DD268161A1

DD268161A1 - Verfahren zur herstellung von bakteriellen antigenen

Info

Publication number: DD268161A1
Application number: DD30958787A
Authority: DD
Inventors: Hartmur Stompe; Marianne Drescher; Sonja Mebel; Siglinde Rustenbach
Original assignee: Staatliches Inst Fuer Immunpra
Priority date: 1987-11-27
Filing date: 1987-11-27
Publication date: 1989-05-24

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antigenen des Genus Bordetella. Ausgangspunkt ist ein Rohextrakt, hergestellt durch Konzentrierung und Ueberfuehrung der Antigene in eine loesliche Phase. Erfindungsgemaess werden die Antigene durch Affinitaetschromatographie an einem Saeulenmaterial, das aus einem unloeslichen polymeren Traeger besteht, an dem Lektine gebunden sind, die geeignete Eigenschaften aufweisen, in hochreiner Form gewonnen, zum Beispiel das filamentoese Haemagglutinin (FHA) und der leukocytosestimulierende Faktor (LPF) von B. pertussis. Diese hochgereinigten Antigene werden gegebenenfalls nachfolgend in der Human- und Veterinaermedizin sowie in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt und zur Impfstoffherstellung verwendet.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von protektiven, bakteriellen Antigenen in hochreiner Form. Anwendungsgebiete sind die pharmazeutische Industrie, die Human- und die Veterinärmedizin.

Charakteristik des bekennen Standes der Technik

Es ist bekannt, daß für die Prophylaxe verschiedener bakterieller Infektionen bei Menschen und Tieren engewandt werden, die abgeschwächte oder getötete Bakterien enthalten.

Der Nachteil dieser Vakzine besteht darin, daß sie Nebenwirkungen zeigen, wie z. B. lokale Schmerzen und Entzündungen an der Impfstelle, aber auch Fieber. In seltenen Fällen, wie z. B. beim herkömmlichen Pertussisimpfstoff beobachtet wurde, kann eine Vakzinierung zu neurologischen Komplikationen und sogar zum Tode des Impflings führen (Bernier et al., J. Pediatrics, 101 (1982), 419-421).

Die Nebenwirkungen dieser Vakzine werden durch kontaminierende Bestandteile sowie durch Substanzen des Keuchhustenbakieriums, die nicht mit der Schutzwirkung verbunden sind, hervorgerufen.

In den letzten Jahren wird an der Herstellung von Spaltvakzinen gearbeitet, die die für die Immunisierung notwendigen Teiikomponenten in angereicherter Form enthalten.

Bei der Entwicklung einer azellulären Vakzine gegen Keuchhusten konnten in den letzten Jahren gute Erfolge ouielt werden.

So wurde von verschiedenen Autoren gezeigt, daß das filamentöse Hämagglutinin (FHA) und der leukocytosestimulierende Faktor (LPF) eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese nach Infektion mit Bordetella pertussis spielen. Ein guter Schutz gegen Infektionen mit B. pertussis wurde nach Immunisierung mit diesen beiden Antigenen erreicht (Y. Sato et al., Inf. and Immunity, 31 [1981), 1223-1231; R.D.Sakura et al., J.Biol.Chem.,258 [1983], 14647-14651).

1981 wurde eine äio'luiäre Vakzine gegen Keuchhusten in Japan eingeführt, die gegenüber der herkömmlichen Vollkeimvakzine bedeutende Vorteile aufweist (T. Aoyma et al., J. of Pediatrics, 107, (1985), 180-183; G. R. Noble et al., JAMA, 257 [1987], 1351-1356). Die Vorteile liegen in einer weitaus geringeren Reaktogenität des Impfstoffes gegenüber der Voilkeimvakzine verbunden mit einem gleichen oder höheren Antikörperspiegel im Serum als nach Erkrankung.

Für die Herstellung der azellulären Pertussis-Vakzine geht man gewöhnlich von einem Rohextrakt aus, der entweder durch Ultraschallaufschluß, Lysozymbehandlung oder durch eine Extraktion der Oberflächenproteine der Keuchhustenbakterien gewonnon wird.

Aus dem Kulturüberstand können FHA und LPFgrößtenteils entweder mit Ammoniumsulfat ausgefällt werden, oder es wird eine Gesamtsäurefällung der die Bakterien enthaltenden Kulturflüssigkeit mit anschließender Extraktion durchgeführt. Die so präparierten Antigene werden dialysiert und durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt (GB-Patent 2083358, SU-Patent 1297712). Diese Methode führt aber nur zu einer Anreicherung und geringen Reinigung von FHA und LPF. Außerdem können die Antigene nicht getrennt dargestellt werden.

FHA und LPF werden ebenfalls mittels Flüssigkeitschromatographieverfahren gereinigt. Diese Methoden stellen Kombinationen der Anwendung von unterschiedlichen Säulenmaterialien dar, wie z. B. Hydroxylapatit, vernetzte Polysaccharid-Schwefelsäure-Ester, Sephadex G 150, Sepharose 6B, an Sepharose 4B gekoppelte spezifische Antikörper sowie an Sepharose gebundenes Haptoglobin, Fetuin oder Ceruloplasmin. So enthalten die drei zuletzt genannten Liganden Sialinsäui e. welche spezifisch nur LPF bindet (EPÜ-Patent 0140386, P. Askelöf et al., Inf. Immun., 36 [1982], 958-961; US-Patent 4.247.4S2). Solche Verfahren sind kompliziert und zeitlich äußerst aufwendig und deshalb für eine großtechnische Nutzung nur bedingt einsetzbar. Außerdem werden Säulenmaterialien, wie z. B. Hydroxylapatit, Gelfiltrationsmedien, bedingt durch ihre Kapazität in großen Mengen benötiget, was wiederum die (iroßtechnische Nutzung verteuert (EPÜ 159003, EPÜ 0162639, EPÜ 170162, JP-Patent 59-110626,

JP-Patent 58-59925, JP-Patent 60-226822, JP-Patent 60-218326, JP-Patent 60-237027, JP-Patent 61-53224, JP-Patent 61-76422).

Der (Einsatz von Concavalin A-Sepharose (Pharmacia, Schweden) und Lentil-Sepharose (Pharmacia, Schweden) als Teilschritt einer Reinigung von LPF wurde beschrieben (M.Yajima et al., J. Bioch., 8; [1978], 295-303; A.A. Gurejewa et al., Sh.Mikrob.Epid.iImmun., 7 [1986], 32-37; JP-Fatent 59-206316; SU-Patent 1012786). Jedoch können diese Lektine, bedingt durch ihre Eigenschaften, auch Saccharide, Glycolipide, Glycoproteine und andere Zellbestandteile des Keuchhustenbakteriums adsorbieren, was zu Schwierigkeiten bei der Reindarstellung führt. Außerdem steigt die spezifische Aktivität der die Antigene enthaltenden Proteinfraktion nach Reinigung über solche „Lektin-Säulen" nur sehr gering an, was zeigt, daß weitere Reinigungsschritte erforderlich sind. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß nur LPF mit ,Lektin-Säulen" gewonnen wurde.

Auf Grund der Eigenschaften dieser Lektine sind die die Antigene enthaltenden Proteinfraktionen mit Lipopolysacchariden verunreinigt, so daß ein unmittelbarer Einsatz als pharmazeutisches Präparat nicht möglich ist.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die Bekämpfung von Krankheiten, hervorgerufen durch Bakterien des Genus Bordetella.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, protektive Antigene des Genus Bordetella mittels eines kostengünstigen, großtechnisch anwendbaren Verfahrens hochrein darzustellen und die gereinigten Antigene als wesentlich wirksamer Anteil in pharmazeutischen Präparaten sowie in Impfstoffen zu verwenden.

Es wurde gefunden, daß dies durch ein Verfahren zur Herstellung bakterieller Antigene von B. pertussis, wobei ein Antigen enthaltender Rohextrakt von B. pertussis einer Affinitätschromatologie unterzogen wird, erreicht werden kann. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß geeignete Lektine, die eine Bindung mit mindestens zwei Antigenen eingehen, an einen Träger gekoppelt werden, anschließend der die Antigene enthaltende Rohextrakt mit dem Säulenmaterial in Kontakt gebracht wird und die Antigene danach eluiert und aufgetrennt werden. Bei diesem Verfahren wird eine hohe Reinheit der bakteriellen, protektiven Antigene (FHA und LPF) erreicht, die sonst nur in Kombination verschiedener Chromatographieverfahren erzielt werden kann, die zeitlich und ökonomisch aufwendiger sind.

Die für die Reinigung von LPF eingesetzten und beschriebenen Lektine (Concavalin A und das Lektin aus Lens culinaris) führen nur in Verbindung mit anderen chromatographischen Verfahren zu einer hohen Reinheit dieses Antigens. FHA wurde mit dieser Methode nicht gereinigt. Im Gegensatz dazu ermöglicht das in diesem Patent beschriebene Verfahren, gleichzeitig zwei wesentliche Antigene (FHA und LPF) von B. pertussis aus einem Rohextrakt mittels eines Chromatographieschrittes zu reinigen und zu trennen. Das im dargelegten Verfahren zum Einsatz kommende Säulenmaterial hat eine hohe Kapazität, so daß für die Reinigung großer Mengen eines Rohextraktes nur relativ kleine Säulenvolumina erforderlich sind. Außerdem kann das Säulen..iaterial mehrmals regeneriert und wieder benutzt werden, ohne daß sich die Trenneigenschaften verschlechtern, was sich zusätzlich kostengünstig auswirkt. Das erfindungsgemäß angewandte Lektin ist ein Glykoprotein, welches Mannose, Galaktose, Glukose und N-Acetyl-Glukosamin als Kohlenhydratkomponente enthält. Es besitzt die Eigenschaft, sich spezifisch an Galaktose, N-Acetylgalaktosamin und deren Derivate zu binden. Solch ein Lektin kann z. B. aus Viscum album (Mistellektin) isoliert werden.

Als unlösliche, polymere Träger, an die Lektine mit geeigneten Eigenschaften als Liganden gekoppelt werden, können vorzugsweise Agarose-Geie, Diethylarninoethyl-Cellulose, vernetzte Dextrane, Polyacrylamid-Gele, polymerisiertes Maleinanhydrid oder poröses Glas angewandt ,verden.

Die Affinitätschromatograpnie wird entweder mittels einer Säule oder nach einem »batch-Verfahren* durchgeführt. Die Durchflußgeschwindigkeit des aufzutragenden Rohextraktes bzw. des Eluenten beträgt beim Säulenverfahren bevorzugt

10-500ml/cm'h. Für beida Verfahren gilt, daß der Waschpuffer einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 hat und eine Konzentration vonweniger als 1 mol/l aufweist. Die an das Säulenmaterial gebundenen Antigene können in Abhängigkeit der

Eluierungsbedingungen entweder gleichzeitig oder getrennt abeluiort werden. So werden FHA und LPF z. B. bei einer Salzkonzentration von 3 M KSCN gleichzeitig von der spezifischen „Lektinsäule" abeluiert, wohingegen mit 0,211 N-Acetyl- Glukosamin LPF desorbiert wird und anschließender Elution mit 3 M KSCN FHA gowaschen wird. Gleiches gilt für die Anwendung des „batch-Verfahrens". Der zum Einsatz kommende Eluent besitzt entweder hydrophile und/oder hydrophobe Eigenschaften und enthält vorzugsweise Salze, Alkohol, Zucker oder Glycerin. Sein pH-Wert liegt zwischen 2,0 und 10,0. Die nach dem beschriebenen Verfahren gewonnenen Antigene zeigen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Leammli die für sie charakteristischen Proteinbanden und eine sehr hohe Reinheit (U. K. Leammli, Nature, 227 (1970), 680-685). Sie sind nahezu frei von Endotoxinen (Lipc polysacchariden), so daß, im Gegensatz zu den meisten bereits beschriebenen Verfahren, keine zusätzlichen Reinigungsschritte erforderlich sind (JP-Patent 58-13519, Stinson, R. S„ J. Biol. Stand., 14 (1986), Die präparierten Antigene erfüllen somit alle Anforderungen, um nach Detoxifizierung und Anlagerung an einen Minsralträger

und gegebenenfalls nach dem Hinzufügen von Antigenen anderer Spezies als Impfstoff eingesetzt zu werden, der eine hohe

Immunogenität und geringe Toxizität hat und weniger Impfkomplikationen als eine Vollkeimvakzine hervorruft. Die aufgereinigten Antigene besitzen außerdem die entsprechende Qualität, um nach Anlagerung an einem polymeren Träger

für die Diagnostik, z. B. mittels ELISA, eingesetzt zu werden.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel erläutert werden. Ausführungsbeispiel

Zu 4Ol einer Pertussis-Keimsuspension wird soviel konzentrierte HCI zugegeben, daß der pH-Wert 3,8-4,0 beträgt. Diese Suspension bleibt über Nacht bei 4°C stehen. Danach wird der Überstand abgesaugt und verworfen. Die verbleibende Suspension wird zentrifugiert und das nach der Zentrifugation erhaltene Sediment wird in 200 ml Puffer A (50 mM Tris-HCI pH 9,55; 1M Na Cl; SmM EDTA) resuspendiert und 24h zwecks Antigenextraktion gerührt. Anschließend wird die Extraktion mit 100ml Puffer A wiederholt. Die vereinigten Überstände werden mit 30% Ammoniumsulfat über Nacht bei 4°C gefällt, anschließend 0,5h bei 4000g zentrifugiert und das erhaltene Ammoniumsulfatsediment in 50ml Puffer A gelöst. Anschließend wird 3 χ gegen ein zehnfaches Volumen Pu)'er B 5OmM Tris-HCI pH 8,1; 0,5M NaCI) dialysiert und durch ' Ultrafiltration wird die Antigen enthaltende Probe konzentriert.

Dieser die protektiven Antigene enthaltende, dialysierte Rohextrakt wird 1:100 mit einem 5OmM Natriumphosphatpuffer pH = 7,0 verdünnt und auf eine Sepharose-5 B-Säule, an die das Mistellektin gekoppelt wurde, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 10ml/cm²/h aufgetragen. Die Säule wird anschließend mit einem 10OmM Natriumphoephatpuffer pH = 7,9, der 0,5M NaCI enthält, so lange gewaschen, bis das Eluat keine Extinktion bei einer Wellenlänge von 280nm mehr zeigt. Nach diesem Waschschritt können die Antigene LPF und FHA mit einem 10OmM Natri'imphosphatpuffar pH = 7,9, der 0,5M NaCI und 3M KSCN enthält, gemeinsam mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/cm²/h von der Säule gewaschen werden. (Abb. 1)

Die gesammelten Proteinfraktionen werden gegen Puffer 1 dialysiert (Puffer 1:50mM Tris-HCI pH = 8,0; 0,5M NaCI) und anschließend konzentriert, z. B. mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon, Niederlande). Die so gewonnenen Antigene zeigen in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese die für sie typischen Proteinbanden. Im Vergleich mit der durch Saccharose-Dichtezentrifugation gewonnenen Antigenpräparationen zeigen die nach Chromatographie über eine Mistellektin-Sepharose-4 B-Säule gewonnenen Antigene eine höhere Reinheit. (Abb. 2)

Eine getrennte Darstellung von FHA und LPF kann erreicht werden, wenn zuerst LPF mit 0,2 M N-Acetyl-Glukosamin desorbiert wird und anschließend FHA mit 3M KSCN abgewaschen wird.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung protektiver Antigene des Genus Bordetella, dadurch gekennzeichnet, daß Lektine, die eine Bindung mit mindestens zwei Antigenen eingehen, an einen Träger gekoppelt werden, ein Antigen enthaltender Rohextrakt mit diesem Säulenmaterial in Kontakt gebracht wird, die Antigene anschließend eluiert und aufgetrennt werden und gegebenenfalls nachfolgend eine Weiterverarbeitung zum pharmazeutischen Präparat erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Lektine vorzugsweise Mannose, Galaktose, Glukose und N-Acetyl-Glykosamin als Kohlenhydratkomponente enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Lektin aus Viscum album (Mistellektin) zur Herstellung von FHA und LPF aus einem Stamm von S. pertussis zum Einsatz kommt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger vorzugsweise ein Agarose-GeI, eine Diethylaminoethyl-Cellulose, ein vernetztes Dextran, ein Polyacrylamid-Gel, ein polymerisiertes Moleinanhydrid oder poröses Glas verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätschromatographie mittels einer Säule durchgeführt wird, die Durchflußgeschwindigkeit des aufzutragenden Rohextraktes bzw. des Eluenten 10-500 ml/cm²h beträgt, der Waschpuffer einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 hat und eine Konzentration von weniger als 1 mol/l aufweist.

6. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätschromatographie nach einem „batch-Verfahren" durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rohextrakt, gewonnen aus einem Stamm des Genus Bordetella, mit dem Affinitätschromatographie-Gel verrührt wird, dieses mit einem Puffer gewaschen wird, der einen pH-Wert von 5,0 bis 11,0 hat und eine Konzentration von kleiner als 1 mol/l aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein getrenntes oder gleichzeitiges Abeluieren der Antigene erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Eluent hydrophile und/oder hydrophobe Eigenschaften besitzt und vorzugsweise Salze, Alkohol, Zucker, Glycerin u. ä. enthält und sein pH-Wert zwischen 2,0 und 10,0 liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterverarbeitung der Antigenpräparation für diagnostische Zwecke, z. B. ELISA, durch Anlagerung an einen polymeren Träger erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Weiterverarbeitung zum Impfstoff nach Detoxifizierung und Anläget unf en einen Mineralträger, gegebenenfalls unter Hinzufügen von Antigenen anderer Spezies, erfolp'.