KR100270209B1 - 면역반응을 통해 결정될 수 있는 성분의 고상면역 분석용 일방향 반응용기와 그 성분의 측정방법 - Google Patents

면역반응을 통해 결정될 수 있는 성분의 고상면역 분석용 일방향 반응용기와 그 성분의 측정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양 단부가 개방되어 있고, 활성 또는 활성화된 표면을 가지는 기질상에 적용된 적어도 하나의 면역 반응성 성분을 가지는 고상 면역 분석용 일방향 반응 용기에 관한 것이다. 상기 반응성 성분은 결정될 성분이 유동 액체가 기질을 빠져나가기 전에 상기 반응성 성분에 정량적 (결합 평형적)으로 결합되는 그러한 적하 밀도를 가진다; 상기 기질베드의 용적이 600μl에 달하고, 따라서 기질베드로부터의 상기 액체의 유동 관통속도가 결정된다. 상기 일 방향 반응 용기는 면역 반응에 기초하여 결정될 수 있는 성분을 측정하는데 사용될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
면역반응을 통해 결정될 수 있는 성분의 고상면역 분석용 일방향 반응용기와 그 성분의 측정 방법
[발명의 상세한 설명]
[설명]
본 발명은 고상면역분석용 일회용 반응용기와 그 적용방법에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는 생체분자의 예비정제에 널리 적용되는 기술이다. 이 기술에서는 정량(determined)될 분자와 상보결합상대물 사이의 특정 상호작용이 이용된다. 이런 방법의 일반적인 실시에 있어서 고상기질에 결합된 상호 상보 결합상대물 중의 하나를 포함하는 크로마토그래픽 컬럼에 정화될 생체분자를 함유하는 샘플이 가해진다. 상보 결합 상대물 쌍의 예로는 효소와 그 기질, 항체와 합텐 또는 항원, 상호 상보 DNA 또는 RNA단일 체인이 있다.
면역 친화성 크로마토그래피에서, 정량분석을 위해 항원, 합텐 및 상보 항체간의 상호작용을 이용한다.
지금까지, 친화성 크로마토그래피를 사용하는 면역분석에 있어서, 고상기질에 결합된 항체 또는 항원(이하 리간드로 지칭)으로 채워진 재사용 컬럼을 일반적으로 사용한다. 신속한 크로마토그래프 과정을 보증하기 위해, 분석될 샘플을 고압으로 크로마토그래픽 컬럼을 통해 가압한다. 고압 액상 크로마토그래프(HPLC)의 면역분석적용은 예를들어, 1985년 간행된 문헌 “어낼러티칼 케미스트리” 57권, 2754-2756 페이지에 수록된 드 엘비스 더블유. 유, 및 윌슨, 지.에스의 논문 및 1983년 간행된 문헌 ”어낼러티칼 케미스트리” 55권, 771-775 페이지에 수록된 스포츠만, 제이.알 외 다수의 논문에 설명되어 있다. 그러나 HPLC를 면역분석용으로 사용하는 것은 몇 가지 약점을 지니고 있다. 그 한가지는 이러한 기술에는 값비싼 장비를 사용해야 된다는 것이다. 또다른편으로, 이러한 분석에 사용되는 크로마토그래픽 컬럼은 고도의 기술적 요구에 부합되어야 한다. 상기 컬럼은 HPLC에 적용되는 고압에 견뎌야되고, 또한 이러한 기술을 합리적으로 적용할 수 있도록 재사용할 수 있어야 한다. 그러나, 상기 컬럼을 재사용하기 위해서는 새로운 샘플을 동일 컬럼상에서 분석하기 전에 추가적인 수단이 필요하다. 독일 연방공화국 특허 공보 제 DE-OS 37 11 894호에 개시된 바와같이, 전단계 실험의 치환되고, 불완전하게 용출된 물질이 작용하는 것을 방지하기 위해 모든 분석전에 재사용 컬럼을 재생시켜야 한다.
독일연방공화국 특허 공보 제 DE-OS 24 48 411호에는 고상 면역분석용 반응용기가 서술되어 있다. 그러나 정량적 분석전에, 다중 용도의 이 용기는 정량될 성분의 표준물로 조정된다. 이외, 컬럼을 통한 유동이 끝나는 긴 배양시간이 상기 반응용기에서 필요하다. 정량될 성분과 상기 기질상에 적하된 면역적 상보 결합 대상물과의 충분한 결합을 충분히 실행하는데는 6시간 내지 2일의 시간이 요구된다. 그러나, 결합이 합리적인 실행을 보장하는데 1 내지 2일이 걸리는 평형에 도달하기 전에, 상기 결합반응은 항상 종결된다. 표준용액으로 조정하는 요건은 상기 결합반응의 조기종결에 대한 결과로서 나타난 것이기도 하다.
실제, 일회용 컬럼을 선호함에 따라, 독일연방공화국 특허 공보 제DE-PS 26 26 823호에는 원심력을 적용하는 분석기기를 사용하여 특히 방사성 면역분석용 예비제작 일회용 흡수컬럼을 제조하는 방법이 기재되어 있다.
그러나, 이러한 컬럼은 반응컬럼이 아니고 특히 면역 반응성 성분으로 채워지지 않기 때문에 면역반응 후의 분리에만 유용한 것이다. 겔 베드를 통한 분리동안 방해효과를 방지하기 위해서, 다공성 장치의 내유동성을 가능한한 낮게 유지시킨다.
본 발명의 목적은 신속하고 직접적인 면역분석을 실행하게하고, 취급하기 쉽고, 및 예비 조정 이나 재생없이 즉시 사용할 수 있는 쉬운 고상 면역 분석용 일회용 반응 용기 및 이의 적용방법을 제공하는 것이다.
상기 장치에 관하여 언급하면, 이는 본 발명에 따라서, 상부 및 하부단부에서 개방되어 있고, 적어도 하나의 면역적 반응성 성분이 기질에 결합되어 있으며, 600μl 까지의 기질 베드 용적, 및 기질의 투과성에 의한 액체유동속도의 결정을 특징으로하는 고상 면역 분석용 일회용 반응 용기에 의해 성취될 수 있다. 상기 기질은 고체 프릿이나 멤브레인 등이고, 또는 상부 및 하부의 분리된 장치 사이에 놓여있다.
본 발명의 방법에 관해서는, 면역 반응을 통해 결정될 수 있으며, 분석될 샘플을 하기 청구범위 1항 내지 20항중 어느 한 항일 따른 일회용 반응용기에 적용시킴을 특징으로하고, 분석될 샘플 성분을 상기 일회용 반응을 용기에서 직접적으로 유동 통과할 동안 상보면역반응성분에 의해 보지됨을 또한 특징으로하여, 상기 정량될 성분은 a)용출 및 정량되거나 b)증폭반응을 통해 통상의 면역적 표식자로써 상기 일회용 반응 용기에서 표식된 후 정량되거나, 또는 c)상기 정량될 성분에 경쟁반응 관계에 있는 표식된 화합물을 통하여 정량되는, 성분 정량 방법에 의해 성취될 수 있다.
본 발명은 첨부된 제1도 및 제2도와 연계하여 상세히 설명되는 바, 제1(a)도는 두개의 분리된 장치 2a 및 2b를 포함하며, 이 사이에 기질이 면역적 반응 성분 3과 함께 위치하는 본 발명에 따른 일회용 반응 용기 1의 종단면도이다.
제1(b)도는 상기 일회용 반응 용기의 평면도이다.
제 2 도는 항체 생성 조절을 위한 온라인 시스템의 개략도이다.
도면 제1(a)도 및 제1(b)도에서 제시된 수치는 예를들기 위한 것일 뿐이다.
상술한 일회용 반응 용기 1 및 상기 일회용 반응 용기 1을 사용하는 상술한 방법은 주지된 반응용기 및 방법에 비하여 몇가지 상당한 장점을 나타낸다.
상술한 일회용 반응 용기 1은 면역 반응에 의해 정량될 수 있는 성분을 정량적으로 결정하는데 신속한 실행을 가능하게 한다. 반응용기 1은 취급에 있어서, 매우 간단하며 HPLC 장치와 같은 고가의 설비 사용을 요하지 않는다. 이외, 전술한 일회용 반응 용기로써, 면역적 반응 성분과 결합된 기질(이하 기질 베드로 지칭)을 매우 적게 소비하고도 탁월한 결과를 얻는다.
일회용 반응 용기 1은 바람직하게는 50μl의 기질 베드 용적 8, 즉, 상부 및 하부 분리 장치 2a 및 2b 사이의 용적을 가진다. 작은 기질 베드 용적은 적은 용량의 용출 액체를 사용하게하여, 용출의 희석 효과가 작게 유지되는 결과를 낳게하고, 따라서, 검출한계는 더욱 큰 용출 용적이 필요한 여타 방법에 비하여 낮아지지 않는다.
또한, 전술한 반응 용기 1은 결정될 성분과 면역적 반응 성분간의 결합 평형에서의 정량적 결정(종점 결정)을 가능하게 한다. 결합 평형은 전술한 일회용 반응 용기 1에서 1 분의 배양시간내에 이미 도달되어 있다.
상기 작은 기질 베드 용적 8, 이의 내유동성 및 반응성분을 가진 기질의 높은 적하는 신속하게 평형화 시킬 수 있다. 조절된 유동 및 반응성분을 가진 기질의 높은 적하로 정량될 성분이 약 1 분 이내에 즉, 유동하는 액체가 상기 기질 베드 용적을 떠나기 전에 반응 성분에 다량으로 결합되는 결과를 가져온다. 그러므로, 표준 참조를 요하는 비교분석이 필요없다.
이외, 일회용 반응용기 1은 즉시 사용할 수 있기 때문에, 면역적 반응성분을 가진 기질 3은 표준화될 수 있고, 미리 만들어 질 수 있기 때문에 그리고 일회용 반응용기 1은 사용전에 조정될 필요가 없기때문에 신속한 샘플 분석이 가능하다.
일회용 반응용기 1은 HPLC의 적용없이 신속한 샘플분석을 가능하게 하기 때문에 기질 3은 압력에 대하여 안정한 재질일 필요가 없다. 기질 3으로서, 친화성 크로마토그래피에 유용한 모든 통상적인 물질이 사용될 수 있다. 바람직한 기질물질은 고분자성 당류, 플라스틱류, 플라스틱 개질 기질, 금속 산화물류 또는 실리케이트류이다. 프릿형태의 기질물질이 특히 바람직하다. 그러한 기질 물질의 기공에 접근하지 않는 바이러스와 같은 매우 큰 성분을 정량하기 위해서는 활성기를 가지는 분지(side chains) 그라프트 공중합체가 바람직하다. 기질물질 3에 적하된 면역 반응성 성분은 기질물질에 흡수되는 것은 물론 기질과 공유결합적으로 결합할 수 있다. 상기 면역 반응성 성분은 합텐류, 항원류, 항체류 및 면역 친화성 단백질류로 구성되는 군으로 부터 선택될 수 있다. 단일 클론성은 물론 다중 클론성 항체를 사용할 수 있다.
본 발명의 과정에 있어서, 일회용 반응용기 1은 고압에 적용될 필요가 없기 때문에 용기 재료 4는 압력에 견디는 물질일 필요는 없다. 따라서, 금속류와 같은 내압력성 물질외의 유리, 천연물질 및 플라스틱과 같은 비 내압력성 물질이 일회용 반응용기 1을 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직한 플라스틱류는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및/또는 폴리스티렌이고, 바람직한 금속류는 알루미늄 및 스테인레스 스틸이다.
실질적인 용도로써, 일회용 반응용기 1은 일단부에 융기부 5를 가지고 있어서 반응용기를 자동이송용 지지 및 이동장치에 적응되게 한다. 이것은 자동화된 샘플처리장치에 사용하기 위해 필요한 것이다.
이외의 실질적 용도로서, 일회용 반응용기 1은 상기 융기부에 대항되는 단부에서 좁은 직경의 접합부, 바람직하게는 다른 일회용 반응용기와 소켓-스위치 연결을 위한 결합부를 가진다. 이것은 예를들어 수개의 일회용 반응용기 1을 쉽게 직렬 연결하는 바, 첫번째 용기의 출구 6이 두번째 용기의 입구와 쉽고 간단한 암수 결합으로 연결된다.
또한, 일회용 반응용기 1은 캡 7 및 9로 개폐될 수 있다.
상기 일회용 반응용기 1을 사용하는 본 발명의 방법은 통상의 방법에 비하여 매우 간단하고, 신속하게 정량 및 정성 결정을 내릴 수 있기 때문에 우수하다. 이것은 부분적으로는 정량될 성분을 결정하는데 일회용 반응용기 1에서, 이미 사용된 기질의 예비 조정 또는 재생이 필요없기 때문이며, 표준용액을 사용하여 연속적인 참조 측정이 필요없기 때문에 가능하다. 샘플 및 다른 용액을 통상의 실험실 장치 또는 피펫팅 자동장치에 적용할 수 있기 때문에, 본 발명의 용기를 취급하기가 용이하다.
수동조작외에, 본 발명의 반응용기를 적용하면 자동화 처리에 있어서 향상을 가져올 수 있다. 그러한 처리에 있어서, 샘플의 적용 및 처리과정의 추가단계는 자동화된 샘플 처리장치에 의해 실행된다. 그러한 샘플처리장치는 예를들어 발효기에서 생성된 항체의 온라인 제조방법 조절에 사용된다. 그러한 과정에 있어서, 샘플은 약 6 내지 8시간의 간격으로 자동적용되고, 발효배지에서의 항체농도는 일회용 반응용기 1을 사용하여 연속적으로 오랜시간동안 신속하고 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 일회용 반응용기 1을 사용하는 항체 생성 조절용 시스템은 제2도에 개략적으로 묘사되어 있다. 여기서, 일회용 반응용기 1은 상기 자동화된 샘플 처리 장치에 포함된다.
본 발명의 방법은 샘플을 넣은 다음 일회용 반응용기 1에 고압을 가하지 않고 신속하게 실행될 수 있다. 그러나, 낮은 흡인 또는 압력 처리, 예를들어 원심분리 또는 펌핑으로 좀더 빠르게 실행시킬 수 있다.
필요하다면, 본 발명 방법에 있어서, 수개의 일회용 반응용기 1을 직렬로 또는 병렬로 연결될 수 있다. 이렇게 함으로써, 하나의 단일 샘플에서 수개 변수에 대한 동시 결정 또는 수개 샘플의 동시 분석이 가능하다.
수개의 일회용 반응용기의 병렬 연결은 알레르기 시험에 유리하다.
여기서, 상이한 항원(알레르겐)이 각각의 다른 컬럼에 적용된 후, 컬럼을 병렬 연결하고, 알레르기성 반응을 중재하는 IgE급 항체를 포함하는 샘플을 제1반응 용기에 적용시킨다.
샘플은 상이한 알레르겐을 포함하는 상이한 일회용 반응용기 1을 통해 연속적으로 유동한다. 샘플의 IgE는 알레르기 유발 항원을 포함하는 반응용기에서 결합되고, 예를들어 형광 검출을 통해 검출된다. 이러한 방법으로 하나의 단일 샘플은 여러개의 상이한 잠재적 알레르겐으로 동시에 시험될 수 있다.

Claims (26)

  1. 상부 및 하부 단부가 개방되어 있고, 적어도 하나의 면역 반응성 성분이 활성 또는 활성화된 표면을 가지는 기질(3)상에, 컬럼을 통해 유동하는 액체가 기질베드를 빠져나가기 전에 정량될 성분이 상기 반응성 성분에 정량적(결합 평형적)으로 결합되는 그러한 적하농도로, 적하되어 있는 고상 면역분석용 일회용 반응용기(1)에 있어서, 상기 기질베드의 용적이 600μl에 달하고, 상기 기질(3)은 상기 면역 반응성 성분과 함께 표준화되고 일회용 반응용기(1)에 즉시 사용될 수 있도록 이미 만들어져 있으며, 상기 액체의 유동 관통속도가 상기 기질베드에 의하여 적절히 정량되는 고상면역 분석용 일회용 반응용기.
  2. 제1항에 있어서, 기질(3)물질은 고분자성 당류, 플라스틱류, 플라스틱-개질 유기 또는 무기기질류, 다공성 금속류 및 합금류, 산화금속류, 유리류, 실리케이트류 또는 세라믹재료를 포함하는 군으로부터 선택되는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 기질금속은 고체프릿 또는 멤브레인이고 기질의 다공률은 제 1 항의 액체의 유동 관통 속도를 결정하는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  4. 제2항에 있어서, 상기 플라스틱류는 폴리에틸렌, 플로프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 또는 이들의 공중합체류 또는 이들의 공중합체류 또는 셀루로즈의 개질체이고, 상기 금속은 알루미늄이고 또는 상기 산화금속이 산화알루미늄, 이산화티타늄 또는 이산화지르코늄인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  5. 제1항에 있어서, 상기 기질은 상기 면역 반응성 성분에 대한 고농도 활성 결합부를 가지는 표면구조를 가지며, 상기 액체의 유동 관통속도는 입자크기 및 제 1 항에 따른 표면구조사이의 관계에 의해 결정되는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 기질을 그라프트 공중합체(텐타클 폴리머)이고 상기 액체의 유동관통속도는 입자크기 및 제 1 항에 따른 분지(side chains) 길이와의 관계에 의해 결정되는 고상면역 분석용 일회용 반응용기.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 면역 반응성 성분이 상기 기질(3)에 공유결합적으로 또는 흡수되어 결합되는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 면역 반응성 성분은 합텐, 항원, 항체 또는 면역친화성 단백질을 포함하는 군으로부터 선택되는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 항체는 다중 클론성인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 항체는 단일 클론성인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  11. 제 3 항에 있어서, 상기 기질은 0.2μm 내지 100μm의 다공률을 가지는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  12. 제 3 항에 있어서, 상기 기질의 층 두께는 0.1mm 내지 20mm인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  13. 제 6 항에 있어서, 상기 그라프트 공중합체는 10내지 15μm의 입자크기를 가지는 폴리에틸렌 글리콜로 그라프트된 폴리스티렌인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  14. 제1항에 있어서, 상기 용기재료는 플라스틱류, 유리류, 금속류 또는 천연 물질류를 포함하는 군으로부터 선택되는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 플라스틱류는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 또는 폴리스티렌인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  16. 제1항에 있어서, 한 말단부에 용기부(5)를 가져서 반응용기를 자동 이송용지지 및 이동장치에 적합하게 하는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  17. 제1항에 있어서, 융기부(5)와 대항되는 단부에 용기 직경 보다 작은 직경의 결합부(6)을 가지는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  18. 제 17 항에 있어서, 2개 이상의 용기간에 직렬연결을 가능하게 하는 상부 및 하부 단부에 암수 결합요소를 포함하는 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  19. 제1항에 있어서, 상기 기질 베드의 용적(8)은 50μl인 고상 면역 분석용 일회용 반응용기.
  20. 면역반응을 통해 정량될 수 있는 성분의 결정방법에 있어서, 분석된 샘플을 샘플에서 결정될 임의의 성분이 상보적인 면역반응성 성분에 결합되어 있는 제 1 항 내지 19항중 어느 한항의 일회용 반응용기에 적용시키고, 및 상기 정량될 성분을 a)용출 그리고 상기 기질 및 적용된 반응성 성분에 대한 예비조정 및 재생없이 이루어지는 정량을 통하여 b)상기 일회용 반응용기에서 증폭반응으로써 면역표식자로 표시하고, 그리고 후속정량을 통하여, 또는 c)정량될 화합물과의 경쟁 관계에 있는 화합물을 통하여 정량하는 것을 포함하는 방법 .
  21. 제20항에 있어서, 상기 샘플 및 다른 용액을 통상의 실험실 장비 또는 피폐팅 자동장치로 처리하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 자동화된 샘플처리장치가 샘플적용 및 후속 공정단계에 사용되는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 온라인 공정조절시스템에서 자동화된 샘플처리를 특징으로 하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 샘플 적용 후 작은 흡인 또는 압력처리를 일회용 용기에 적용하여 좀더 빠르게 실행하는 방법.
  25. 제20항에 있어서, 수개의 일회용 용기를 직렬 또는 병렬로 배열하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 정량될 성분은 알레르겐인 방법.
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