％，光密度0.10。
从实施例与对比例的浓缩收率及光密度结果可知，与真空旋蒸浓缩及过柱浓缩+真空旋蒸浓缩工艺相比，收率可以达到93％以上，纳滤工艺浓缩时间更短，效率和产能更高。与过柱浓缩+真空旋蒸浓缩工艺相比，本专利所用纳滤工艺避免了乙腈等有机溶剂的使用，步骤更为简单，成本更低。纳滤工艺结合后续的冻干工艺不仅可以得到水分、醋酸和光密度可控的样品，样品更加稳定，更加适用于大规模工业化生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)纳滤前准备，安装纳滤膜，用纯化水清洗纳滤机，准备纳滤；
(2)开始纳滤，控制样品溶液温度，并在纳滤过程中加入醋酸，控制样品溶液醋酸含量；
(3)纳滤结束，排放纳滤溶液，用醋酸水溶液对纳滤后溶液进行稀释，控制样品浓度；
(4)上冻干，将纳滤浓缩后溶液倒入冻干盘，控制溶液厚度，后进行预冻，控制预冻温度；
(5)升华干燥；
(6)解析干燥；
(7)下冻干，将样品分装入库；
其中，
步骤(2)中，所述样品溶液温度为：0℃～35℃；
步骤(2)中，所述样品溶液醋酸含量为：10％～50％；
步骤(3)中，所述样品浓度为：5g/L～75g/L；
所述GnRH拮抗剂选自以下物质：地加瑞克、西曲瑞克、加尼瑞克、阿巴瑞克、Nal-Glu。
2.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，步骤(4)的方法中，所述溶液厚度为：0.5～2.5cm。
3.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，步骤(4)的方法中，所述预冻温度为：-65℃～-25℃。
4.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，步骤(5)的方法中，升华干燥温度为-5℃～15℃，升华干燥时间为10h～35h。
5.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，步骤(6)的方法中，解析干燥温度为15℃～40℃，解析干燥时间为5h～30h。
6.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，步骤(7)的方法中，控制环境温度为15℃～35℃，环境湿度为0％～60％。
7.如上述权利要求1中一种GnRH拮抗剂的后处理方法，其特征在于，纳滤所用纳滤膜选自聚酰胺纳滤膜、聚醚砜纳滤膜、醋酸纤维素纳滤膜、聚乙烯醇纳滤膜、聚哌嗪纳滤膜。
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