KR102435211B1 - 알부민을 고효율로 생산하는 식물 세포주 및 이의 용도 - Google Patents

알부민을 고효율로 생산하는 식물 세포주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알부민을 고효율로 생산하는 재조합 핵산, 이를 포함하는 발현 벡터 및 이것으로 형질전환된 벼 현탁세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 벼 현탁세포는 개 또는 고양이 유래의 재조합 알부민을 고효율로 생산하는 것으로, 이를 배양하여 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민을 안전하고 효율적으로 대량생산할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 상기 벼 현탁세포를 포함하는 저알부민혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물은 동물 의료현장에서의 인간 알부민 처방에 따른 안전성 문제, 사회적 논란 등의 제반문제를 해결하는데 크게 기여할 것이다.

Description

알부민을 고효율로 생산하는 식물 세포주 및 이의 용도{Plant cell lines producing recombinant albumin with high yield and uses thereof}
본 발명은 알부민을 고효율로 생산하는 식물 세포주 및 이를 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 개 또는 고양이 유래의 재조합 알부민을 고효율로 생산하는 벼 현탁세포, 이를 생산하는 방법 및 상기 벼 현탁세포 또는 이로부터 유래된 재조합 알부민 단백질을 포함하는 저알부민혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물에 관한 것이다.
인간혈청알부민(Human Serum Albumin, HSA)은, 주로 간에서 합성되는 혈액 중에 가장 많이 존재하는 단백질로써, 인체 내에서 중요한 생리학적 역할을 맡고 있다. 인간혈청알부민은 혈액 내의 지방산 등과 같은 저분자 및 빌리루빈을 비롯한 저분자 단백질들을 운반함과 동시에 콜로이드 삼투압에 의한 혈관 내·외의 수분 밸런스를 유지시키는 기능뿐만 아니라, 생체 내 항산화 기능의 대부분을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 다양한 기능성 때문에 의료분야에 있어서는, 혈액양 감소, 저단백혈증, 쇼크, 화상, 중증의 출혈, 간장/신장질환 등의 치료에 약제학적 제제로써 널리 사용되고 있다.
한편, 의료현장에서 사용되고 있는 인간혈청알부민의 대부분은 주로 인간의 채혈된 혈액으로부터 분리하여 제조되는 것으로써, 장기간 임상에서 사용되어 왔지만 바이러스 등 감염성 물질이 전파되었다는 사례가 없었던 혈액제제 중에서도 안전성이 높은 제제로 인식되어 왔다. 그러나 인간혈청알부민 제제 중에서도 DNA 바이러스인 파르보바이러스(Parvovirus) B19의 DNA가 검출된 사례가 있고, 정제공정을 거친 알부민 제제라고 하더라도 원료를 인간의 혈장에만 의존할 수밖에 없어서, 미지의 위험성은 완전히 배제할 수 없다는 인식이 새로이 전개되었다[비특허문헌 001].
이러한 배경에서 혈액으로부터 직접 제조하는 것으로 부터 벗어나 효모, 식물세포 등 다양한 생산시스템을 활용한 재조합 인간혈청알부민 개발에 대하여 본 출원인을 포함하여 많은 그룹에서 연구가 진행되어 현재 상용화까지 이르게 되었다[비특허문헌 002].
한편, 최근 반려동물 시장이 급격히 성장함에 따라 동물 의료현장에서도 간기능 장애, 신부전, 화상, 만성염증성 장질환, 종양, 림프관확장증 등 다양한 질병으로부터 기인하는 저알부민혈증의 치료에 인간혈청알부민이 활용되고 있다. 일반적으로 혈중 알부민 농도가 2.0g/dL 이하로 떨어졌을 때 인간혈청알부민을 처방하고 있다.
그러나 최근에, 개 또는 고양이의 혈청알부민(CSA/FSA; canine/feline serum albumin)의 아미노산 구성은 인간혈청알부민와 비교하면 80%의 상동성을 보임으로써, 부작용이 없는 안전한 처방에 있어서 20%의 차이를 극복하는 것이 중요한 문제점으로 대두되고 있다.
일반적으로 포유류에서의 비보존된(non-conserved) 아미노산 배열이 알러지 반응에 있어서의 활성 항원결정기(epitope)로 동정되고 있는데[비특허문헌 003 및 비특허문헌 004], 개 또는 고양이의 혈청알부민과 인간혈청알부민과의 아미노산 구성의 결정적 차이를 보이는 부분은 비보존배열인 IB 도메인(아미노산잔기 110-133)으로써 알러지 항원성에 대한 활성 에피토프로 작용하는 것으로 알려져 있다[비특허문헌 005]. 이들 IB 도메인의 서열만을 자세히 비교해 보면, CSA 54%, FSA 58%의 상동성으로 인해 항체생성의 주요원인으로 되어 안전처방에 있어서 결정적 부작용 요인으로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다(도 1 및 도 2 참조).
실제 임상 예로써, 반려동물에서의 저알부민혈증의 주요 원인 중의 하나인 염증성장질환(IBD; Inflammatory Bowel Disease)이나 단백질 소실성 장증(PLE; Protein-Losing Enteropathy)을 나타내는 개나 고양이에 통상적인 처방제로써 25% 인간혈청알부민를 투여한 결과, 심각한 급성 부작용이 나타나 사망 또는 안락사를 시킨 사례들이 보고되고 있으며, 또한 질환을 가지고 있지 않은 건강한 개나 고양이에 인간혈청알부민를 투여한 실험에서도 심각한 부종, 두드러기, 피부병변 등이 나타나고 있다[비특허문헌 006]. 이러한 부작용들은, 앞에서 기술한 인간혈청알부민과 개 또는 고양이의 혈청알부민의 아미노산 구성의 차이로 인한 면역반응의 결과로 인식되어 지고 있다.
지금까지 보고된 인간혈청알부민 처방 관련 내용을 종합하면, 인간혈청알부민를 투여한 개와 고양이에서 30% 내외의 빈도로 심한 부종, 염증, 혈액응고장애, 혈관염에 의한 피부병변, 구토, 식욕부진, 기력소실, 혈압상승, 사망 등 다양하고 심각한 부작용을 일으킨다는 결론을 내리고 있다[비특허문헌 006 및 비특허문헌 007]. 또한 이종 단백질 투여로 인한 항체생성은 2차 처방 이후의, 투여된 알부민의 효능을 무력화 시키는 요인으로 작용하기도 한다[비특허문헌 008].
즉, 한번이라도 인간혈청알부민를 처방받은 동물에 있어서는 인간혈청알부민에 대한 항체생성으로 인해 2차 처방 및 반복투여에서는 인간혈청알부민 치료 효과를 볼 수 없을 뿐만 아니라, 심각한 아나필락시스(anaphylactic shock)의 위험성이 매우 크다. 또한 동물의료현장에서의 인간혈청알부민 처방에 있어서, 미국, 유럽 등과 달리 국내에서는 동물의 질병치료에 있어서 인체 의약품 사용에 대한 제도 및 법적근거가 마련되어 있지 않아 최근 이와 관련된 사회적 논란 또한 빈번하게 일어나고 있다.
그러나 현재, 현실적으로는 인간혈청알부민를 대체할 만한 동물전용 알부민 제제가 없는 관계로 동물의료 현장에서는 부작용의 위험성을 감수하더라도 인간혈청알부민 처방을 쓰고 있는 상황이다. 일부 동물병원에서는 개나 고양이 혈액에서 제조한 혈액제제를 구매하여 사용하고 있지만, 채혈을 위한 공혈견(혈액을 제공하는 개) 대량사육문제, 오염된 혈액문제 등 사회적 논란과 안전성에 있어서 여러 가지 문제를 안고 있다. 이에 반하여 미국, 유럽 등 동물복지 선진국가에서는 반려동물의 헌혈로 수집된 혈액으로부터 제조되어, 공식허가된 혈장제제가 동물의료현장에서 활용되고 있을 뿐이다.
다만, 최근 반려동물 의료시장이 급성장함으로써, 혈액제제 수요증가로 인해 헌혈에 의한 혈액제제에만 의존할 수 없으며, 혈장으로부터 제조한 개혈청알부민은 정제공정에 의한 비용 상승으로 인해 반려동물의 의료비 부담 증가로 이어지고 있는 실정이다.
(비특허 문헌 001) Marano G, Vaglio S, Pupella S, et al. (2015) Human Parvovirus B19 and blood product safety: a tale of twenty years of improvements. Blood Transfus. 13:184-196. (비특허 문헌 002) He Y, Ning T, Xie T, et al. (2011) Large-scale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds. Proc Natl Acad Sci U S A 108(47):19078-19083. (비특허 문헌 003) Majorek KA, Porebski PJ, Dayal A, et al. (2012) Structural and immunologic characterization of bovine, horse, and rabbit serum albumins. Molecular Immunology 52(3-4):174-182. (비특허 문헌 004) Tanabe S, Kobayashi Y, Takahata Y, Morimatsu F, Shibata R, Nishimura T (2002) Some human B and T cell epitopes of bovine serum albumin, the major beef allergen. Biochem Biophys Res Commun. 293(5):1348-1353. (비특허 문헌 005) Pongprayoon P, Japrung D (2021) Revealing the structural dynamics of feline serum albumin. Structural Chemistry 32(1):69-77. (비특허 문헌 006) Cohn LA, Kerl ME, Lenox CE, Livingston RS, Dodam JR. (2007) Response of healthy dogs to infusions of human serum albumin. Am J Vet Res. 68(6):657-663. (비특허 문헌 007) Loyd KA, Cocayne CG, Cridland JM, Hause WR. (2016) Retrospective evaluation of the administration of 25% human albumin to dogs with protein-losing enteropathy: 21 cases (2003-2013). J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 26(4):587-592. (비특허 문헌 008) Martin LG, Luther TY, Alperin DC, Gay JM, Hines SA. (2008) Serum antibodies against human albumin in critically ill and healthy dogs. J Am Vet Med Assoc. 232(7):1004-1009.
본 발명은 상기와 같은 요구를 해결하고 종래기술의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 알부민을 고효율로 생산하기 위한 재조합 핵산을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 핵산을 포함하는 벼 현탁세포 및 이를 이용하는 알부민을 고효율로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 핵산, 벼 현탁세포 또는 이들로부터 유래된 재조합 알부민 단백질을 유효성분으로 포함하는 저알부민혈증을 치료하기 위한 수의학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 출원의 다른 목적 및 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 목적에 제한되지 않으며, 본 명세서에 기재된 청구범위 및 도면과 함께 하기의 발명의 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 또한 본 명세서에 기재되지 않은 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하 '통상의 기술자'라 함)라면 명확하게 이해하고 유추할 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 다음의 발명을 제공한다.
본 발명은 알부민을 고효율로 생산하기 위한, 신호 펩티드(Signal Peptide, SP)를 코딩하는 핵산 서열이 알부민 유전자의 5'-말단에 결합된 재조합 핵산을 제공한다.
일 구현예로, 상기 재조합 핵산에서 알부민 유전자는 개 또는 고양이 유래인 유전자일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 알부민 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한 일 구현예로, 상기 재조합 핵산에서 신호 펩티드는 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 또는 콩 저장단백질 A(VspA) 유래인 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 신호 펩티드는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 알부민을 고효율로 생산하기 위한, 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 알부민 유전자의 5'-말단에 결합된 재조합 핵산이 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 제공한다.
일 구현예로, 상기 발현 벡터는 5'-UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드(mature peptide)를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 발현 벡터는 서열번호 7 내지 10 중 선택된 어느 하나 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 7 내지 10의 염기서열은 5'-UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드(mature peptide)를 코딩하는 염기서열에 해당하는 서열로, 서열번호 7의 염기서열은 5'-UTR, 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 개 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결된 서열이고, 서열번호 8의 염기서열은 5'-UTR, 콩 저장단백질 A(VspA) 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 개 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결된 서열이고, 서열번호 9의 염기서열은 5'-UTR, 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결된 서열이고, 서열번호 10의 염기서열은 5'-UTR, 콩 저장단백질 A(VspA) 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 염기서열이 순차적으로 연결된 서열이다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 발현 벡터를 연속적으로 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용될 수 있으며, 예컨대, 식물세포, 대장균, 효모 또는 바실러스 속 균주 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 숙주세포는 구체적으로 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 식물세포일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 식물세포는 벼 현탁세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 고효율로 알부민을 생산하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 숙주세포는 식물세포일 수 있으며, 보다 구체적으로는 벼 현탁세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 알부민을 고효율로 생산하기 위한, 신호 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열이 알부민 유전자의 5'-말단에 결합된 재조합 핵산; 상기 재조합 핵산이 작동가능하게 연결된 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환되어 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 숙주세포; 또는 이들로부터 유래한 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민 단백질;을 유효성분으로 포함하는, 저알부민혈증을 예방 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 상기 조성물은 개 또는 고양이에게 투여하기 위한 것으로, 인간 알부민을 투여했을 때 발생되는 부작용이 감소된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 부작용은 부종, 두드러기 또는 피부병변일 수 있다.
본 발명은 또한, 알부민을 고효율로 생산하기 위한, 신호 펩티드 서열을 코딩하는 핵산 서열이 알부민 유전자의 5'-말단에 결합된 재조합 핵산; 상기 재조합 핵산이 작동가능하게 연결된 발현 벡터; 상기 발현 벡터로 형질전환되어 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 숙주세포; 또는 이들로부터 유래된 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민 단백질;을 유효성분으로 포함하는, 저알부민혈증을 예방 또는 개선하기 위한 사료첨가제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 알부민을 고효율로 생산하기 위한 재조합 핵산, 이를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 벼 현탁세포는 개 전용 재조합 CSA(rCSA; recombinant Canine Serum Albumin) 및 고양이 전용 재조합 FSA(rFSA; recombinant Feline Serum Albumin)를 안전하고 효율적으로 대량생산하기 위한 최적의 수단으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 벼 현탁세포를 배양하여 개 또는 고양이 유래의 재조합 알부민을 고효율로 생산하는 방법은 단백질 정제의 용이성, 안전성, 생산단가 등에 있어서 독보적인 기술을 제공한다.
또한, 이 기술 분야에서 해결해야할 과제인 동물 의료현장에서의 인간 알부민(HSA) 처방에 따른 안전성 문제, 사회적 논란 등의 제반문제를 해결하는데 있어, 본 발명의 벼 현탁세포 또는 이로부터 유래된 재조합 알부민 단백질을 포함하는 저알부민혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물이 크게 기여할 것이다.
도 1은 인간, 소, 개 및 고양이의 혈청알부민의 단백질 구조 및 아미노산 서열을 비교한 결과를 도시한다.
도 2는 도 1의 비교 결과, 아미노산 서열에서 결정적 차이를 보이는 비보존배열인 IB 도메인의 아미노산 구성을 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 개 알부민 유래 유전자의 염기서열이다.
도 4는 본 발명에서 사용된 고양이 알부민 유래 유전자의 염기서열이다.
도 5는 단자엽 식물에서 개 또는 고양이 알부민 유전자 발현을 위한 식물 발현벡터 유전자 지도를 나타낸다.
도 6은 쌍자엽 식물에서 개 또는 고양이 알부민 유전자 발현을 위한 식물 발현벡터 유전자 지도를 나타낸다.
도 7은 개 알부민 유전자가 도입된 벼 캘러스의 개 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석(Western blot analysis) 결과이다.
도 8은 고양이 알부민 유전자가 도입된 벼 캘러스의 고양이 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 9는 개 알부민 유전자가 도입된 담배 식물체의 개 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 10은 고양이 알부민 유전자가 도입된 담배 식물체의 고양이 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 11은 개 알부민 유전자가 도입된 감자 식물체의 개 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 12는 고양이 알부민 유전자가 도입된 감자 식물체의 고양이 알부민 생산 정도를 나타낸 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 개 알부민 생산수율을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 본 발명에 따른 고양이 알부민 생산수율을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 개 알부민 및 고양이 알부민 단백질의 도메인 구조를 나타낸다.
도 16은 5'-UTR, 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드를 코딩하는 유전자와 개 알부민의 성숙 펩티드(mature peptide)를 코딩하는 유전자가 결합된 유전자(KC11)의 염기서열을 나타낸다.
도 17은 5'-UTR, 콩 저장단백질 A(VspA)를 코딩하는 유전자와 개 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 결합된 유전자(KC12)의 염기서열을 나타낸다.
도 18은 5'-UTR, 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드를 코딩하는 유전자와 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 결합된 유전자(KF11)의 염기서열을 나타낸다.
도 19는 5'-UTR, 콩 저장단백질 A(VspA)를 코딩하는 유전자와 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 결합된 유전자(KF12)의 염기서열을 나타낸다.
도 20은 융합 유전자 KC11, KC12, KF11 및 KF12를 각각 발현시키기 위한 식물 발현벡터 pKC11, pKC12, pKF11 및 pKF12의 유전자 지도를 나타낸다.
도 21은 pKC11로 형질전환된 벼 현탁세포의 재조합 개 알부민 발현정도를 확인한 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 22는 pKC12로 형질전환된 벼 현탁세포의 재조합 개 알부민 발현정도를 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 23은 pKF11로 형질전환된 벼 현탁세포의 고양이 알부민 발현정도를 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 24는 pKF12로 형질전환된 벼 현탁세포의 고양이 알부민 발현정도를 웨스턴블랏 분석 결과이다.
도 25는 본 발명에 따른 벼 현탁세포 KC11-5, KC11-16, KC11-20 및 KC12-6, KC12-9, KC12-21에서 개 알부민 생산수율을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과(a) 및 벼 현탁세포 KF11-7, KF11-10, KF11-19 및 KF12-8, KF12-15, KF12-24에서 고양이 알부민 생산수율을 ELISA 분석을 통해 확인한 결과(b)를 나타낸다.
본 발명은 동물 의료현장에서의 인간혈청알부민(HSA) 처방에 따른 안전성 문제, 사회적 논란 등의 제반문제를 해결하고자 하는 목적을 달성하기 위하여, 알부민을 고효율로 생산하기 위한 재조합 핵산, 이를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 벼 현탁세포 및 이를 포함하는 저알부민혈증을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 수의학적 조성물에 기초하여 완성되었다.
또한 본 발명에 따른 상기 벼 현탁세포를 배양하여 개 또는 고양이 유래의 재조합 알부민을 고효율로 생산하는 방법은 개 전용 재조합 CSA(rCSA; recombinant Canine Serum Albumin) 또는 고양이 전용 재조합 FSA(rFSA; recombinant Feline Serum Albumin)를 안전하고 효율적으로 대량생산하는 독보적인 기술을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 발명의 일부 구현예를 포함하는 것으로 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 여기에서 설명되는 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명이 속한 기술 분야에 있어 통상의 기술자가 다양하게 구현할 수 있다는 것을 포함하는 것은 자명하다. 따라서 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1. 개 또는 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 세포주의 개발
1. 유전자 클로닝 및 발현벡터의 제작
(1) 개 또는 고양이 알부민 유전자와 이를 포함하는 플라스미드 벡터
알부민 유전자는 개 알부민(Uniprot P49822)과 고양이 알부민(Uniprot P49064)의 유전자 정보를 기반으로 식물벡터로의 도입을 위하여 개 알부민 유전자와 고양이 알부민 유전자의 5'-말단에는 XbaI 사이트를 3'-말단에는 KpnI 사이트를 포함시켰고, 유전자의 합성은 Thermo Fisher Scientific사에 의뢰하여 합성하였다.
이렇게 합성한 개 알부민 유전자 염기서열(서열번호 1)은 도 3에 나타내었고, 상기 개 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKCT-1로 명명하였다. 또한 본 발명에서 합성한 고양이 알부민 유전자 염기서열(서열번호 2)은 도 4에 나타내었고, 상기 고양이 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKFT-1로 명명하였다.
(2) 개 또는 고양이 알부민 유전자의 단자엽 식물로 도입을 위한 식물 발현벡터 제작
상기에서 합성한 개 알부민 또는 고양이 알부민 유전자를 단자엽 식물인 벼에서 고발현을 유도하기 위하여 ㈜엔비엠에서 개발한 단자엽식물 고발현 벡터인 pMYN75에 도입하였다. pMYN75 식물발현벡터는 당이 결핍된 배지조건에서 벼의 현탁세포에서 특이적으로 발현한다.
합성된 개 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드 pKCT-1 및 합성된 고양이 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드 pKFT-1을 KpnI과 XbaI으로 자른 후, pMY75 벡터의 KpnI과 XbaI 위치에 각각 도입하여 개 알부민 유전자 발현벡터 pKCN11 및 고양이 알부민 유전자 발현벡터 pKFN11을 제작하였다. 발현벡터 pKCN11 및 pKFN11의 상세한 유전자지도는 도 5에 나타내었다.
(3) 개 또는 고양이 알부민 유전자의 쌍자엽 식물로 도입을 위한 식물 발현벡터 제작
상기에서 합성한 개 알부민 또는 고양이 알부민 유전자를 쌍자엽 식물인 담배와 감자에서 고발현을 유도하기 위하여 ㈜엔비엠에서 개발하여 사용하고 있는 쌍자엽 식물 고발현 벡터인 pMY27에 도입하였다.
합성된 개 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드 pKCT-1 및 합성된 고양이 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드 pKFT-1을 KpnI과 XbaI으로 자른 후, pMY27 벡터의 KpnI과 XbaI 위치에 각각 도입하여 개 알부민 유전자 발현벡터 pKCN12 및 고양이 알부민 유전자 발현벡터 pKFN12를 제작하였다. 발현벡터 pKCN12 및 pKFN12의 상세한 유전자지도는 도 6에 나타내었다.
2. 형질전환 및 고생산 식물세포주의 선발
개 또는 고양이 유래의 알부민을 고효율로 생산하는 최적의 식물과 발현시스템의 선발을 위하여, 감자, 담배, 벼에서 개 또는 고양이의 알부민 생산기술을 확립하고자 다음의 실험을 수행하였다.
(1) 식물발현벡터의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환
아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 수행하기 앞서, 상기에서 구축한 pKCN11과 pKCN12; 및 pKFN11과 pKFN12;를 각각 tri-parental mating 방법으로 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404에 형질전환하였다.
28℃에서 2일간 암배양한 LBA4404, pKCN11, pKCN12, pKFN11 및 pKFN12 플라스미드를 각각 포함하는 대장균, 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)인 pRK2013을 포함하는 대장균을 37℃에서 16시간 배양한 후, 각각 1㎖ 씩 취하여 원심분리하고, LB 배지로 3회 세척하여 각각에 포함된 항생제를 제거하였다.
항생제가 제거된 pKCN11, pKCN12, pKFN11 및 pKFN12 플라스미드 각각을 포함하는 대장균과 LBA4404 그리고 pRK2013을 포함하는 대장균을 100㎕씩 취하여 새로운 튜브에 넣고, 잘 섞어 LB 배지에 고르게 흡수시킨 후, 28℃에서 2일간 암배양 하였다.
2일 후, LB 배지의 세포를 모아 희석하여 리팜피신과 카나마이신이 포함된 고체배지에 고르게 흡수시킨 후, 28℃에서 3일간 암배양하였다. 3일 후 자라난 각각의 콜로니를 취하여 유전자의 삽입을 확인하였다. 구체적으로, 개 알부민에 특이적인 정방향 프라이머(서열번호 3, F1: 5'-GCA AGT ACC TCT ACG AGA TC-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 4, R1: 5'-TGC GCT CGG TCT CAG GCT TC-3')와 고양이 알부민에 특이적인 정방향 프라이머(서열번호 5, F2: 5'-CAG AGC GCA ACG AGT GCT TC-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 6, R2: 5'-TCT GTA CAG CAC TTC GTC AC-3')를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 유전자의 삽입이 확인된 LBA4404 균으로 벼, 담배 및 감자를 형질전환하였다. 구체적인 실험방법은 이하 자세히 설명한다.
(2) 벼 형질전환
개 알부민 유전자 발현벡터 pKCN11과 고양이 알부민 유전자 발현벡터 pKFN11을 각각 벼로 형질전환하기 위하여 종피를 제거한 벼 종자(품종명: 동진)를 70% 에탄올로 표면소독을 하고, 2% 락스에 20분간 소독하여 캘러스 유도 배지인 N6CI 고체배지(리터 당 30g의 sucrose, 4.4g의 N6 salt, 1g의 casamino acid 및 2 ppm 2,4-D, 0.8 %의 한천)에 약 16개씩 치상하고 3주 후, 지름 3-4mm 정도 크기의 유백색 캘러스만을 분리하여 새로운 N6CI 배지로 옮겨 준 후 3일 후에 형질전환에 사용하였다.
pKCN11과 pKFN11을 각각 포함하고 있는 LBA4404 균을 벼 캘러스에 감염시킨 후 이를 100μM 아세토시린곤(acetosyringone)이 포함된 N6CO 배지(리터 당 30g의 sucrose, 4.4g의 N6 salt, 1g의 casamino acid, 10g glucose 및 2 ppm 2,4-D)에 3일간, 25℃에서 암배양하였다.
이후, 벼 캘러스를 취해 우선 물로 세척하고 500㎍/㎖ 세포탁심(cefotaxime)이 포함된 물로 추가로 세척한 후, 여과지에 캘러스를 올려 여분의 LBA4404를 제거하였다. N6S 배지(N6CI 배지에 50㎍/㎖의 Hygromycin B와 500㎍/㎖의 cefotaxime 추가)에 치상하여 3-4주 정도 배양하였다. 하이그로마이신 항생제 저항성을 보이며 새로 자라난 캘러스만을 분리하여 새로운 배지로 옮겨 캘러스를 증식하였다.
(3) 담배 형질전환
담배의 형질전환은 Horsch 등에 의하여 기 보고된 leaf-disc법으로 수행하였다. 먼저 담배(품종명: BY-2)의 잎을 70% 에탄올로 1분간, 차아염소산나트륨으로 5분간 소독 후 멸균수로 세척하고 1cm 크기로 절단한 후, pKCN12와 pKFN12를 각각 포함하고 있는 LBA4404 균을 접종한 후 MS-NB 배지(Murashige-Skoog, 1㎎/L 6-BAP, 0.1㎎/L NAA)에 치상하여 공배양 하였다.
3일 후, 항생물질 카베니실린을 포함하는 MS-NB 배지에 이식하여 여분의 아그로박테리움 제거와 동시에 캘러스를 유도하였다. 10일 후 카나마이신(100㎎/L)과 카베니실린(500㎎/L)을 포함하는 MS-NB 배지에 치상하여 형질전환체의 선발을 진행하였다. 캘러스로부터 형성된 부정아(adventitious bud)를 상기 항생물질을 포함한 MS 배지에 옮기고, 재분화하여 뿌리를 내린 식물체를 선발하였으며, 이를 25℃, 12시간 광조건 생장챔버에서 육성한 후 순화과정을 거쳐 화분으로 옮겨 재배하였다.
(4) 감자 형질전환
감자의 형질전환은 Stiekema 등에 의하여 기 보고된 tuber-disc법으로 수행하였다. 먼저 감자(품종명: 수미)의 괴경 껍질을 벗기고 차아염소산나트륨 (1% 염소농도)으로 표면살균한 후 멸균수로 4회 세척하였다. 이 괴경을 멸균된 직경 1cm의 코르크볼러로 채취하고 3mm 두께로 절단하여 tuber-disc를 만들었다. 감자 괴경 절편을 pKCN12와 pKFN12가 각각 포함된 LBA4404 균을 현탁한 MS 액체배지에 각각 15분간 침지하여 접종한 뒤, MS 고체배지에 치상하여 21℃, 16시간 광조건에서 3일간 공배양 하였다.
그 후 tuber-disc를, 카나마이신(50㎎/L)과 카베니실린(500㎎/L)을 포함하는 MS 액체배지로 세척하고, 상기 항생물질과 식물생장조절물질(0.1㎎/L IAA, 0.1㎎/L GA3, 0.1㎎/L ABA, 2㎎/L Zeatin riboside)을 포함하는 MS 고체배지에서 21℃, 16시간 광조건에서 배양하여 여분의 아그로박테리움의 제거와 형질전환체 선발을 수행하였다. Tuber-disc는 2주 간격으로 새로운 배지로 옮겨주고, 신초(shoot)가 형성된 개체는, 뿌리형성 촉진을 위해 신초를 절단하여 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 MS 고체배지(카나마이신 50㎎/L 첨가)에 이식하여 형질전환체를 육성한 후 순화과정을 거쳐 화분으로 옮겨 재배하였다.
3. 알부민 고생산 식물세포주의 선발
(1) 알부민 고생산 벼 세포주의 선발
개 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKCN11이 도입된 형질전환 벼 캘러스 또는 고양이 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKFN11이 도입된 형질전환 벼 캘러스의 알부민 생산여부는 개 또는 고양이 알부민에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)으로 확인하였다.
개 또는 고양이 알부민 유전자가 도입되어진 형질전환 벼 캘러스 10g을 10㎖의 추출버퍼(50mM Tris-Cl pH 8.2, 0.5% Triton X-100, 30mM NaCl, 1mM PMSF)와 혼합한 후 막자사발을 이용하여 갈아 단백질을 추출하였다. 웨스턴 블랏 분석은 Thermo Fisher Scientific사의 iBlot™ 2 Gel Transfer Device를 이용하여 제공된 실험방법에 따라서 실시하였다. 개 알부민에 대한 1차 항체는 Bethyl Laboratories사의 개 특이적 항체(Bethyl A40-113A)를 사용하였으며, 고양이 알부민에 대한 1차 항체는 고양이 특이적 항체(Bethyl A20-109A)를 사용하였다.
웨스턴 블랏 분석 결과, 개 알부민 유전자로 형질전환된 벼 캘러스 시료 중 KCN11-R5 및 KCN11-R22 시료에서 개 알부민으로 추정되는 강한 밴드가 확인되어 KCN11-R5 및 KCN11-R22 캘러스를 개 알부민 고생산 벼 elite line으로 선발하였으며(도 7), 고양이 알부민 유전자로 형질전환된 벼 캘러스 시료 중 KFN11-R5, KFN11-R11 및 KFN11-R23 시료에서 고양이 알부민으로 추정되는 강한 밴드를 확인하여 KFN11-R5, KFN11-R11 및 KFN11-R23 캘러스를 고양이 알부민 고생산 벼 elite line으로 선발하였다(도 8).
(2) 알부민 고생산 담배 세포주의 선발
개 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKCN12가 도입된 형질전환 담배 식물체 또는 고양이 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKFN12가 도입된 형질전환 담배 식물체의 알부민 생산여부는 개 알부민에 특이적인 항체(Bethyl A40-113A) 또는 고양이 알부민에 특이적인 항체(Bethyl A20-109A)를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 확인하였으며, 각각의 형질전환 식물체 잎 10g을 시료로 하여 상기 '알부민 고생산 벼 세포주의 선발'과 동일한 방법으로 수행하였다.
웨스턴 블랏 수행 결과, 개 알부민 유전자로 형질전환된 담배 식물체 시료 중 KCN12-T3 및 KCN12-T4의 시료에서 개 알부민으로 추정되는 밴드를 확인하여 KCN12-T3 및 KCN12-T4 식물체를 개 알부민 고생산 담배 elite line으로 선발하였으며(도 9), 고양이 알부민 유전자로 형질전환된 담배 식물체 시료 중 KFN12-T8 및 KFN12-T11에서 고양이 알부민으로 추정되는 강한 밴드를 확인하여 KFN12-T8 및 KFN12-T11 식물체를 고양이 알부민 고생산 담배 elite line으로 선발하였다(도 10).
(3) 알부민 고생산 감자 세포주의 선발
개 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKCN12가 도입된 형질전환 감자 식물체 또는 고양이 알부민 유전자를 포함하는 발현벡터 pKFN12가 도입된 형질전환 감자 식물체의 알부민 생산여부는 개 알부민에 특이적인 항체(Bethyl A40-113A) 또는 고양이 알부민에 특이적인 항체(Bethyl A20-109A)를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 확인하였으며, 각각의 형질전환 식물체 잎 10g을 시료로 하여 상기 '알부민 고생산 벼 세포주의 선발'과 동일한 방법으로 수행하였다.
웨스턴 블랏 수행 결과, 개 알부민 유전자로 형질전환된 감자 식물체 시료 중 KCN12-P1 및 KCN12-P9에서 개 알부민으로 추정되는 밴드를 확인하여 KCN12-P1 및 KCN12-P9 식물체를 개 알부민 고생산 감자 elite line으로 선발하였으며(도 11), 고양이 알부민 유전자로 형질전환된 감자 식물체 시료 중 KFN12-P6 및 KFN12-P14에서 고양이 알부민으로 추정되는 밴드를 확인하여 KFN12-P6 및 KFN12-P14 식물체를 고양이 알부민 고생산 감자 elite line으로 선발하였다(도 12).
실시예 2. 개 또는 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 세포주의 생산수율 확인
실시예 1을 통하여 선발한 개 또는 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 식물세포주의 알부민 생산수율을 ELISA 방법을 이용하여 확인하였으며, 이하 이를 구체적으로 설명한다.
1. 개와 고양이 알부민 고생산 식물캘러스 및 식물체로부터 현탁세포유도
(1) 개와 고양이 알부민 고생산 형질전환 벼 캘러스로부터 현탁세포 유도
실시예 1에서 선발한 개 알부민을 고효율로 생산하는 벼 캘러스로 선별된 KCN11-R5 및 KCN11-R22 세포주(도 7)와 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 벼 캘러스로 선별된 KFN11-R5, KFN11-R11 및 KFN11-R23 세포주(도 8)를 N6CI 액체배지(리터 당 30g의 sucrose, 4.4g의 N6 salt, 1g의 casamino acid 및 2 ppm 2,4-D)에 접종한 후 25℃, 암배양 조건에서 3주 간격으로 계대배양하면서 현탁세포를 유도하였으며 7일마다 신선한 배지로 배양물 1/5을 옮겨 계대배양을 하였다.
(2) 개와 고양이 알부민 고생산 형질전환 담배 식물체의 현탁세포 유도
실시예 1에서 선발한 개 알부민을 고효율로 생산하는 담배 형질전환식물체로 선별된 KCN12-T3 및 KCN12-T4(도 9)와 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 담배 형질전환식물체로 선별된 KFN12-T8 및 KFN12-T11(도 10)의 잎을 70% 에탄올로 1분간, 차아염소산나트륨으로 5분간 소독 후 멸균수로 세척하고 1cm 크기로 절단하여 MS 고체배지(2㎎/L의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.02㎎/L의 kinetin, 3%의 자당 및 0.8%의 한천)에 치상하여 25℃, 3,000 lux의 조건에서 3주간격으로 계대배양하면서 캘러스를 유도하였다. 6-8주 후에 유도된 캘러스를 한천을 제거한 50㎖ MS 액체배지에 접종 후에 25℃, 110 rpm의 회전배양기에서 배양하였다. 현탁세포는 7일마다 신선한 배지로 배양물 1/5을 옮겨 계대배양을 하였다.
(3) 개와 고양이 알부민 고생산 형질전환 감자 식물체의 현탁세포 유도
실시예 1에서 선발한 개 알부민을 고효율로 생산하는 감자 형질전환식물체로 선별된 KCN12-P1 및 KCN12-P9(도 11)와 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 감자 형질전환식물체로 선별된 KFN12-P6 및 KFN12-P14(도 12)의 잎을 70% 에탄올로 1분간, 차아염소산나트륨으로 5분간 소독 후 멸균수로 세척하고 1cm 크기로 절단하여 MS 배지(3㎎/L NAA, 2㎎/L IBA, 3%의 자당, 0.8%의 한천)에 치상하여 25℃, 암배양 조건에서 3주 간격으로 계대배양하면서 캘러스를 유도하였다. 6-8주 후에 유도된 캘러스를 한천을 제거한 50㎖ MS 액체배지에 접종한 후 25℃, 110 rpm의 회전배양기에서 암배양하였다. 현탁세포는 7일마다 신선한 배지로 배양물 1/5을 옮겨 계대배양을 하였다.
2. ELISA를 이용한 알부민 생산수율 확인
(1) ELISA 수행을 위한 시료 제작
액체배양을 통하여 유지하고 있는 개 알부민 고생산 벼 현탁세포 KCN11-R5 및 KCN11-R22; 담배 현탁세포 KCN12-T3 및 KCN12-T4; 감자 현탁세포 KCN12-P1 및 KCN12-P9;와 고양이 알부민 고생산 벼 현탁세포 KFN11-R5, KFN11-R11 및 KFN11-R23; 담배 현탁세포 KFN12-T8 및 KFN12-T11;와 감자 현탁세포 KFN12-P6 및 KFN12-P14; 각각을 멸균한 진공여과 깔대기의 종이필터위에 적당량을 올려놓고 진공을 걸어 액체배지를 제거하고 액체배지가 제거된 각각의 현탁세포 10g을 취하여 담배와 감자 현탁세포는 현탁세포 배양에 사용한 동일한 액체배지 50㎖에 치상하여 배양하였다. 벼 현탁세포는 현탁세포 배양에 사용한 동일한 액체배지 성분 중 자당을 제거한 액체배지 50㎖에 치상하여 배양을 실시하였으며 각각의 현탁세포는 3반복으로 배양 후 5일째의 액체배지를 취하여 알부민의 양을 정량하였다.
ELISA 분석을 위하여 각 현탁세포 배양액 1㎖을 4℃, 200xg, 10분의 조건으로 원심분리하여 배양상등액과 세포펠렛으로 분리하였고, 4℃에서 하룻밤동안 PBS상에서 투석하였으며 투석한 배양상등액을 시료로 사용하였다. 개 알부민 생산량 확인은 개 알부민 ELISA kit (ab277078, Abcam, UK)를 사용하였고, 고양이 알부민 생산량 확인은 고양이 알부민 ELISA Kit (DEIABL383, Creative Diagnostics, USA)를 이용하여 정량분석을 수행하였으며 분석방법은 각각의 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 3반복으로 수행하였다.
개 알부민 고생산 벼 현탁세포(KCN11-R5, KCN11-R22), 담배 현탁세포(KCN12-T3, KCN12-T4), 감자 현탁세포(KCN12-P1, KCN12-P9)에 대한 ELISA 결과는 도 13에 나타내었다. 개 알부민 고생산 담배 현탁세포의 알부민 생산수율은 최대 약 3㎎/L, 감자 현탁세포의 알부민 생산수율은 최대 약 5㎎/L 이었으나, 벼 현탁세포의 개 알부민 생산수율은 최대 약 34㎎/L로 담배 현탁세포의 약 10배, 감자 현탁세포의 약 7배 이상 높은 생산수율을 확인하였다.
고양이 알부민 고생산 벼 현탁세포(KFN11-R5, KFN11-R11, KFN11-R23), 담배 현탁세포(KFN12-T8, KFN12-T11), 감자 현탁세포(KFN12-P6, KFN12-P14)에 대한 ELISA 결과는 도 14에 나타내었다. 고양이 알부민 고생산 담배 현탁세포의 고양이 알부민 생산수율은 최대 약 9㎎/L, 감자 현탁세포의 고양이 알부민 생산수율은 최대 약 9㎎/L 이었으나, 벼 현탁세포의 고양이 알부민 생산수율은 최대 약 58㎎/L로 담배와 감자 현탁세포 대비 약 6.5배 이상 높은 생산수율을 확인하였다.
상기 실시예 2.2를 통하여 식물에서 개 또는 고양이 재조합 알부민을 생산하기 위해서는 개 또는 고양이 알부민 유전자를 포함하고 있는 식물발현벡터를 벼 캘러스에 도입하여 생산하는 조합이 가장 바람직한 것으로 확인되었다.
3. 벼 유래 개와 고양이 알부민의 N-말단 아미노산 서열 확인
상기 벼의 현탁세포에서 생산된 개 알부민 또는 고양이 알부민의 N-말단 아미노산서열을 확인하였다.
개 알부민을 생산하는 벼 현탁세포 KCN11-R5 배양액 100㎖과 고양이 알부민을 생산하는 벼 현탁세포 KFN11-R11 배양액 100㎖을 취하여 0.45㎛ 공극(pore) 크기의 필터를 이용해 여과한 후 30 kDa 중공섬유(hollow fiber) 필터를 사용하여 cut-off하고 농축액을 HiScreen Blue Sepharose FF (Cytiva, 28978243) 컬럼을 사용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 알부민을 분리정제하였다. 정제한 개 및 고양이 알부민은 ㈜라이프사이언스래보러토리(한국)에 의뢰하여 애드만 분해법(Edman degradation)을 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다.
본 발명의 실시예 1에서 사용한 개 알부민(Uniprot P49822)과 고양이 알부민(Uniprot P49064)의 정보에 의하면 개와 고양이 알부민은 모두 신호 펩티드(signal peptide, 1~18), 프로펩티드(propeptide, 19~24), 성숙펩티드(mature peptide, 25~608)로 구성되어 있음을 알 수 있다.
아미노산 서열 분석 결과, 벼 현탁세포에서 생산된 개 알부민의 N-말단 아미노산 서열은 R-G-L-V-R과 L-V-R-R-E의 2종류가 확인되었으며, R-G-L-V-R는 도 15의 모식도에 나타난 바와 같이 프로펩티드를 모두 포함하고 있고 L-V-R-R-E는 프로펩티드의 21번에서 24번째 아미노산을 포함하고 있음이 확인되었다(도 15). 또한 벼 현탁세포에서 생산된 고양이 알부민의 N-말단 아미노산 서열을 확인한 결과, R-G-V-T-R과 V-T-R-R-E의 2종류가 확인되었으며, R-G-V-T-R는 도 15에 나타낸 바와 같이 프로펩티드를 모두 포함하고 있고 V-T-R-R-E는 프로펩티드의 21번에서 24번째 아미노산을 포함하고 있음이 확인되었다.
상기 결과는 본 발명의 벼 현탁세포에서 생산된 개 알부민 또는 고양이 알부민 단백질의 경우에, 프로펩티드 서열이 완전히 제거되지 못한 미성숙한 단백질로 발현되는 것을 의미한다. 이에 본 발명에서는 개 또는 고양이 혈액에 존재하는 자연상태의 성숙 단백질과 동일한 단백질을 발현하도록 추가의 실험을 진행하였다.
실시예 3. 벼 현탁세포에서 자연상태의 성숙단백질과 동일한 재조합 개 또는 고양이 알부민을 생산하는 방법
실시예 2을 통하여 확인한 결과, 벼 현탁세포에서 생산된 개 알부민과 고양이 알부민 단백질의 N-말단이 개와 고양이 유래의 자연형 성숙단백질과 상이하여, N-말단 서열이 자연형과 동일한 재조합 알부민을 대량생산하는 기술을 확립하고자 하였다.
신호 펩티드(SP; Signal Peptide)는 단백질분자에 존재하는 3-60개 아미노산으로 이루어진 펩티드 서열로서, 세포질 내에서 생합성된 단백질의 수송(transport)과 국지화(localization)를 지시한다. 핵, 골지체, 미토콘드리아, 엽록체 등 세포 소기관으로의 수송 및 국지화를 지시하는 특정서열이 알려져 있다. 그 중 세포외로 분비(소포체로의 수송)되는 소포체 SP는 단백질 분자의 N-말단에 존재하는 5-10개의 소수성(hydrophobic) 아미노산을 포함하는 배열이다. 이들 소포체 SP은 다양한 외래 단백질의 효율적인 생산(분비)시스템에 활용되고 있는데, 목적 단백질의 생산효율을 높이는데 있어서 최적 SP의 선택과 그에 따른 정확도(정확한 절단)가 매우 중요한 요소로 작용한다.
발현벡터에 도입한 SP는 종류에 따라 목적 단백질의 생산효율에 큰 차이를 보이며, 생물 종 간 보존된 서열이 존재하지 않으므로 다양한 SP의 조합을 통해 최고의 생산효율을 나타내는 최적의 SP 서열을 탐색할 필요가 있다.
1. 최적의 신호 펩티드 선발
(1) 개와 고양이 재조합 알부민 생산에 최적의 신호 펩티드의 선발
포유류의 알부민은 3차구조를 형성하는 과정에서 엔도펩티데이즈인 퓨린 (furine)에 의하여 프로펩티드가 절단되어 성숙된 알부민 단백질을 형성하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 실시예 2에서 확인한 바와 같이 개 또는 고양이의 재조합 알부민을 벼 현탁세포에서 생산할 경우, 벼에는 포유류에 존재하는 엔도펩티데이즈인 퓨린이 존재하지 않아 프로펩티드의 절단이 이루어지지 않고, 그 결과 생산된 알부민의 N-말단 서열이 개 또는 고양이의 자연형 성숙단백질과 상이하였다.
이에, 본 발명에 따른 벼 현탁세포에서 개 또는 고양이의 자연형 성숙단백질을 발현하도록 하는 최적의 신호 펩티드서열을 탐색하였다. 식물에서 재조합단백질 생산에 사용되어진 선행기술을 조사하고 단백질 신호 펩티드서열 관련 데이터베이스 (http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb)를 활용하여 최종적으로 13개의 신호 펩티드 서열을 도출하였다. 도출된 13 종류의 신호 펩티드 서열을 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드에 결합시킨 후, 이를 SignalP-5.0 서버 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 활용하여 신호 펩티드 서열이 정확하게 절단되는 능력을 확인하였다.
SignalP-5.0 프로그램을 이용하여 신호 펩티드 서열의 절단 가능성을 확인한 결과를 표 1과 표 2에 각각 제시하였다. 13 종류의 신호 펩티드 아미노산 서열과 개와 고양이의 성숙 펩티드 서열을 연결한 후, 신호 펩티드 절단 가능성을 확인한 결과, 특히 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드 서열(MGKQMAALCGFLLVALLWLTPDVAHA, 서열번호 11) 또는 콩 저장단백질 A(VspA) 신호 펩티드 서열(MKMVVLVFFVATILVAWQCHA, 서열번호 12)과 결합할 경우 개와 고양이 알부민 모두에서 신호 펩티드에서 절단될 가능성이 가장 높은 것으로 확인되었다.
신호 펩티드서열에 따른 개 알부민의 절단부위 확인
Signal
peptide		 Source Signal peptide sequence
(서열번호)		 Cleavage site
(probability score)
RAmy3A α-amylase 3A
(Oryza sativa)		 MGKQMAALCGFLLVALLWLTPDVAHA (11) AHA ∨ EAYK (0.8929)
CRT calreticulin
(Nicotiana tabacum)		 MATQRRANPSSLHLITVFSLLVAVVSA (13) VSA ∨ EAYK (0.3162)
PGLA polygalacturonase
(Malus domestica)		 MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG (14) CSG ∨ EAYK (0.3593)
BAmyA α-amylase type A
(Hordeum vulgare)		 MGKNGSLCCFSLLLLLLLAGLASG (15) ASG ∨ EAYK (0.6323)
BAmyB α-amylase type B
(Hordeum vulgare)		 MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (16) ASG ∨ EAYK (0.5221)
RAamy3D α-amylase 3D
(Oryza sativa)		 MKNTSSLCLLLLVVLCSLTCNSGQA (17) GQA ∨ EAYK (0.2921)
Gt13a glutenin
(Oryza sativa)		 MASINRPIVFFTVCLFLLCNGSLA (18) SLA ∨ EAYK (0.4125)
EXT extensin domain
(N. benthamiana)		 MGKMASLFATLLVVLVSLSLASESSA (19) SSA ∨ EAYK (0.3121)
Pr1 pathogenesis related protein 1
(N. benthamiana)		 MLPFSLLVSTLLLFLVISHSCRA (20) CRA ∨ EAYK (0.6785)
VspA storage protein
(Glycine max)		 MKMVVLVFFVATILVAWQCHA (12) CHA ∨ EAYK (0.7217)
PDI protein disulphide isomerase
(Medicago truncatula)		 MAKNVSIFGLLFSLLALVPSQIFA (21) IFA ∨ EAYK (0.5940)
OsCIN1 hypothetical protein
(Oryza sativa)		 MGTRLLALAPWLLLLLLQLAGA (22) AGA ∨ EAYK (0.3514)
Os33KD hypothetical protein
(Oryza sativa)		 MAALSQLVLVTAFLAAALLPLGMAA (23) MAA ∨ EAYK (0.0000)
주) 아미노산 서열 EAYK는 개 알부민의 성숙 펩티드 서열임
신호 펩티드서열에 따른 고양이 알부민의 절단부위 확인
Signal
peptide		 Source Amino acid sequence Cleavage site
(Probability score)
RAmy3A α-amylase 3A
(Oryza sativa)		 MGKQMAALCGFLLVALLWLTPDVAHA AHA ∨ EAHQ (0.9027)
CRT calreticulin
(Nicotiana tabacum)		 MATQRRANPSSLHLITVFSLLVAVVSA VSA ∨ EAHQ (0.3261)
PGLA polygalacturonase
(Malus domestica)		 MALKTQLLWSFVVVFVVSFSTTSCSG CSG ∨ EAHQ (0.3690)
BAmyA α-amylase type A
(Hordeum vulgare)		 MGKNGSLCCFSLLLLLLLAGLASG ASG ∨ EAHQ (0.6146)
BAmyB α-amylase type B
(Hordeum vulgare)		 MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG ASG ∨ EAHQ (0.5104)
RAamy3D α-amylase 3D
(Oryza sativa)		 MKNTSSLCLLLLVVLCSLTCNSGQA GQA ∨ EAHQ (0.2974)
Gt13a glutenin
(Oryza sativa)		 MASINRPIVFFTVCLFLLCNGSLA SLA ∨ EAHQ (0.4920)
EXT extensin domain
(N. benthamiana)		 MGKMASLFATLLVVLVSLSLASESSA SSA ∨ EAHQ (0.4054)
Pr1 pathogenesis related protein 1
(N. benthamiana)		 MLPFSLLVSTLLLFLVISHSCRA CRA ∨ EAHQ (0.6934)
VspA storage protein
(Glycine max)		 MKMVVLVFFVATILVAWQCHA CHA ∨ EAHQ (0.7356)
PDI protein disulphide isomerase
(Medicago truncatula)		 MAKNVSIFGLLFSLLALVPSQIFA IFA ∨ EAHQ (0.6168)
OsCIN1 hypothetical protein
(Oryza sativa)		 MGTRLLALAPWLLLLLLQLAGA AGA ∨ EAHQ (0.3321)
Os33KD hypothetical protein
(Oryza sativa)		 MAALSQLVLVTAFLAAALLPLGMAA MAA ∨ EAHQ (0.0000)
주) 아미노산 서열 EAHQ는 고양이 알부민의 성숙 펩티드 서열임
2. 유전자 합성 및 발현벡터의 제작
(1) 유전자 합성 및 발현벡터의 제작
본 발명의 상기 실시예 2에서 확인한 바와 같이, 벼 현탁세포에서 알부민을 생산하는 경우, 개 또는 고양이 혈액에 존재하는 알부민과 동일한 N-말단으로 절단되지 않고 개 또는 고양이 알부민의 프로펩티드 일부(4~6개 아미노산)가 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드 N-말단에 존재함을 확인하였다.
이 결과를 기반으로, 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드 N-말단에 본 실시예 3에서 선발된 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드 또는 콩 저장단백질 A(VspA) 신호 펩티드를 직접 연결하여 단백질 발현 후, 개와 고양이 혈액에 존재하는 알부민과 동일한 N-말단으로 절단되도록 하였다.
개 알부민 유전자와 고양이 알부민 유전자는 Thermo Fisher Scientific사의 웹에서 제공하는 GeneArt™ GeneOptimizer™ 프로그램을 이용하여 벼의 코돈으로 최적화한 후에 Thermo Fisher Scientific사에 의뢰하여 합성하였다. 5'-UTR, 벼 아밀레이즈 3A (RAmy3A) 신호 펩티드와 개 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 융합된 유전자(KC11) 염기서열(서열번호 7)은 도 16에 나타내었고, 이렇게 합성된 재조합 개 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKCT-3으로 명명하였다. 5'-UTR, 콩 저장단백질 A (VspA) 신호 펩티드와 개 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자(서열번호 8)가 융합된 유전자(KC12) 염기서열은 도 17에 나타내었고, 이렇게 합성된 상기 합성된 재조합 개 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKCT-4으로 명명하였다.
마찬가지로, 5'-UTR, RAmy3A 신호 펩티드와 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 융합된 유전자(KF11) 염기서열(서열번호 9)은 도 18에 나타내었고, 이렇게 합성된 재조합 고양이 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKFT-3으로 명명하였으며, 5'-UTR, VspA 신호 펩티드와 고양이 알부민의 성숙 펩티드를 코딩하는 유전자가 융합된 유전자(KF12) 염기서열(서열번호 10)은 도 19에 나타내었고, 이렇게 합성된 고양이 알부민 유전자를 포함하는 플라스미드는 pKFT-4로 명명하였다.
상기에서 합성한 재조합 개 알부민과 재조합 고양이 알부민 유전자를 각각 단자엽 식물인 벼에서 고발현을 유도하기 위하여, 본 발명의 실시예 1에서 사용한 단자엽식물 고발현 벡터인 pMYN75에 도입하였다. 식물 코돈으로 최적화한 재조합 개 알부민 유전자를 포함하고 있는 pKCT-3 및 pKCT-4를 각각 KpnI과 XbaI으로 자른 후, pMYN75 벡터의 KpnI과 XbaI 위치에 도입하여 재조합 개 알부민 유전자 발현벡터 pKC11 및 pKC12를 각각 제작하였다. 이의 상세한 유전자지도는 도 20에 나타내었다.
또한 식물 코돈으로 최적화한 재조합 고양이 알부민 유전자를 포함하고 있는 pKFT-3 및 pKFT-4를 각각 KpnI과 XbaI으로 자른 후 pMYN75 벡터의 KpnI과 XbaI 위치에 도입하여 고양이 알부민 유전자 발현벡터 pKF11 및 pKF12를 각각 제작하였다. 이의 상세한 유전자지도는 도 20에 나타내었다.
3. 벼 형질전환 및 고생산 세포주의 선발
(1) 벼 형질전환 및 고생산 세포주의 선발
상기 pKC11, pKC12, pKF11 및 pKF12 벡터는 각각 실시예 1에 기술한 방법으로 아그로박테리움균과 벼에 도입하고, 형질전환 된 벼 캘러스에서 알부민의 생산성 확인을 실시예 1에 기술한 웨스턴 블랏 분석법으로 수행하였다.
RAmy3A 신호 펩티드와 개 알부민의 성숙 펩티드가 융합된 유전자를 포함하는 pKC11을 형질전환시켜 선발한 23 계통의 캘러스를 분석한 결과, KC11-5, KC11-16 및 KC11-20 세포주에서 강한 밴드를 확인하여 재조합 개 알부민 고생산 세포주로 선발하였다(도 21). 또한, VspA 신호 펩티드와 개 알부민의 성숙 펩티드가 융합된 유전자를 포함하는 pKC12을 형질전환시켜 선발한 23 계통의 캘러스를 분석한 결과, KC12-6, KC12-9 및 KC12-21 세포주에서 강한 밴드를 확인하여 재조합 개 알부민 고생산 세포주로 선발하였다(도 22).
또한, RAmy3A 신호 펩티드와 고양이 알부민의 성숙 펩티드가 융합된 유전자를 포함하는 pKF11을 형질전환시켜 선발한 25 계통의 캘러스를 분석한 결과, KF11-7, KF11-10 및 KF11-19 세포주에서 강한 밴드를 확인하여 재조합 고양이 알부민 고생산 세포주로 선발하였다(도 23). VspA 신호 펩티드와 고양이 알부민의 성숙 펩티드가 융합된 유전자를 포함하는 pKF12를 형질전환시켜 선발한 24 계통의 캘러스를 분석한 결과 KF12-8, KF12-15 및 KF12-24 세포주에서 강한 밴드를 확인하여 재조합 고양이 알부민 고생산 세포주로 선발하였다(도 24).
4. 알부민 생산수율 확인
(1) ELISA를 이용한 재조합 개 알부민 생산수율 확인
본 발명에 따른 상기 실시예 2에 기술한 동일한 ELISA 방법으로 상기에서 선발한 재조합 개 알부민 고생산 벼 현탁세포 KC11-5, KC11-16, KC11-20, KC12-6, KC12-9 및 KC12-21의 재조합 개 알부민 생산수율을 확인하였으며, 이의 결과는 도 25(a)에 나타내었다.
pKC11이 도입된 형질전환 현탁세포주의 재조합 개 알부민의 생산수율을 확인한 결과, KC11-5 현탁세포주는 약 250㎎/L, KC11-16 현탁세포주는 약 290㎎/L, KC11-20 현탁세포주는 약 270㎎/L의 생산수율을 나타내었다. 또한, pKC12가 도입된 형질전환 캘러스의 재조합 개 알부민의 생산수율을 확인한 결과, KC12-6 현탁세포주는 약 180㎎/L, KC12-9 현탁세포주는 약 170㎎/L, KC12-21 현탁세포주는 약 220㎎/L의 생산수율을 나타내었다. 신호 펩티드에 따른 재조합 개 알부민 생산수율은 벼 아밀레이즈 3A (RAmy3A) 신호 펩티드를 사용한 경우에 평균 약 50㎎/L 더 높은 생산수율을 보였다.
이는 본 발명의 실시예 2에서 확인한 개 알부민의 신호 펩티드 서열을 사용하였을 때 재조합 개 알부민 고생산 KCN11-R5 현탁세포주에서 확인한 생산수율 약 34㎎/L과 비교하면, RAmy3A 신호 펩티드를 사용할 경우 약 8~10배, VspA 신호 펩티드를 사용하였을 경우 약 5~6.5배 생산성이 향상된 결과이다.
본 발명자는 실시예 3에서 완성한 재조합 개 알부민 고생산 KC11-16 벼 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 특허기탁(기탁번호 KCTC 14618BP) 하였다. 또한 본 실시예 3을 통하여 식물에서 재조합 개 알부민을 대량생산하기 위해서는 개 신호 펩티드를 사용하는 것보다 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 신호 펩티드 또는 콩 저장단백질 A (VspA) 신호 펩티드를 사용하는 것이 효과적이었으며, 바람직하게는 RAmy3A 신호 펩티드를 사용하는 것이 더욱 효과적이었음을 확인하였다.
(2) ELISA를 이용한 재조합 고양이 알부민 생산수율 확인
본 발명에 따른 실시예 2에 기술한 동일한 ELISA 방법으로 상기에서 선발한 재조합 고양이 알부민 고생산 벼 현탁세포 KF11-7, KF11-10, KF11-19, KF12-8, KF12-15 및 KF12-24의 재조합 고양이 알부민 생산수율을 확인하였으며 이의 결과는 도 25(b)에 나타내었다.
pKF11이 도입된 형질전환 현탁세포주의 재조합 고양이 알부민의 생산수율을 확인한 결과 KF11-7 현탁세포주는 약 310㎎/L, KF11-10 현탁세포주는 약 280㎎/L, KF11-19 현탁세포주는 약 290㎎/L의 생산수율을 나타내어, 평균 약 290㎎/L의 생산수율을 나타내었다. pKF12가 도입된 형질전환 캘러스의 재조합 고양이 알부민의 생산수율을 확인한 결과 KF12-8 현탁세포주는 약 240㎎/L, KF12-15 현탁세포주는 약 260㎎/L, KF12-24 현탁세포주는 약 230㎎/L의 생산수율을 나타내어 평균 약 243㎎/L의 생산수율을 나타내었다. 신호 펩티드에 따른 재조합 고양이 알부민 생산수율은 벼 아밀레이즈 3A (RAmy3A) 신호 펩티드를 사용한 경우에 평균 약 47㎎/L 더 높은 생산수율을 보였다.
이는 본 발명에 따른 상기 실시예 2에서 확인한 고양이 알부민의 신호 펩티드 서열을 사용하였을 때 재조합 고양이 알부민 고생산 KFN11-R11 현탁세포주에서 확인한 생산수율 약 58㎎/L과 비교하면, RAmy3A 신호 펩티드를 사용할 경우 약 5배, VspA 신호 펩티드를 사용하였을 경우 약 4배 생산성이 향상된 결과이다.
본 발명자는 실시예 3에서 완성한 재조합 고양이 알부민 고생산 KF11-7 벼 세포주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 특허기탁(기탁번호 KCTC 14617BP) 하였다. 또한, 본 실시예 3을 통하여 식물에서 재조합 고양이 알부민을 대량생산하기 위해서 고양이 신호 펩티드를 사용하는 것보다 RAmy3A 신호 펩티드 또는 VspA 신호 펩티드를 사용하는 것이 효과적이었으며, 바람직하게는 RAmy3A 신호 펩티드를 사용하는 것이 더욱 효과적이었음을 확인하였다.
5. 재조합 알부민의 N-말단 아미노산 서열 확인
pKC11이 도입된 재조합 개 알부민의 고생산 KC11-16과 pKC12가 도입된 재조합 개 알부민의 고생산 KC12-21 세포주에서 생산된 재조합 개 알부민의 N-말단 아미노산 서열을 실시예 2에 기술한 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과, KC11-16과 KC12-21 세포주에서 생산된 재조합 개 알부민 모두 E-A-Y-K-S로 확인되었으며, 이는 개 혈액에 존재하는 자연상태의 성숙한 개 알부민 단백질과 N-말단 서열이 동일함을 확인하였다.
또한, pKF11이 도입된 재조합 고양이 알부민의 고생산 KF11-07과 pKF12가 도입된 재조합 고양이 알부민의 KF12-15를 실시예 2에 기술한 동일한 방법으로 확인하였다. 그 결과, KF11-07과 KF12-15 세포주에서 생산된 재조합 고양이 알부민 모두 E-A-H-Q-S로 확인되었다. 이로써, 고양이 혈액에 존재하는 자연상태의 성숙한 고양이 알부민과 N-말단 서열이 동일함을 확인하였다.
실시예 4. 재조합 개 또는 고양이 알부민의 효능 평가
상기 실시예 3을 통해 생산된 재조합 개 또는 고양이 알부민의 효능을 동물실험을 통해 평가하였다. 동물실험은 ㈜휴벳에 의뢰하여 실시하였다.
현재 동물병원에서 저알부민 혈증에 대한 환축의 치료는 사람을 대상으로 만들어진 알부민제를 사용하고 있고, 안면부 부종 등의 부작용이 보고되는 실정이다. 본 발명에 사용되는 재조합 개 알부민은 식물 유래 알부민으로 실제 동물병원에서 환축에 적용하기 위해 제작되었고, 본 시험에서 실제 동물병원 환축인 개 및 고양이를 이용하였다.
(1) 저알부민혈증 모델에서 재조합 개 알부민의 효능
체중이 10~10.6㎏인 10개월령의 수컷 비글(Beagle dog)을 오리엔트바이오에서 구입하였으며, 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시한 후 7일간 순화, 사육하였다. 사육실의 온도는 24±2℃, 습도는 40~60%, 명암주기는 12시간으로 일정하게 유지하으며, 사료는 시중에 판매되는 개 전용 사료와 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험은 ㈜휴벳 기업부설연구소의 실험동물연구윤리위원회(IACUC)의 승인을 받아 실시하였으며(승인번호 HV 2022-002), 시험군은 전혈의 8% 방혈 후 생리식염수(0.9% normal saline)를 투여한 대조군(n=3)과 전혈의 8% 방혈 후 재조합 개 알부민을 투여한 알부민투여군(n=3)으로 구성하였다.
순화를 거친 실험동물을 케타민(Ketamine hydrochloride, 50㎎/㎖, 유한양행)과 럼푼 주사액(Xylazine hydrochloride, 23.32㎎/㎖, 바이엘코리아)을 각각 0.1㎖/㎏, 0.1㎖/㎏로 혼합주사하여 마취한 후, 요측피정맥(cephalic vein)에 카테터를 확보한 후 10 cc 주사기를 이용해 천천히 방혈을 유도한다. 전혈의 8%인 70㎖을 방혈하였다. 방혈 후 알부민 함량의 감소가 확인된 개체를 대상으로 생리식염수 50㎖과 재조합 개 알부민(2g/10㎖/vial)을 실험동물의 체중에 맞게 2g/5㎏로 혼합해 인퓨전 펌프(infusion pump)를 이용해 70㎖/h의 속도로 정맥(intravenous) 주입한다. 방혈 전, 방혈 후, 재조합 개 알부민 투여 1일, 3일, 7일 후 채혈하여 혈구검사(BC-2800Vet, Mindray) 및 혈청생화학검사(PT10V, Samsung) 수치변화를 분석하였다.
주요혈액수치 변화
시험군 측정항목 방혈 전
(Baseline)		 방혈 후 1 d 3 d 7 d
재조합 개
알부민		 Hematocrit (%) 40.9±2.3 33.3±2.8 38.2±3.3 40.0±4.2 41.6±3.5
Globulin (g/dl) 3.5±0.2 3.3±0.1 3.5±0.2 3.4±0.3 3.6±0.3
Albumin (g/dl) 2.7±0.3 2.3±0.2 2.6±0.1 2.8±0.2 3.0±0.1
ALB/GLOB 0.77 0.71 0.76 0.83 0.86
Total Protein (g/dl) 7.1±0.1 6.5±0.2 7.1±0.4 7.4±0.4 7.5±0.3
대조군 Hematocrit (%) 53.1±4.2 54.6±2.8 49.9±3.5 49.9±3.6 50.4±2.7
Globulin (g/dl) 2.7±0.2 2.9±0.3 3.0±0.1 3.0±0.1 2.9±0.2
Albumin (g/dl) 3.2±0.3 2.9±0.2 3.0±0.3 3.0±0.3 3.0±0.2
ALB/GLOB 1.18 1.00 1.00 1.00 0.93
Total Protein (g/dl) 5.9±0.2 5.6±0.3 6.3±0.3 6.0±0.2 5.9±0.4
※정상범위
Hematocrit (%) : 39~56, Globulin (g/dl) : 2.3~4.6,
Albumin (g/dl) : 2.2~3.9, Total Protein (g/dl) : 5.3~8.4
상기 표 3은 실험동물의 방혈 전(baseline), 방혈 후, 알부민 주입 1일 후, 3일 후 및 7일 후의 혈액수치 변화를 분석한 결과이고, 하기 표 4 및 5는 방혈 전 수치를 기준으로 하여 백분율(%)로 환산한 것이다.
대조군(saline)의 혈액수치 변화 (방혈 전 수치 기준, %)
구분
(%)		 대조군
방혈 전
(Baseline)		 투여 전
(방혈 후)		 투여 후
(1day)		 투여 후
(3day)		 투여 후
(7day)
Hematocrit 100 85.8
(▼ 14.2)		 94.0
(▲ 8.2) 		94.0
(=)		 94.9
(▲ 0.9)
Globulin 100 107.1
(▲ 7.1)		 111.1
(▲ 4.0) 		111.1
(=)		 107.4
(▼ 3.7)
Albumin 100 90.6
(▼ 9.4)		 93.8
(▲ 3.2) 		93.8
(=)		 93.8
(=)
Total Protein 100 94.9
(▼ 5.1)		 106.7
(▲ 11.8) 		101.7
(▼ 5.0)		 100.0
(▼ 1.7)
▲,▼: 각 행에서 직전 열의 백분율 값 기준 해당 열의 백분율 값 증감 표시
알부민 투여군의 혈액수치 변화 (방혈 전 수치 기준, %)
구분
(%)		 재조합 개 알부민 투여군
방혈 전
(Baseline)		 투여 전
(방혈 후)		 투여 후
(1day)		 투여 후
(3day)		 투여 후
(7day)
Hematocrit 100 81.4
(▼ 18.6)		 93.6
(▲ 12.2) 		98.0
(▲ 4.4)		 101.7
(▲ 3.7)
Globulin 100 94.2
(▼ 5.8)		 100.0
(▲ 5.8) 		98.1
(▼ 1.9)		 102.8
(▲ 4.7)
Albumin 100 86.4
(▼ 13.6)		 98.8
(▲ 12.4) 		103.7
(▲ 4.9)		 113.6
(▲ 2.4)
Total Protein 100 91.5
(▼ 8.5)		 100.5
(▲ 9) 		104.3
(▲ 3.7)		 105.7
(▲ 2.0)
▲,▼: 각 행에서 직전 열의 백분율 값 기준 해당 열의 백분율 값 증감 표시
대조군과 재조합 개 알부민 투여군간 큰 차이가 관찰되는 시점은 시험물질 주입 후 1일 시점으로 확인되었고, 이때 혈액 내 알부민 증가 비율은 알부민 투여군에서 대조군 대비 약 9.2% 높게 관찰되었으며, 적어도 7일까지 혈액 내에서 유지됨을 확인할 수 있다. 또한, 위의 수치 이외에 혈구 검사 상 시험재료 주입 이후 염증 수치 증가와 같은 이상 수치 변화는 관찰되지 않았고 혈청생화학검사 상 간과 신장 수치 정상으로 확인하였다. 또한 복부천자하여 요 채취 후 요 검사 시 이상 수치 관찰되지 않았고, 안면부 부종 등 알부민 주입으로 인한 부작용은 관찰되지 않았다. 상기의 결과를 통해 재조합 개 알부민 투여가 부작용 없이 알부민 수치 상승에 도움을 준 것으로 사료된다.
(2) 저알부민혈증 모델에서 재조합 고양이 알부민의 효능
체중이 4.5~5㎏인 10개월령의 수컷 고양이를 오리엔트바이오에서 구입하였으며, 모든 동물의 일반 건강상태에 대한 수의학적 검역을 실시한 후 7일간 순화, 사육하였다. 사육실의 온도는 24±2℃, 습도는 40~60%, 명암주기는 12시간으로 일정하게 유지하였으며, 사료는 시중에 판매되는 고양이용 사료와 정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험은 ㈜휴벳 기업부설연구소의 실험동물연구윤리위원회의 승인을 받아 실시하였으며(승인번호 HV 2022-002), 시험군은 전혈의 8% 방혈 후 생리식염수를 투여한 대조군(n=3)과 전혈의 8% 방혈 후 재조합 고양이 알부민을 투여한 알부민투여군(n=3)으로 구성하였다.
순화를 거친 실험동물을 케타민(50㎎/㎖)과 럼푼 주사액(23.32㎎/㎖)을 각각 0.1㎖/㎏, 0.1㎖/㎏로 혼합주사하여 마취한 후, 요측피정맥에 카테터를 확보한 후 10 cc 주사기를 이용해 천천히 방혈을 유도한다. 전혈의 8%인 35㎖을 방혈하였다. 방혈 후 알부민 함량의 감소가 확인된 개체를 대상으로 생리식염수 25㎖과 재조합 개 알부민(2g/10㎖/vial)을 실험동물의 체중에 맞게 2g/5㎏로 혼합해 인퓨전 펌프를 이용해 35㎖/h의 속도로 정맥 주입한다. 방혈 전, 방혈 후, 재조합 고양이 알부민 투여 1일, 3일, 7일 후 채혈하여 혈구검사 및 혈청생화학검사 수치변화를 분석하였다.
주요혈액수치 변화
시험군 측정항목 방혈 전
(Baseline)		 방혈 후 1 d 3 d 7 d
재조합 고양이 알부민 Hematocrit (%) 40.9±1.4 33.3±1.4 38.2±4.8 40.1±3.9 41.6±2.8
Globulin (g/dl) 3.8±0.2 3.6±0.1 3.9±0.3 4.0±0.3 4.0±0.3
Albumin (g/dl) 2.8±0.2 2.4±0.2 2.8±0.1 3.0±0.2 3.0±0.2
ALB/GLOB 0.73 0.68 0.73 0.75 0.76
Total Protein (g/dl) 7.1±0.2 6.5±0.2 7.1±0.3 7.4±0.2 7.5±0.1
대조군 Hematocrit (%) 50.2±2.3 41.3±3.3 46.8±4.5 49.1±3.4 50.3±2.8
Globulin (g/dl) 4.5±0.2 4.1±0.3 4.1±0.2 4.3±0.3 4.5±0.1
Albumin (g/dl) 3.0±0.1 2.7±0.3 2.8±0.2 3.0±0.1 2.9±0.2
ALB/GLOB 0.7 0.7 0.7 0.7 0.6
Total Protein (g/dl) 7.5±0.2 6.4±0.2 6.9±0.3 7.3±0.2 7.7±0.2
※정상범위
Hematocrit (HCT, %) : 28~49, Globulin (GLOB, g/dl) : 2.6~5.1,
Albumin (ALB, g/dl) : 2.2~4.1, Total Protein (TP, g/dl) : 5.8~9.1
상기 표 6은 실험동물의 방혈 전(baseline), 방혈 후, 알부민 주입 1일 후, 3일 후 및 7일 후의 혈액수치 변화를 분석한 결과이고, 하기 표 7 및 8은 방혈 전 수치를 기준으로 하여 백분율(%)로 환산한 것이다.
대조군(saline)의 혈액수치 변화 (방혈 전 수치 기준, %)
구분
(%)		 대조군
방혈 전
(Baseline)		 투여 전
(방혈 후)		 투여 후
(1day)		 투여 후
(3day)		 투여 후
(7day)
Hematocrit 100 82.3
(▼ 17.7)		 93.2
(▲ 10.9) 		97.8
(▲ 4.6)		 100.2
(▲ 2.4)
Globulin 100 91.1
(▼ 8.9)		 91.1
(=) 		95.6
(▲ 4.4)		 100
(▲ 4.4)
Albumin 100 90
(▼ 10)		 93.3
(▲ 3.3) 		100
(▲ 6.7)		 96.7
(▼ 3.3)
Total Protein 100 85.3
(▼ 14.7)		 92
(▲ 6.7) 		97.3
(▲ 5.3)		 102.6
(▲ 5.3)
▲,▼: 각 행에서 직전 열의 백분율 값 기준 해당 열의 백분율 값 증감 표시
알부민 투여군의 혈액수치 변화 (방혈 전 수치 기준, %)
구분
(%)		 재조합 고양이 알부민 투여군
방혈 전
(Baseline)		 투여 전
(방혈 후)		 투여 후
(1day)		 투여 후
(3day)		 투여 후
(7day)
Hematocrit 100 81.4
(▼ 18.6)		 93.6
(▲ 12.2) 		98
(▲ 4.4)		 101.7
(▲ 3.7)
Globulin 100 94.7
(▼ 5.3)		 101.7
(▲ 7) 		104.4
(▲ 2.6)		 105.3
(▲ 0.9)
Albumin 100 87.9
(▼ 12.1)		 101.3
(▲ 13.4) 		107.3
(▲ 6)		 109.8
(▲ 2.4)
Total Protein 100 91.5
(▼ 8.5)		 100.5
(▲ 9) 		104.3
(▲ 3.7)		 105.7
(▲ 1.4)
▲,▼: 각 행에서 직전 열의 백분율 값 기준 해당 열의 백분율 값 증감 표시
대조군과 재조합 고양이 알부민 투여군간 큰 차이가 관찰되는 시점은 시험물질 주입 후 1일 시점으로 확인되었고, 이때 혈액 내 알부민 증가 비율은 알부민 투여군에서 대조군 대비 약 10.1% 높게 관찰되었으며, 적어도 7일까지 혈액 내에서 유지됨을 확인할 수 있다. 또한, 개를 이용한 실험에서와 같이 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다. 상기의 결과를 통해 재조합 고양이 알부민 투여가 부작용 없이 알부민 수치 상승에 도움을 준 것으로 사료된다.
한국생명공학연구원 KCTC14617BP 20210621 한국생명공학연구원 KCTC14618BP 20210621
<110> Genecell Biotech Inc., <120> Plant cell lines producing recombinant albumin with high yield and uses thereof <130> PN22136 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1837 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Canis lupus albumin <400> 1 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatc agtagtggtt agcagcaact cactatcgaa 60 cacggtttca gcttacacag atatgaagtg ggtgaccttt atcagcctct tcttcctgtt 120 ctcctcggcc tactctaggg gccttgttag acgcgaggcc tacaagtctg agatcgccca 180 caggtacaac gacctcggcg aggaacattt caggggcctc gtgctcgttg ccttcagcca 240 gtacctccag cagtgcccgt tcgaggatca tgtgaagctc gccaaagagg tgaccgagtt 300 cgccaaggct tgcgccgctg aggaatctgg cgccaactgc gataagtccc tgcacaccct 360 cttcggcgac aagctctgca cagttgccag cctcagggac aagtacggcg acatggctga 420 ctgctgcgag aagcaagagc cggatcgcaa cgagtgcttc ctcgcgcaca aggatgataa 480 cccgggcttc ccaccactcg tggctccaga accagatgct ctctgcgccg ccttccagga 540 taacgagcaa ctcttcctgg gcaagtacct ctacgagatc gccaggcgcc atccgtactt 600 ctacgctcca gagctgctct actacgccca gcagtacaag 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ctggtgaccc cagaggctga tgccatgtgc actgccttcc acgaaaatga acagaggttc 480 ctgggcaaat acttatatga aattgccaga agacatcctt acttttatgc cccagaactc 540 ctttactatg ccgaagaata caaaggagtt tttacagaat gctgcgaagc tgcagataaa 600 gctgcctgcc tgacaccaaa ggttgatgct ttgagagaaa aagtactggc ttcatccgcc 660 aaagagagac tcaagtgtgc cagcctccag aaattcggag aaagagcttt caaagcatgg 720 tcagtagctc gtctgagcca gaaatttccc aaggctgaat ttgcagagat ttccaagtta 780 gtgacagatc ttgccaaaat ccacaaggaa tgctgccatg gtgacctgct tgaatgtgca 840 gatgacaggg cggaccttgc caagtatata tgtgaaaatc aagattcaat ctccactaag 900 ctgaaggaat gctgtggtaa gcctgtgttg gaaaaatccc attgcatcag cgaggtggaa 960 agagatgagt tgcctgctga cctgcccccg ttagctgttg attttgttga agataaggaa 1020 gtttgcaaga actatcagga ggcaaaggat gtgttcctgg gcacgttttt gtatgaatac 1080 tcaagaaggc accctgaata ctctgtctca ttgctactga gacttgccaa ggaatatgaa 1140 gccaccctag agaagtgctg tgccactgat gatcctcctg cttgctatgc ccatgtgttt 1200 gatgaattta aacctcttgt ggaagagcct cacaatttag tcaaaacaaa ctgtgaactt 1260 tttgaaaaac 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cagagcgcaa cgagtgcttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer R2 <400> 6 tctgtacagc acttcgtcac 20 <210> 7 <211> 1940 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAmy3A-Canis lupus albumin <400> 7 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatc agtagtggtt agcagcaact cactatcgaa 60 cacggtttca gcttacacag atatgggcaa gcaaatggct gctctctgcg gcttcctcct 120 cgtggctctc ttgtggctca caccagatgt tgcccatgcc gaggcctaca agtctgagat 180 cgcccacagg tacaacgacc tcggcgagga acatttcagg ggcctcgtgc tcgttgcctt 240 cagccagtac ctccagcagt gcccgttcga ggatcatgtg aagctcgcca aagaggtgac 300 cgagttcgcc aaggcttgcg ccgctgagga atctggcgcc aactgcgata agtccctgca 360 caccctcttc ggcgacaagc tttgcacagt tgccagcctc agggacaagt acggcgacat 420 ggctgactgc tgcgagaagc aagagccgga tcgcaacgag tgcttcctcg cgcacaagga 480 tgataacccg ggcttcccac cacttgtggc cccagaacca gatgctcttt gcgccgcctt 540 ccaggacaac gagcaactct tcctgggcaa gtacctctac gagatcgcca ggcgccatcc 600 gtacttctac gctccagagc tgctctacta cgcccagcag tacaagggcg ttttcgccga 660 gtgctgccaa gccgctgata aggctgcttg cttgggccct aagattgagg ccctccgcga 720 gaaggttctc ctcagctccg cgaaagaacg cttcaagtgc gccagcctcc agaagttcgg 780 cgatagagcc ttcaaggcct ggtctgttgc caggctctct cagaggttcc cgaaggccga 840 tttcgctgag atctccaagg tggtgaccga cctcaccaag gtgcacaaag aatgctgcca 900 cggcgacctg cttgagtgcg ctgatgatag agccgacctc gcgaagtaca tgtgcgagaa 960 ccaggactcc atctccacca agctcaaaga gtgctgcgac aagccagtgc ttgagaagtc 1020 tcagtgcctg gcggaggtcg agagggatga acttccaggc gatctcccat ctctcgccgc 1080 cgacttcgtt gaggacaaag aggtctgcaa gaactaccaa gaggccaagg acgtgttcct 1140 cggcaccttc ctgtacgagt acgctcgcag gcatccagag tactccgtta gcttgctcct 1200 ccgcctcgcg aaagagtacg aggcgacatt ggagaagtgc tgcgccaccg atgatccgcc 1260 aacatgctac gccaaggtgc tcgacgagtt caagccgctc gttgacgagc cacagaacct 1320 cgtcaagacg aactgcgagc tgttcgagaa gctcggcgag tacggcttcc agaatgccct 1380 cctcgtccgc tacaccaaga aggccccaca ggttagcacc ccaactctcg ttgaggtgtc 1440 acgcaagctc ggcaaggtgg gcacaaagtg ctgcaagaag cctgagtccg agcgcatgtc 1500 ttgcgccgag gatttcctct ccgtggtgct caataggctc tgcgtgctcc acgaaaagac 1560 cccggtttct gagcgcgtga ccaagtgctg ctctgagtcc ctcgttaacc gcaggccatg 1620 cttctctggc cttgaggtgg acgagacata cgtgccgaaa gagttcaacg ccgagacatt 1680 caccttccac gccgacctct gcacactccc agaggctgag aagcaggtca agaaacagac 1740 cgcgctggtc gagctgctca agcacaagcc aaaggccaca gacgagcagc tcaagaccgt 1800 gatgggcgat ttcggcgcct tcgtggaaaa gtgctgtgcc gcggagaaca aagagggatg 1860 cttcagcgaa gagggcccga agttggttgc tgccgctcaa gctgctctcg tgtgataggt 1920 accgctttga gaccctcgag 1940 <210> 8 <211> 1925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VspA-Canis lupus albumin <400> 8 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatc agtagtggtt agcagcaact cactatcgaa 60 cacggtttca gcttacacag atatgaagat ggtggtgctc gtgttcttcg tggccaccat 120 tctcgtggcc tggcaatgcc acgccgaggc ctacaagtct gagatcgccc acaggtacaa 180 cgacctcggc gaggaacatt tcaggggcct cgtgctcgtt gccttcagcc agtacctcca 240 gcagtgcccg ttcgaggatc atgtgaagct cgccaaagag gtgaccgagt tcgccaaggc 300 ttgcgccgct gaggaatctg gcgccaactg cgataagtcc ctgcacaccc tcttcggcga 360 caagctttgc acagttgcca gcctcaggga caagtacggc gacatggctg actgctgcga 420 gaagcaagag ccggatcgca acgagtgctt cctcgcgcac aaggatgata acccgggctt 480 cccaccactt gtggccccag aaccagatgc tctttgcgcc gccttccagg acaacgagca 540 actcttcctg ggcaagtacc tctacgagat cgccaggcgc catccgtact tctacgctcc 600 agagctgctc tactacgccc agcagtacaa gggcgttttc gccgagtgct gccaagccgc 660 tgataaggct gcttgcttgg gccctaagat tgaggccctc cgcgagaagg ttctcctcag 720 ctccgcgaaa gaacgcttca agtgcgccag cctccagaag ttcggcgata gagccttcaa 780 ggcctggtct gttgccaggc tctctcagag gttcccgaag gccgatttcg ctgagatctc 840 caaggtggtg accgacctca ccaaggtgca caaagaatgc tgccacggcg acctgcttga 900 gtgcgctgat gatagagccg acctcgcgaa gtacatgtgc gagaaccagg actccatctc 960 caccaagctc aaagagtgct gcgacaagcc agtgcttgag aagtctcagt gcctggcgga 1020 ggtcgagagg gatgaacttc caggcgatct cccatctctc gccgccgact tcgttgagga 1080 caaagaggtc tgcaagaact accaagaggc caaggacgtg ttcctcggca ccttcctgta 1140 cgagtacgct cgcaggcatc cagagtactc cgttagcttg ctcctccgcc tcgcgaaaga 1200 gtacgaggcg acattggaga agtgctgcgc caccgatgat ccgccaacat gctacgccaa 1260 ggtgctcgac gagttcaagc cgctcgttga cgagccacag aacctcgtca agacgaactg 1320 cgagctgttc gagaagctcg gcgagtacgg cttccagaat gccctcctcg tccgctacac 1380 caagaaggcc ccacaggtta gcaccccaac tctcgttgag gtgtcacgca agctcggcaa 1440 ggtgggcaca aagtgctgca agaagcctga gtccgagcgc atgtcttgcg ccgaggattt 1500 cctctccgtg gtgctcaata ggctctgcgt gctccacgaa aagaccccgg tttctgagcg 1560 cgtgaccaag tgctgctctg agtccctcgt taaccgcagg ccatgcttct ctggccttga 1620 ggtggacgag acatacgtgc cgaaagagtt caacgccgag acattcacct tccacgccga 1680 cctctgcaca ctcccagagg ctgagaagca ggtcaagaaa cagaccgcgc tggtcgagct 1740 gctcaagcac aagccaaagg ccacagacga gcagctcaag accgtgatgg gcgatttcgg 1800 cgccttcgtg gaaaagtgct gtgccgcgga gaacaaagag ggatgcttca gcgaagaggg 1860 cccgaagttg gttgctgccg ctcaagctgc tctcgtgtga taggtaccgc tttgagaccc 1920 tcgag 1925 <210> 9 <211> 1940 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAmy3A-Felis catus albumin <400> 9 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatc agtagtggtt agcagcaact cactatcgaa 60 cacggtttca gcttacacag atatgggcaa gcaaatggct gctctctgcg gcttcctcct 120 cgtggctctc ttgtggctca caccagatgt ggcccatgcc gaggctcatc agtctgagat 180 cgcccacagg ttcaacgacc tcggcgagga acatttcagg ggcctcgtgc tcgttgcctt 240 cagccagtac ctccagcagt gcccgttcga ggatcacgtg aagctcgtga acgaggtgac 300 cgagttcgcc aagggatgcg tggcagatca atccgccgcc aactgcgaga agtccctcca 360 tgaactcctc ggcgacaagc tttgcacagt tgccagcctc agggacaagt acggcgagat 420 ggctgactgc tgcgaaaaga aagagccaga gcgcaacgag tgcttcctcc agcacaagga 480 cgacaaccca ggcttcggcc aactcgttac accagaggcc gatgccatgt gcaccgcctt 540 ccatgagaat gagcaacgct tcctcggcaa gtacctctac gagatcgctc gcaggcaccc 600 gtacttctac gctccagagc ttctctacta cgccgaagag tacaagggcg tgttcaccga 660 gtgctgcgag gccgccgata aggctgcttg cctcacacca aaagtggacg ccctccgcga 720 gaaggttttg gcctcttccg ccaaagaacg cctcaagtgc gccagcctcc aaaagtttgg 780 cgagagggcc ttcaaggcct ggtctgttgc taggctctcc cagaagttcc cgaaggctga 840 gttcgccgag atctccaagc tcgtcaccga cctcgccaag atccacaaag aatgctgcca 900 cggcgacctg cttgagtgcg ctgatgatag agccgacctg gcgaagtaca tctgcgagaa 960 ccaggactcc atctccacca agctcaaaga gtgttgcggc aagccggtgc tcgaaaagtc 1020 ccactgcatc tccgaggtcg agagggatga gcttccagcg gatctcccac cactcgccgt 1080 ggatttcgtc gaggacaaag aggtgtgcaa gaactaccaa gaggcgaagg acgtgttcct 1140 gggcaccttc ctgtacgagt actcccgcag gcatccagag tactccgtta gcttgctcct 1200 ccgcctcgcc aaagagtacg aggcgacact tgagaagtgc tgcgccaccg atgatccgcc 1260 agcctgctac gcccatgtgt tcgatgagtt caagccgctg gtcgaggaac cgcacaacct 1320 cgtcaagacg aactgcgagc tgttcgagaa gctcggcgag tacggcttcc agaatgccct 1380 cctcgtccgc tacaccaaga aggtcccaca ggtcagcacc ccgacactcg ttgaggtgtc 1440 aagatctctc ggcaaggtgg gctccaagtg ctgcacacat ccagaggctg agagactctc 1500 ctgcgccgag gattacctct ccgtggtgct caataggctc tgcgtgctcc acgaaaagac 1560 cccggtttct gagcgcgtga cgaagtgctg tacagagtcc ctcgtgaacc gcaggccatg 1620 cttctctgcc ctccaagtgg acgagacata cgtgccgaaa gagttctccg ccgagacatt 1680 caccttccac gccgacctct gcactttgcc tgaggccgag aagcagatca agaaacagag 1740 cgccctcgtc gagctgctca agcacaagcc aaaggccacc gaggaacagc tcaagaccgt 1800 gatgggcgac ttcggctcct tcgtggataa gtgctgtgcc gcggaggaca aagaagcctg 1860 ctttgctgaa gagggcccga agctcgttgc tgccgctcaa gctgccctcg cctgataggt 1920 accgctttga gaccctcgag 1940 <210> 10 <211> 1925 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VspA-Felis catus albumin <400> 10 ggttaattaa ggtctcaagg ttctagaatc agtagtggtt agcagcaact cactatcgaa 60 cacggtttca gcttacacag atatgaagat ggtggtgctc gtgttcttcg tggccaccat 120 tctcgtggcc tggcaatgcc acgccgaggc tcatcagtct gagatcgccc acaggttcaa 180 cgacctcggc gaggaacatt tcaggggcct cgtgctcgtt gccttcagcc agtacctcca 240 gcagtgcccg ttcgaggatc acgtgaagct cgtgaacgag gtgaccgagt tcgccaaggg 300 atgcgtggca gatcaatccg ccgccaactg cgagaagtcc ctccatgaac tcctcggcga 360 caagctttgc acagttgcca gcctcaggga caagtacggc gagatggctg actgctgcga 420 aaagaaagag ccagagcgca acgagtgctt cctccagcac aaggacgaca acccaggctt 480 cggccaactc gttacaccag aggccgatgc catgtgcacc gccttccatg agaatgagca 540 acgcttcctc ggcaagtacc tctacgagat cgctcgcagg cacccgtact tctacgctcc 600 agagcttctc tactacgccg aagagtacaa gggcgtgttc accgagtgct gcgaggccgc 660 cgataaggct gcttgcctca caccaaaagt ggacgccctc cgcgagaagg ttttggcctc 720 ttccgccaaa gaacgcctca agtgcgccag cctccaaaag tttggcgaga gggccttcaa 780 ggcctggtct gttgctaggc tctcccagaa gttcccgaag gctgagttcg ccgagatctc 840 caagctcgtc accgacctcg ccaagatcca caaagaatgc tgccacggcg acctgcttga 900 gtgcgctgat gatagagccg acctggcgaa gtacatctgc gagaaccagg actccatctc 960 caccaagctc aaagagtgtt gcggcaagcc ggtgctcgaa aagtcccact gcatctccga 1020 ggtcgagagg gatgagcttc cagcggatct cccaccactc gccgtggatt tcgtcgagga 1080 caaagaggtg tgcaagaact accaagaggc gaaggacgtg ttcctgggca ccttcctgta 1140 cgagtactcc cgcaggcatc cagagtactc cgttagcttg ctcctccgcc tcgccaaaga 1200 gtacgaggcg acacttgaga agtgctgcgc caccgatgat ccgccagcct gctacgccca 1260 tgtgttcgat gagttcaagc cgctggtcga ggaaccgcac aacctcgtca agacgaactg 1320 cgagctgttc gagaagctcg gcgagtacgg cttccagaat gccctcctcg tccgctacac 1380 caagaaggtc ccacaggtca gcaccccgac actcgttgag gtgtcaagat ctctcggcaa 1440 ggtgggctcc aagtgctgca cacatccaga ggctgagaga ctctcctgcg ccgaggatta 1500 cctctccgtg gtgctcaata ggctctgcgt gctccacgaa aagaccccgg tttctgagcg 1560 cgtgacgaag tgctgtacag agtccctcgt gaaccgcagg ccatgcttct ctgccctcca 1620 agtggacgag acatacgtgc cgaaagagtt ctccgccgag acattcacct tccacgccga 1680 cctctgcact ttgcctgagg ccgagaagca gatcaagaaa cagagcgccc tcgtcgagct 1740 gctcaagcac aagccaaagg ccaccgagga acagctcaag accgtgatgg gcgacttcgg 1800 ctccttcgtg gataagtgct gtgccgcgga ggacaaagaa gcctgctttg ctgaagaggg 1860 cccgaagctc gttgctgccg ctcaagctgc cctcgcctga taggtaccgc tttgagaccc 1920 tcgag 1925 <210> 11 <211> 26 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 11 Met Gly Lys Gln Met Ala Ala Leu Cys Gly Phe Leu Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Trp Leu Thr Pro Asp Val Ala His Ala 20 25 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Glycine max <400> 12 Met Lys Met Val Val Leu Val Phe Phe Val Ala Thr Ile Leu Val Ala 1 5 10 15 Trp Gln Cys His Ala 20 <210> 13 <211> 27 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 13 Met Ala Thr Gln Arg Arg Ala Asn Pro Ser Ser Leu His Leu Ile Thr 1 5 10 15 Val Phe Ser Leu Leu Val Ala Val Val Ser Ala 20 25 <210> 14 <211> 26 <212> PRT <213> Malus domestica <400> 14 Met Ala Leu Lys Thr Gln Leu Leu Trp Ser Phe Val Val Val Phe Val 1 5 10 15 Val Ser Phe Ser Thr Thr Ser Cys Ser Gly 20 25 <210> 15 <211> 24 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 15 Met Gly Lys Asn Gly Ser Leu Cys Cys Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gly Leu Ala Ser Gly 20 <210> 16 <211> 24 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 16 Met Ala Asn Lys His Leu Ser Leu Ser Leu Phe Leu Val Leu Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Ala Ser Leu Ala Ser Gly 20 <210> 17 <211> 25 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 17 Met Lys Asn Thr Ser Ser Leu Cys Leu Leu Leu Leu Val Val Leu Cys 1 5 10 15 Ser Leu Thr Cys Asn Ser Gly Gln Ala 20 25 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 18 Met Ala Ser Ile Asn Arg Pro Ile Val Phe Phe Thr Val Cys Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Cys Asn Gly Ser Leu Ala 20 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 19 Met Gly Lys Met Ala Ser Leu Phe Ala Thr Leu Leu Val Val Leu Val 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ala Ser Glu Ser Ser Ala 20 25 <210> 20 <211> 23 <212> PRT <213> Nicotiana benthamiana <400> 20 Met Leu Pro Phe Ser Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val 1 5 10 15 Ile Ser His Ser Cys Arg Ala 20 <210> 21 <211> 24 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 21 Met Ala Lys Asn Val Ser Ile Phe Gly Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Val Pro Ser Gln Ile Phe Ala 20 <210> 22 <211> 22 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 22 Met Gly Thr Arg Leu Leu Ala Leu Ala Pro Trp Leu Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Gln Leu Ala Gly Ala 20 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 23 Met Ala Ala Leu Ser Gln Leu Val Leu Val Thr Ala Phe Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Leu Pro Leu Gly Met Ala Ala 20 25

Claims (15)

  1. 개 또는 고양이 유래 알부민을 고효율로 생산하기 위한, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 벼 아밀레이즈 3A(RAmy3A) 유래 신호 펩티드(Signal Peptide, SP) 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 콩 저장단백질 A(VspA) 유래 신호 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 개 또는 고양이 유래 알부민 유전자의 5'-말단에 결합된, 재조합 핵산.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 개 또는 고양이 유래 알부민 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 핵산.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항의 재조합 핵산이 작동가능하게 연결된, 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 발현 벡터는 5'-UTR, 신호 펩티드를 코딩하는 염기서열 및 개 또는 고양이 알부민의 성숙 펩티드(mature peptide)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 7 내지 10 중 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 발현 벡터.
  9. 제6항의 발현 벡터를 포함하는, 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 재조합 개 알부민 또는 재조합 고양이 알부민을 고효율로 생산하는 식물세포인 것을 특징으로 하는, 숙주세포.
  11. 제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 고효율로 개 또는 고양이 유래 알부민을 생산하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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