CN110437302A - 基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其将重力层析柱或阳离子交换层析柱嵌套至收集管中,放置于组分收集器,并将所述商业蛋白层析系统流路改至组分收集器进行多种缓冲液的依序添加;所述重力层析柱或阳离子交换层析柱均装填填料,装填时使用上塞板;所述缓冲液添加的过程通过所述商业蛋白层析系统的在线检测器进行实时观测;每一缓冲液添加后均有一暂停时间,所述暂停时间与缓冲液种类、层析柱类型、层析柱填料种类有关。本发明解决了目前商业蛋白层析系统每次只可在线或纯化一根层析柱的问题,能够实现高通量同时在线纯化;且能够通过仪器进行纯化操作并对纯化过程进行实时监控,便于观测与操作。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药和生物化工行业中的蛋白纯化相关领域,特别是涉及一种基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法。
背景技术
近年来,国内外生物医药行业迅猛发展,每年都有众多生物药面市并造福病患。在生物制药行业,下游纯化是生产中的重要环节,而在该下游纯化工艺的开发阶段,往往需要进行大量的蛋白纯化工作。
蛋白纯化工艺的开发一般可通过商业蛋白纯化系统完成,但在生物制药下游工艺开发的早期过程中,往往需要进行大量的小样蛋白纯化,包括早期纯化条件筛选,少量样品制备等,由于现有商业化蛋白层析系统基本都为单柱设计,即每次只可在线或纯化一根层析柱,其通量较低,不适合同时进行大通量的蛋白纯化;即便是连续流系统,也不能实现大批量的多柱同时在线纯化。而手动纯化柱相较于商业化蛋白层析系统,在样品通量上具有显著的优势,一个试验人员一般每次可操作多达20根重力柱纯化柱,因此手动过柱纯化方法依旧被用于大通量蛋白小样品制备或条件筛选。然而,虽然传统的手动过柱纯化方法可以实现大通量的蛋白纯化,但缺乏对试验过程的监控与记录,给试验复核与审计带来不便。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种便捷的、半自动化的大通量纯化方法。
为达前述目的,本发明提供一种基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其通过改装现有的商业蛋白层析系统达成。现有主流的蛋白层析系统主要是以美国通用电气(GE)公司的AKTA系列为首,另外美国波尔(Pall)公司和伯乐(Bio-Rad)公司也都有类似的蛋白层析系统。在国内,赛分和三为等厂家也有蛋白层析系统。
本发明提供的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其将重力层析柱或阳离子交换层析柱嵌套至收集管中,放置于组分收集器,并将所述商业蛋白层析系统流路改至组分收集器进行多种缓冲液的依序添加;所述重力层析柱或阳离子交换层析柱均装填填料,装填时使用上塞板;所述缓冲液添加的过程通过所述商业蛋白层析系统的在线检测器进行实时观测,观测内容包括:缓冲液pH、电导率、所添加的缓冲液体积;每一缓冲液添加后均有一暂停时间,所述暂停时间与缓冲液种类、层析柱类型、层析柱填料种类有关。
作为一个具体的实例,所述层析柱为重力层析柱,所述方法的实验步骤为:漂洗、消毒、平衡、上样、淋洗(一)、淋洗(二)、洗脱、再生、漂洗、消毒、漂洗、保存。
作为一个具体的实例,所述层析柱为阳离子交换层析柱,所述方法的实验步骤为:消毒、平衡、上样、淋洗(一)、洗脱、再生、漂洗、消毒、保存。
所述暂停时间需通过测试层析柱流速以计算所需暂停时间。
每一步骤所用的缓冲液在添加完毕后均需复位组分收集器位置,以保证后续缓冲液的添加均从第一个层析柱开始。
其中,所述上样步骤为人工手动加样品至层析柱中。
其中,所述洗脱步骤前,需人工手动将层析柱嵌套至相应收集管中以收集层析过柱后的样品。
具体的,基于不同的商业蛋白层析系统组分收集器,层析柱的尺寸也随之不同,需保证层析柱的高度、直径均与所用的商业蛋白层析系统组分收集器的样品架的规格相匹配,目前较通用的为15mL或50mL离心管适用的离心层析柱,具体选择需给予组分收集器中收集管尺寸大小而定。
具体的,所述方法的最大通量为所述组分收集器的最大容量,通常市面上的商业蛋白层析系统的组分收集器可放置的层析柱数量从几十到上百不等。
具体的,所述重力层析柱或阳离子交换层析柱均装填填料,装填时使用塞板,以防添加缓冲液时填料飞溅。
具体的,所述商业蛋白层析系统的泵源的数量大于所述方法中缓冲液的种数,通常市面上的商业蛋白层析系统多配置单泵6-7路缓冲液进口管线。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明既实现了高通量同时在线纯化,且能够通过仪器进行纯化操作并对纯化过程进行实时监控,便于观测与操作。
该方法可适用与目前市面上常见的大多数商业蛋白层析系统,例如:AKTA Prime,AKTA Purifier,AKTA Explore,AKTA Pure系列;Bio-Rad Duoflow系统;赛分SCG蛋白层析系统;三为蛋白层析系统等。
附图说明
图1本发明的方法流程。
图2实施例二中的三组样品试验蛋白层析柱A与B的收率对比。
图3实施例二中样品的SDS-PAGE蛋白质电泳胶图:C为对照,其样品为传统的手动重力柱纯化样品,1-6泳道的样品为如表2所示的本方法纯化的样品。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:
本实施例基于国产赛分蛋白层析系统(SCG-100),以利用抗体蛋白A亲和填料纯化单克隆抗体试验为例,介绍本发明的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法。
如图1所示,深色线路为本发明所用流路,其将商业蛋白层析系统流路改至组分收集器,绕开了商业蛋白层析系统原有的层析柱流路(浅色线路),以实现对位于组分收集器上的层析柱进行缓冲液添加。
赛分SCG-100层析系统包括双通道的A泵和B泵,其中A泵的A1通道为8源通路,一个泵源可放置一种缓冲液,最多可放置8种缓冲液。本实施例的组分收集器架为50mL样品架,配合使用50mL离心管作为收集管,收集时将10mL离心式重力层析柱(上海生工-C006727)嵌套于50mL离心管,每根层析柱装填1mL MabSelectSure蛋白A亲和填料(GE,7543803),且为防止填料在层析过程中飞溅,层析柱填料装填时均使用了上塞板。
本实施例所示为使用蛋白A亲和填料从细胞发酵液中纯化单克隆抗体,如表一所示,步骤依次为:漂洗、消毒、平衡、上样、淋洗(一)、淋洗(二)、洗脱、再生、漂洗、消毒、漂洗、保存;所涉及的缓冲液在泵中的各泵源的对应位置如下:A1-1漂洗/平衡/淋洗(一)缓冲液,A1-2消毒液,A1-3淋洗(二)缓冲液,B1洗脱缓冲液,B2保存液,A1-6再生缓冲液。
表一:本发明所述的纯化步骤详情
由于缓冲液流动至位于组分收集器的层析柱过柱需要一定的时间,因此每步的缓冲液添加至层析柱后都有一个“暂停”时间,“暂停”结束后,所述层析系统自动进行下一步运行。本实施例的所述“暂停”时间一般为5分钟,但考虑到消毒效率,消毒步骤的“暂停”时间为15分钟。但在其他实施例中,由于所述暂停时间与缓冲液种类、层析柱类型、层析柱填料种类等因素有关,因此所述暂停时间需通过测试层析柱流速以计算所需暂停时间。
平衡以及淋洗(二)步骤之后系统“永久暂停”,需操作人员手动完成上样以及将层析柱嵌套至收集管,而后让所述层析系统继续运行。其间,其缓冲液pH、电导以及添加体积与位置均由所述商业蛋白层析系统的在线检测器记录,便于观测。
所述承载样品组分收集器的机械臂在添加每步的缓冲液后均重新归位,以使下一步骤的缓冲液添加亦是从第一根层析柱开始,保证每一缓冲液的层析柱添加顺序均一致。
本发明的所述方法的整个过程需要人工手动介入的仅为上样和洗脱液收集管放置,其余步骤均由系统自动控制,但在其他实施例中,若所使用的商业蛋白纯化系统的泵源数量足以采用支持系统上样,则所述方法亦可完成系统自动上样。
本发明的方法还适用于其他商业蛋白层析系统,例如:AKTA Prime,AKTAPurifier,AKTA Explore,AKTA Pure系列;Bio-Rad Duoflow系统;赛分SCG蛋白层析系统;三为蛋白层析系统等。
实施例二:产品稳定性试验
基于实施例一所述的方法,对该方法中同一批次间、不同批次间的不同层析柱的产品结果的一致性,以及不同通量对产品结果的影响进行试验。在本试验中,设置三组试验组,每组的层析柱通量均不同,每一组在同一批次中随机抽取2根不同柱位的层析柱,对其纯化产品的收率、质量进行测试。
第一组试验设置通量为2根层析柱,抽取位于1号和2号位置的两根层析柱进行测试;
第二组试验设置通量为10根层析柱,抽取位于3号和9号位置的两根层析柱进行测试;
第三组试验设置通量为5根层析柱,抽取位于2号和5号位置的两根层析柱进行测试。
(1)产品收率
层析产品收率计算公式如下:
收率=(洗脱产品浓度x洗脱产品体积)/(上样产品浓度x上样体积)x100%
表二:三组试验蛋白收率对比
结果如表二所示,本实施例中,组与组之间的产品样品收率相当,可见本发明方法的纯化效果不受通量的影响。三次试验中层析柱A的收率与B的收率误差(RSD)均在3%以内,表明此方法试验高度重复性,具体如图2所示,柱A与柱B之间的差异可能来自于手动填料装填量的差异。
(2)产品质量试验:取纯化样品进行SDS-PAGE分析
将60μL纯化后的产品与20μL 4x上样缓冲液(Thermo Fisher NP0008)混合,并于90度金属加热器上加热5分钟。吸取10μL处理后的上样样品加至NuPAGE(Invitrogene,WG1401A),加入稀释到1X的跑胶缓冲液(Thermo Fisher,NP0001)在恒压200V下,电泳35分钟。电泳完成后将胶在染色液(Thermo Fisher,24620)中染色半小时,然后使用纯化水进行振荡脱色直至胶中条带清新可见。
各泳道排列如表二所示,同时以传统的手动重力柱纯化样品作为对照,结果见图3,C为传统的手动重力柱纯化样品,泳道1至6本发明方法纯化的样品,各条带分子量大小一致,可知本发明的方法与传统的手动重力柱纯化的方法所得样品的质量基本一致,且不同批次、不同通量的样品纯化效果基本一致。
综上,本发明所提供的纯化方法所得纯化产品性质稳定。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,将重力层析柱或阳离子交换层析柱嵌套至收集管中,所述收集管放置于组分收集器,并将所述商业蛋白层析系统流路改至组分收集器进行多种缓冲液的依序添加;所述重力层析柱或阳离子交换层析柱均装填填料,装填时使用上塞板;所述缓冲液添加的过程通过所述商业蛋白层析系统的在线检测器进行实时观测,观测内容包括:缓冲液pH、电导率、所添加的缓冲液体积;每一缓冲液添加后均有一暂停时间,所述暂停时间根据缓冲液种类、层析柱类型、层析柱填料种类计算设定。
2.根据权利要求1所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,使用重力层析柱,所述方法的实验步骤为:漂洗、消毒、平衡、上样、淋洗一、淋洗二、洗脱、再生、漂洗、消毒、漂洗、保存。
3.根据权利要求1所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,使用阳离子交换层析柱,所述方法的实验步骤为:消毒、平衡、上样、淋洗、洗脱、再生、漂洗、消毒、保存。
4.根据权利要求1所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述商业蛋白层析系统选自:AKTA Prime,AKTA Purifier,AKTA Explore,AKTA Pure系列;Bio-Rad Duoflow系统;赛分SCG蛋白层析系统;三为蛋白层析系统。
5.根据权利要求1所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述重力层析柱或阳离子交换层析柱为15mL或50mL离心管适用的离心层析柱。
6.根据权利要求2或3所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,组分收集器的机械臂在每一步骤所用的缓冲液添加完毕后均复位初始位置,以保证每一步骤的缓冲液的添加顺序于每一所述重力层析柱或阳离子交换层析柱均一致。
7.根据权利要求2或3所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述上样步骤为人工手动加样品至所述重力层析柱或阳离子交换层析柱中。
8.根据权利要求2或3所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述洗脱步骤前,人工手动将所述重力层析柱或阳离子交换层析柱嵌套至收集管中以收集层析过柱后的样品。
9.根据权利要求1-3任一所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述方法的最大通量为所述组分收集器可放置层析柱的最大容量。
10.根据权利要求1-3任一所述的基于商业蛋白层析系统的半自动化高通量纯化方法,其特征在于,所述商业蛋白层析系统的泵源的数量大于所述方法中缓冲液的种数。
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US20140018525A1 (en) * | 2011-03-29 | 2014-01-16 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102190704A (zh) * | 2010-03-17 | 2011-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 蛋白层析系统 |
US20140018525A1 (en) * | 2011-03-29 | 2014-01-16 | Glaxosmithkline Llc | Buffer system for protein purification |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
苏州赛谱仪器有限公司: ""苏州赛谱仪器产品手册"", 《豆丁网》 * |
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