DE19528847C2 - Affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern gemäß Anspruch 1.

Für den Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern auf Zellen verwendet man häufig Agglutinationsreaktionen, wobei die agglutinierten und nicht-agglutinierten Zellen optisch beurteilt werden. Konventionelle Techniken sind Reaktionen auf Platten oder in Röhrchen (Röhrchen-Zentrifugationstest) bzw. in Mikrotiterplatten. Mit modernen Methoden können agglutinierte bzw. nicht-agglutinierte Zellen über eine Filtration in mit Gelen oder Glaskügelchen gefüllten Mikrogefäßen aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe physikalisch voneinander getrennt werden. Eine scharfe Trennung der Zellen findet allerdings oft nicht statt, so daß insbesondere bei schwachen Reaktionen Auswertungs-Unsicherheiten entstehen. Darüber­ hinaus werden die Agglutinate durch Erschütterungen leicht zerstört, was - ebenso wie auftretende Prozonenphänomene - zu falschen Testergebnissen führen kann.

Eine andere Methode - die sogenannte Festphasen-Methode - nutzt die unter­ schiedlichen Immun-Reaktionsfähigkeiten von Antigenen und Antikörpern. Die zu untersuchenden Zellen (z. B. Erythrozyten oder Thrombozyten) werden mit für die nachzuweisenden Antigene spezifischen Antikörpern (z. B. Immunglobulinen) be­ laden und in einem Reaktionsgefäß mit einer immunoreaktiven festen Phase in Kontakt gebracht. Anschließend lassen sich die unbeladenen Zellen mit einer isotonen Kochsalzlösung oder mit geeigneten Puffern im Durchflußverfahren oder unter Sedimentationsbedingungen, z. B. durch Zentrifugation, von der festen Phase trennen, was zur Ausbildung von farbigen Ablagerungen auf dem Gefäß­ boden führt. Zellen, die das gesuchte Antigen aufweisen, bleiben als farbige Schicht auf der Festphase zurück.

In DE 42 08 732 C2 ist die Verwendung eines Einwegreaktionsgefäßes beschrieben, das eine rasche Durchführung der quantitativen Bestimmung von Komponenten erlaubt, die über Immunreaktionen bestimmbar sind. Dies ist jedoch eindeutig ein affinitätschromatiographisches Durchflußsystem, das keinen Bezug zur Trennung korpuskulärer Blutbestandteile hat. Ohne vorherige Waschschritte käme es beim Durchfluß IgG-beladener Erythrozyten und bei gleichzeitigem Durchfluß von Plasmaproteinen aus einem Inkubationsansatz zu konkurrierenden Reaktionen zwischen beladenen Erythozyten und Immunglobulinen um die Bindungsstellen auf der festen Matrix, was mit starkem Empfindlichkeits-Verlust einhergeht.

Ein aus EP-B1-0 363 510 bekanntes Verfahren zur Suche und Identifizierung von erythrozytären Antikörpern verwendet als Festphase Mikrotiterplatten aus Poly­ styrol, die mit Protein A oder Protein G beschichtet sind. Dadurch ist es möglich, ein polyspezifisches Antihumanglobulin auf der Festphase zu binden, was nicht nur die Empfindlichkeit des Testsystems erhöht, sondern auch den Nachweis von Zellen mit Antikörpern vom IgM-Typ oder mit Komplementfaktoren ermöglicht. Ein ähnliches Verfahren geht aus EP-A1-0 594 506 hervor, welches als Festphase eine poröse Matrix in Form eines Gelmilieus oder aus Microbeads vorsieht. Das Anti-IgG oder eines seiner Fab- oder F(ab)′₂-Fragmente wird ebenfalls mittels einer Schicht aus Protein A oder Protein G an das Gel gebunden. Man verwendet als Matrix beispielsweise Sepharose CL4B-Protein A, Sephadex G200 oder Sepharose 6MB (Handelsbezeichnungen von Pharmacia) oder IPA-300 oder PA-400 (Handelsbezeichnungen von Repligen).

Es ist ferner bekannt, für den Nachweis von Antikörpern oder Antigenen als Fest­ phase Partikel (z. B. Agarose oder Sepharose) einzusetzen, an die über reaktive Gruppen (z. B. Glutaraldehyd) Liganden aus einem spezifischen Protein kovalent gebunden sind. Als Liganden werden wiederum Protein A, Protein G, Protein A/G oder KappaLock^TM vorgeschlagen, welche die für den gewünschten Nachweis notwendigen, korrespondierenden Antikörper bzw. Antigene aufnehmen können.

Allen genannten Verfahren ist gemeinsam, daß zwischen den immunoreaktiven festen Oberflächen und den Antihumanglobulin-Molekülen nur relativ schwache Bindungskräfte wirksam sind. Postuliert werden Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals Kräfte oder elektrostatische Anziehungen. Die schwachen Wechselwirkungen führen dazu, daß sich nach dem Massenwirkungsgesetz ein Gleichgewicht zwischen gebundenen und freien Anti-IgG-Molekülen einstellt, was zu einer Überlappung von Festphasen-Bindungen und Agglutinationsreaktionen antikörperbeladener Zellen führt. Der Empfindlichkeitsverlust der erwünschten Zelladsorption ist enorm. Beispielsweise beträgt die Dissoziation in Gegenwart konkurrierender IgG-Moleküle oder von Seren innerhalb von 30 bis 60 min bei 37°C (den in der Serologie üblichen Inkubationsbedingungen) 75 bis 90%.

Ziel der Erfindung ist es, ein zuverlässiges Verfahren zu schaffen, das eine hohe Nachweisempfindlichkeit aufweist und damit eine hohe Ablesegenauigkeit und -sicherheit, insbesondere bei schwachen Reaktionen, gewährleistet. Die Bildung von freien immunoreaktiven Protein-Liganden im Testserum soll wirksam ver­ mieden werden.

Hauptmerkmale der Erfindung sind im Anspruch 1 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 12. Anspruch 13 bezieht sich auf eine bevorzugte Verwendung.

Gemäß Anspruch 1 betrifft die Erfindung ein affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern in einem einseitig geschlossenen Reaktionsgefäß unter Verwendung einer transparenten Festphase mit daran kovalent über Spacerarms gebundenen immunoreaktiven Proteinen, wobei zuerst die zu untersuchenden Proben mit Zellen, die definierte antigene Merkmale aufweisen, inkubiert werden, dann eine physikalische Trennung unbe­ ladener von beladenen Zellen durchgeführt wird und schließlich beladene Zellen über die immunoreaktiven Proteine an die Festphase gebunden werden. Weil mit einseitig geschlossenen Röhrchen gearbeitet wird, lassen sich unterschiedliche Reaktionspartner auf physikalischem Wege bequem unter Zentrifugation ohne Waschschritte trennen. Zwischen der Festphase und den nachzuweisenden beladenen Zellen entsteht über die kovalent gebundenen immunoreaktiven Proteine eine außerordentlich stabile Bindung, so daß die Sensitivität des Test­ verfahrens außerordentlich hoch ist; unspezifische Effekte werden zuverlässig vermieden. Lediglich die (beladenen bzw. unbeladenen) Erythrozyten können in die immunoreaktive Matrix eindringen und - im positiven Fall - eine Festphasen­ bindung eingehen, wogegen die Immunglobuline sowie andere Plasma- oder Serumbestandteile unter definierten Testbedingungen zurückbleiben. Eine teil­ weise oder völlige Neutralisation der immunoreaktiven Bindungsstellen durch Immunoglobuline kann mithin nicht eintreten.

Anspruch 2 sieht vor, daß die zu untersuchenden Proben mit Testerythrozyten inkubiert werden, was die rasche Durchführung von Serumgegenproben erlaubt. Laut Anspruch 3 können die zu untersuchenden Proben Patientenseren oder -plasmen sein, so daß sich auch serologische Verträglichkeitsproben (Kreuz­ proben) schnell ausführen lassen. Gemäß Anspruch 4 werden Autokontrollen unter Einsatz von Patienten- oder Spendererythrozyten und von Eigenserum oder -plasma durchgeführt.

Die Ausgestaltung von Anspruch 5 besteht darin, daß die Festphase einen Träger aus Agarose, Sepharose, Glaskügelchen und/oder Kunststoffkügelchen aufweist. Auf diese Weise können adsorptiv gebundene Zellen selbst im Inneren des Reak­ tionsgefäßes beobachtet werden, was insbesondere die visuelle Auswertung wesentlich erleichtert. Zudem ist eine maschinelle Bearbeitung der Testreihen problemlos möglich.

Von besonderer Bedeutung ist die in Anspruch 6 angegebene Gestaltung des Verfahrens, wonach die Festphase einen Träger mit zumindest einer reaktiven Gruppe aufweist. Die kovalente Bindung der immunoreaktiven Proteine mit den an dem Träger ansetzenden Spacerarms bildet sich während der Reaktion mit den reaktiven Gruppen. Besondere Vorteile ergeben sich, wenn gemäß Anspruch 7 als Träger NHS-aktivierte Sepharose verwendet wird und zwischen den immunore­ aktiven Proteinen und der Festphase laut Anspruch 8 eine Peptidbindung entsteht. Die Anbindung der Proteine ist äußerst stabil, so daß das Freisetzen von immunoreaktiven Proteinen nahezu vollständig vermieden wird.

Gemäß Anspruch 9 weisen die Spacerarms 5 bis 9 Kohlenstoffatome auf. Sie besitzen dadurch für die Bindung der beladenen Zellen an die Festphase eine optimale Länge und unterbinden zuverlässig sterische Hinderungen. Es wird eine außerordentlich hohe Reaktivität erzielt. Für den Verfahrensschritt der kovalenten Bindung werden nach dem Umsetzen der immunoreaktiven Proteine gemäß Anspruch 10 ungebundene Reaktionspartner mit einer Pufferlösung ausge­ waschen und laut Anspruch 11 nicht umgesetzte reaktive Gruppen blockiert und/oder inaktiviert, so daß eine hohe Spezifität der Festphase erreicht wird.

Um die Festphasenbindung der mit Antikörpern beladenen Zellen an die immu­ noreaktiven Festphasen-Präparationen zu verstärken, werden nach Anspruch 12 hochpolymere Substanzen zugesetzt, beispielsweise Dextran oder Albumin. Diese verhindern das Eindringen überschüssiger Immunglobuline und damit die Neutra­ lisation des Trägermaterials. Günstig ist eine Konzentration im Bereich von 1 bis 15 Vol.-%, vorzugsweise 3 Vol.-%.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden spezielleren Beschreibung.

In einem Reaktionsgefäß wird zunächst NHS-aktivierte Sepharose (Pharmacia Biotech, Schweden) in Gegenwart eines Kopplungspuffers bei pH 8,3 mit einem Serum versetzt, das ein gegen ein bestimmtes, mit Antikörpern beladenes Zell­ antigen gerichtetes Antihumanglobulin, z. B. monoklonales Antihuman-IgG, enthält. Die Umsetzung zwischen der Sepharose und den Liganden, die primäre Aminogruppen enthalten, erfolgt unter Abspaltung von N-Hydroxysuccinimid aus der aktivierten Esterverbindung. Zwischen dem Anti-IgG und den an der Sepha­ rose ansetzenden Spacerarms mit vorzugsweise 5 Kohlenstoffatomen bildet sich eine stabile Peptidbindung. Anschließend werden ungebundene Reaktionspartner in verschiedenen Waschschritten mit geeigneten Pufferlösungen entfernt. Nicht umgesetzte, reaktive Gruppen lassen sich mit Äthanolamin blockieren oder mit Trispuffer inaktivieren, so daß eine hohe Spezifität der Sephadex-Präparation er­ zielt wird. Um das Eindringen überschüssiger Immunglobuline und damit die Neutralisation des Trägermaterials zu verhindern, wird noch eine 3%ige Dextran-Lösung zugesetzt.

Wie die Prüfung auf Agglutination IgG-beladener Erythrozyten (Coombcell E, Biotest AG) im Röhrchen-Zentrifugationstest (RZT) zeigt, enthält eine auf diese Weise hergestellte Sephadex-Suspension in einer low-ionic strength solution (LISS), einer isotonen Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Puffer kein un­ gebundenes Antihuman-IgG mehr, so daß Überlappungen von Festphasen-Bin­ dungen und Agglutinationsreaktionen antikörperbeladener Zellen wirksam vermieden werden. Die Nachweis-Empfindlichkeit übertrifft diejenige herkömm­ licher Verfahren erheblich.

Die Bindung blutgruppenspezifischer Antikörper, z. B. Antikörper des AB0- oder Rh-Systems, des Kell-, Kidd- oder Duffy-Systems u. dgl., an Sepharose ist in gleicher Art und Weise problemlos möglich. Das vollständige Entfernen über­ schüssiger, nicht gebundener Antikörper kann leicht durch Prüfung der Über­ stände oder Eluate mit geeigneten serologischen Agglutinationsmethoden erfol­ gen.

Für Serumgegenproben wird in gleicher Weise Antihuman-IgM an die Sepharose-Präparation gebunden. Dabei werden mit Isoantikörpern vom IgM-Typ beladene Testerythrozyten an die feste Phase gebunden, während unbe­ ladene Erythrozyten sedimentieren. Der Antihuman-IgM-Sepharose-Präparation kann eine inerte, hochmolekulare Substanz, z. B. 3% Dextran, zugesetzt werden.

Für die Durchführung des Verfahrens werden als Reaktionsgefäße einseitig geschlossene Röhrchen verwendet, die einen runden Querschnitt sowie einen trichterförmig erweiterten Hals mit einer nach oben offenen, konisch ausgebildeten Stufe als Inkubationskammer aufweisen. Mehrere Röhrchen sind zweckmäßig in einer Basisplatte parallel zu einer Testeinheit verbunden; sie werden mit einer für die jeweilige Bestimmung präparierten Sephadex-Matrix beschickt.

Beispiele 1. Blutgruppenbestimmungen

In die für die Inkubationen vorgesehenen Abschnitte der mit immunoreaktiven Sephadex-Präparationen gefüllten Testeinheit werden 25 bis 100 µl einer 0,5 bis 1%igen Erythrozytensuspension in NaCl, LISS oder einer geeigneten Puffer­ lösung luftblasenfrei pipettiert. Anschließend wird 1 bis 10 min lang bei 100 bis 2000 g (Erdbeschleunigung) zentrifugiert. Im Fall einer positiven Reaktion ist die spezifische Bindung der Erythrozyten an die vorgelegte Sephadex-Präparation als Rotfärbung deutlich erkennbar. Stimmen hingegen die antigenen Merkmale nicht mit den Spezifitäten der vorgelegten Präparationen überein, sedimentieren die Erythrozyten als negative Reaktion am Boden der Testeinheit.

2. Serumgegenproben

25 bis 100 µl von 0,5 bis 1%igen A₁-, A₂-, B- und 0-Testerythrozyten (Biotestcell A₁, A₂, B, 0; Biotest AG) in NaCl werden mit 25 bis 100 µl Seren oder Plasmen 5 bis 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird 1 bis 10 min lang bei 100 bis 2000 g zentrifugiert. Liegen Isoantikörper vor, werden die Testerythrozyten an die Festphase gebunden.

3. Antikörpersuche und -Identifizierung

25 bis 100 µl von 0,5 bis 1%iger Such- oder Identifizierungszellen in NaCl oder LISS und 25 bis 100 µl Seren oder Plasmen werden in einer mit Antihuman-IgG-Sepha­ rose beschickten Testeinheit 10 bis 30 min lang bei 37°C inkubiert. An­ schließend wird 1 bis 10 min bei 100 bis 2000 g zentrifugiert. Das Vorhandensein von Antikörpern wird durch die Bindung der beladenen Testerythrozyten an die immunoreaktive Matrix in den Teströhrchen angezeigt. Negative Ergebnisse sind an der vollständigen Sedimentation der Erythrozyten erkennbar.

Autokontrollen, bei denen Patienten- oder Spendererythrozyten und das Eigen­ serum oder -plasma eingesetzt werden, sind ebenso wie serologische Verträg­ lichkeitsproben (Kreuzproben) in gleicher Weise durchführbar.

Vergleich der Empfindlichkeiten

Ein Vergleich der Reaktivitäten zwischen antihuman-IgG-beladener Protein A-Sepharose CL-4B und erfindungsgemäß mit Antihuman-IgG gekoppelter Sepha­ rose zeigt, daß die Test-Empfindlichkeit gegenüber dem Stand der Technik wesentlich verbessert ist.

Dazu wurden in AB-Serum verdünnte Antikörper verschiedener Spezifitäten mit einem Erythrozyten-Panel (Biotestcell P3, Biotest AG) inkubiert und deren Nach­ weis parallel geprüft. Die Reaktionsstärken sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Als Beispiele für Blutgruppenbestimmungen wurden die Bestimmungen der Blut­ gruppe A und des Rhesusfaktors D mit erfindungsgemäßen Anti-A- bzw. Anti-D-Prä­ parationen herangezogen. Die Präparationen ergaben, wie die folgende Ta­ belle zeigt eindeutige Festphasen-Reaktionen sowohl im AB0-System als auch bei der Bestimmung des Rhesus-Faktors D.

Die Prüfung der Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Erfassung erythrozytärer Antikörper erfolgte durch Titervergleich mit dem konventionellen LISS-Coombs-Röhrchen-Zentrifugationstest (RZT). Dieser Vergleich wurde mit denselben Verdünnungsstufen in AB-Serum und denselben Testerythrozyten durchgeführt. Als Endtiter wurden die Verdünnungsstufen betrachtet, die mit allen das entsprechende Antigen tragenden Panel-Zellen noch einfach-positive Resul­ tate ergaben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen be­ schränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. Man erkennt, daß für den Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern in einem Reaktionsgefäß immunoreaktive Proteine, z. B. gegen Zellantigene gerichtete Antikörper oder Antihumanglobuline, erfindungsgemäß über Spacerarms kovalent an eine Fest­ phase, z. B. NHS-aktivierte Sepharose, gebunden werden. Ungebundene Reaktionspartner werden nach der Umsetzung mit einer Pufferlösung ausge­ waschen; verbliebene reaktive Gruppen der Festphase werden blockiert bzw. inaktiviert. Die zu untersuchenden Proben, z. B. Zellen zur Antigenbestimmung oder Zellen nach Inkubation mit Seren oder Plasmen zum Antikörpernachweis, werden mit der immunoreaktiven Festphase in Kontakt gebracht. Anschließend werden die beladenen Zellen und unbeladenen Zellen physikalisch voneinander getrennt.

Claims (13)

1. Affinitätschromatographisches Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern in einem einseitig geschlossenen Reaktionsgefäß unter Verwendung einer transparenten Festphase mit daran kovalent über Spacerarms gebundenen immunoreaktiven Proteinen, wobei zuerst die zu untersuchenden Proben mit Zellen, die definierte antigene Merkmale aufweisen, inkubiert werden, dann eine physikalische Trennung unbe­ ladener von beladenen Zellen durchgeführt wird und schließlich beladene Zellen über die immunoreaktiven Proteine an die Festphase gebunden werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Proben mit Testerythrozyten inkubiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchenden Proben Patientenseren oder -plasmen sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Autokontrollen unter Einsatz von Patienten- oder Spendererythrozyten und von Eigenserum oder -plasma durchgeführt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Festphase einen Träger aus Agarose, Sepharose, Glaskügelchen und/oder Kunststoffkügelchen aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Festphase einen Träger mit einer reaktiven Gruppe aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Festphasen-Träger NHS-aktivierte Sepharose ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zwischen den immunoreaktiven Proteinen und dem Festphasen-Träger eine Peptidbindung besteht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Spacerarms 5 bis 9 Kohlenstoffatome aufweisen.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß für den Verfahrensschritt der kovalenten Bindung Reaktionspartner, die nach dem Umsetzen der immunoreaktiven Proteine ungebunden sind, mit einer Pufferlösung ausgewaschen werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß für den Verfahrensschritt der kovalenten Bindung nicht umgesetzte reaktive Gruppen blockiert und/oder inaktiviert werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß hochpolymere Substanzen zugesetzt werden, beispiels­ weise Dextran oder Albumin.

13. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für Blut­ tests, insbesondere zur Blutgruppen- und Rhesusfaktor-Bestimmung.