CN108504638B - 一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存的方法。该方法通过在口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存过程中加入含有多元羟基的化合物，提高色谱分离和膜分离过程中有效抗原的收率，并极大地提高口蹄疫灭活病毒在储存过程中的稳定性，防止病毒的降解和破碎。本发明的方法简单，所用物质为生物相容性好的试剂，效果明显，安全有效，提高了分离纯化的收率，降低了生产成本。此外本发明降低了疫苗对保存的温度条件要求，方便纯化、储存和运输，提高灭活病毒的稳定性，延长疫苗产品的存放时间。

Description

一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法

技术领域

本发明涉及疫苗抗原生产领域，尤其涉及一种提高口蹄疫灭活病毒在分离纯化、储存过程中活性收率的方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起的烈性传染病，其主要感染对象为猪、牛、羊等偶蹄类动物。由于口蹄疫传染性强、传播速度快，给畜牧业带来了巨大的损失。

目前常用的口蹄疫疫苗是基于化学方法灭活的口蹄疫病毒，首先通过摇瓶或悬浮法大规模的培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21细胞)，之后将活的口蹄疫病毒接种到细胞中，再将病毒收获后浓缩、化学试剂灭活，与缓冲液和佐剂混合后制成口蹄疫疫苗。以前采用的疫苗是直接使用细胞培养液上清，存在大量细胞培养液及宿主细胞中的多种杂质及过敏性物质，导致疫苗的安全性差，副反应强。随着科学技术的发展，人们对疫苗的质量要求也越来越高，要求疫苗进行纯化去除或减少这些杂质，同时还要保留有效的抗原结构。

灭活口蹄疫病毒的不稳定性是疫苗生产中面临的巨大挑战之一。口蹄疫灭活病毒抗原主要是沉降系数为146S的完整病毒，尺寸在30nm左右，具有强的免疫原性。然而146S在生产过程和储存过程中容易发生颗粒结构的破坏，裂解成尺寸更小的颗粒12S，尺寸小于10nm，并释放出病毒核酸，而裂解后的12S几乎没有免疫原性。因此，活性抗原完整病毒146S的收率是口蹄疫疫苗生产的关键。

导致灭活口蹄疫病毒收率低，且难以提高的原因主要有下几点：

(1)灭活口蹄疫病毒结构复杂，其稳定方法不能简单套用普通蛋白的方法。

普通蛋白质的相对分子量通常小于200kDa，由一个或几个单体组成。文献和专利中会通过添加表面活性剂、糖类、氨基酸、白蛋白、糖醇等来抑制储存过程中抗体的蛋白质的聚集和失活。然而与普通蛋白质不同，灭活口蹄疫病毒的衣壳蛋白通常由上百个一种或几种病毒的结构蛋白组装而成几十甚至上百纳米的颗粒结构。这些结构蛋白之间主要以非共价键为主，组成的颗粒结构稳定性差，很容易被破坏。此外，灭活口蹄疫病毒除了蛋白质，还含有脂类与核酸。因此这种复杂的组装体相比普通蛋白质更不稳定，且其稳定方法也不能简单的套用蛋白质稳定的方法。

(2)病毒灭活后进一步造成稳定性的降低。

病毒的灭活通常采用化学方法进行。化学灭活剂会通过与病毒的核酸或组成颗粒结构的结构蛋白作用从而起到灭活的目的。经过灭活后的病毒往往发生结构上的变化。此外，病毒灭活后失去了作为生物活性颗粒的自我调节功能。有文献报道，口蹄疫病毒经过灭活后具有更低的热稳定性。保存灭活病毒的难度比活病毒的难度更大，其保存方法对灭活病毒也并不适用。

(3)导致口蹄疫灭活病毒失活的因素复杂。

在口蹄疫灭活病毒的分离纯化及储存过程中，导致灭活口蹄疫病毒失活的因素复杂。在储存过程中，溶液条件、温度是影响口蹄疫灭活病毒的主要因素。根据报道，在温和加热的条件下，或pH低于6.5时，146S会迅速裂解成12S。纯化过程比储存过程更为复杂。比如色谱分离、膜分离等，除了溶液条件、温度的影响，还存在剪切力和固液界面等。蛋白质在固液界面上吸附后的结构变化往往是导致蛋白质低收率的主要原因之一。有文献报道，采用截留分子量高于200kDa的超滤膜进行浓缩时，146S有极大的损失。色谱过程也往往会导致低的收率，一些蛋白质的活性收率甚至不足30％。如何提高普通蛋白质在分离纯化中的活性收率一直是蛋白质分离纯化中的一个难点，因为蛋白质的氨基酸序列和结构不同，其性质具有个性的特点。这意味着造成不同蛋白质的失活的关键因素和原因是不同的，对某一种蛋白质适用的提高收率的方法对另一种蛋白可能并不适用。而口蹄疫灭活病毒这种复杂颗粒具有30nm的颗粒结构，与普通蛋白相比，在固液界面上的吸附作用行为以及对环境因素如剪切力的敏感性也会有明显区别，提高收率的方法有所不同，难度也进一步增加。然而目前还没有关于如何灭活口蹄疫病毒有效抗原在分离纯化过程中收率的方法。此外，在纯化过程中和储存过程中，为了防止146S的破坏，需要保持低温，导致能耗成本的增加。

本发明涉及一种口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存的方法。该方法通过在口蹄疫灭活病毒分离纯化或储存过程中加入含有多元羟基的化合物，提高色谱分离和膜分离过程中有效抗原的收率，并极大提高口蹄疫灭活病毒在储存过程中的稳定性，防止病毒的降解和破碎。本发明的方法简单，所用物质为生物相容性好的试剂，效果明显，安全有效，提高了分离纯化的收率，降低了生产成本。此外本发明降低了疫苗对保存的温度条件要求，方便纯化、储存和运输，提高灭活病毒的稳定性，延长疫苗产品的存放时间。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种口蹄疫灭活病毒抗原分离纯化或储存的方法，其显著提高了活性抗原的收率，降低了成本，并且操作方便，适合大规模生产。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法，所述方法是在纯化或储存过程中加入多元羟基化合物。

本发明的发明人出人意料的发现，多羟基化合物对口蹄疫灭活病毒这种复杂的生物颗粒在分离纯化和储存过程中有显著的保护效果，可大大提高活性抗原的收率。

本发明中，所述多元羟基化合物选自糖类、多元醇或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物，其中典型但非限制性的混合物为：糖类和多元醇，多元醇和聚乙二醇，糖类和聚乙二醇。

优选地，所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖或鼠李糖中的任意一种或至少两种的混合物，其中典型但非限制性的混合物为：蔗糖和葡萄糖，海藻糖和乳糖，葡萄糖和鼠李糖，蔗糖和乳糖。

优选地，所述多元醇选自甘油、山梨醇、甘露醇或肌醇中的任意一种或至少两种的混合物，其中典型但非限制性的混合物为：甘油和山梨醇、甘露醇和肌醇，甘油和肌醇。

优选地，所述聚乙二醇选自分子量为400～20000Da的聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物，例如分子量为400Da、500Da、600Da、800Da、1000Da、1250Da、1530Da、5200Da、6510Da、7800Da、12000Da、15220Da、18000Da或20000Da的聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物。

根据本发明，所述多元羟基化合物加入后，多元羟基化合物所占的质量/体积浓度为1％～50％，例如1％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％、32％、35％、40％、45％、48％或50％，优选10％～30％。

本发明中，所述“质量/体积浓度”是指所述多元羟基化合物加入口蹄疫灭活病毒抗原溶液中，多元羟基化合物的质量占该溶液体积的比例，或者是所述多元羟基化合物加入至原料液、淋洗液或洗脱液的任意一种或至少两种的组合中时，其质量占上述溶液体积的比例，其单位可以是g/mL。

优选地，所述糖类加入后的质量/体积浓度为5％～30％，例如5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％或30％，优选10％～20％。

优选地，所述多元醇加入后的质量/体积浓度为5％～30％，例如5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％或30％，优选10％～20％。

优选地，所述聚乙二醇加入后的质量/体积浓度为1％～10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，优选1％～5％。

根据本发明，所述纯化的操作温度为4℃～37℃，例如4℃、7℃、10℃、13℃、15℃、18℃、21℃、25℃、30℃、32℃、35℃或37℃，优选4℃～25℃。

根据本发明，所述纯化的方法为色谱或膜分离。

优选地，所述色谱选自离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱或凝胶过滤色谱中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，在色谱分离时，所述多元羟基化合物加入至原料液、淋洗液或洗脱液的任意一种或至少两种的组合中，再进行色谱分离。

根据本发明，所述膜分离的截留分子量为5～300kDa，例如5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、35kDa、70kDa、100kDa、150kDa、210kDa、250kDa或300kDa。

优选地，在膜分离时，所述多元羟基化合物加入至原料液中，再进行膜分离操作。

根据本发明，所述储存过程中的温度为-80℃～45℃，例如-80℃、-70℃、-65℃、-52℃、-21℃、-1℃、4℃、5℃、10℃、15℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、42℃、44℃或45℃，优选4℃～45℃，进一步优选25℃～45℃。

优选地，在所述口蹄疫灭活病毒抗原储存过程中，将所述多元羟基化合物加入至抗原溶液中进行储存。

与现有技术方案相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明通过在口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存过程中加入多元羟基化合物，其对口蹄疫灭活病毒这种复杂的生物颗粒在分离纯化和储存过程中有显著保护效果，提高活性抗原的收率；

(2)本发明可以在常温下进行纯化、储存和运输，解决了这些过程中需要在低温下进行，成本过高的问题；

(3)本发明的配制简单，使用方便，适合应用于口蹄疫病毒抗原的大规模生产过程中；

(4)本发明通过添加多元羟基化合物，其在色谱和膜分离过程中都对口蹄疫灭活病毒具有保护作用，从而提高了其收率并降低了成本。

附图说明

图1为实施例2中，口蹄疫灭活病毒抗原146S在45℃下储存30min后采用尺寸排阻高效液相色谱法测定的结果。

图2为实施例2中，不同种类的物质对口蹄疫灭活病毒抗原45℃下储存过程中的保护作用。

图3为实施例4中，添加0，10％，20％(w/v)蔗糖的洗脱峰的尺寸排阻高效液相色谱图。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下：

实施例1口蹄疫灭活病毒含量的测定

口蹄疫灭活病毒含量采用尺寸排阻高效液相色谱法测定。

(1)将色谱柱TSK G4000SWXL连接在高效液相色谱仪上，打开高效液相色谱仪的泵送系统和紫外检测系统。以流动相：含0.1M硫酸钠的磷酸缓冲液(pH7.2)在流速0.6mL/min下平衡色谱柱。进样条件：进样量100μL，检测波长259nm，检测时间30min。

(2)将50μg/mL 146S抗原纯品用20mM磷酸缓冲液(pH7.0～7.5)分别稀释1、2、4、10、30、150、250倍，采用步骤(1)中的操作条件进行检测，146S在13.4min左右有唯一的吸收峰。采用高效液相色谱系统自带的软件对该吸收峰在259nm的峰面积进行积分，并建立146S的浓度与峰面积的线性关系，得到如下结果：

C＝0.0323PA+0.4551

其中C为146S的浓度，单位为μg/mL，PA为吸收峰的峰面积，单位为mAU*s。

(3)将待测样品通过系统向尺寸排阻高效液相色谱柱进样，采用如步骤(1)所述的洗脱液和紫外波长检测，对抗原在13.4min的吸收峰的259nm吸收进行积分得到峰面积，根据步骤(2)中建立的146S浓度与峰面积的线性回归方程，算得待测样品中146S的浓度。

实施例2储存方法提高口蹄疫灭活病毒在储存过程中的耐热性

取含O型口蹄疫病毒抗原浓度为50μg/mL的原液，加入不同的物质及不同的浓度，于45℃下储存30min后测定剩余的抗原含量，计算剩余抗原含量的百分数，与不添加任何物质的抗原的剩余含量进行比较，结果如表1所示。

表1口蹄疫病毒抗原在45℃储存30min后的剩余抗原含量

在45℃储存过程中，146S逐渐发生裂解，在尺寸排阻高效液相色谱检测上，由原有的仅有一个吸收峰，变为3个吸收峰：13.4min的146S吸收峰，17min左右裂解产生的12S吸收峰，以及17min以后才出现的病毒裂解释放出的RNA的吸收峰(图1)。由于12S基本无免疫原性，因此灭活口蹄疫病毒的活性收率只计算13.4min的146S的收率。

由表1的结果可知，在众多一般被作为普通蛋白质保护剂的物质中，具有多元羟基的化合物如糖类、糖醇、甘油等对146S的裂解有抑制作用，而像氨基酸类、表面活性剂类和白蛋白类等并无保护作用，甚至还有促进裂解的作用。

进一步对几种能提高储存收率的物质的作用进行了45℃下的储存实验，具体操作如下：取含O型口蹄疫病毒抗原浓度为50μg/mL的原液，分别加入20％(w/v)蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘油、海藻糖，以及不添加任何物质，于45℃下储存0～24h，检测在储存期间的146S收率变化，结果见图2。由图2可知，添加20％(w/v)蔗糖、葡萄糖、山梨醇、甘油、海藻糖后与不添加这些物质的原料相比，大幅度地提高了口蹄疫病毒抗原对温度的耐受性，从原本45℃放置3h收率不足10％，提高到放置24h后仍有90％以上的收率。

实施例3口蹄疫病毒抗原超滤浓缩

取500mL口蹄疫病毒细胞培养液样品，加入不同浓度(w/v，％)及种类的物质溶解混匀后，采用截留分子量5～300kDa，PES膜(Sartorius)的板式膜包进行全循环式超滤。超滤时膜流速为100cm/s，压力控制在0.3MPa以下。将上清液浓缩至50mL左右。操作温度为25℃。

根据如下公式计算灭活口蹄疫病毒的收率：

抗原收率＝(C_前×V_前)/(C_后×V_后)×100％

其中，C_前、C_后分别为膜分离前后的146S浓度，V_前、V_后分别为膜分离前后样品的体积。

具体加入的物质及浓度，以及经过膜分离后的146S抗原收率如下表2所示。

表2

添加剂及浓度(w/v)	膜分离的截留分子量(kDa)	抗原收率(％)
			空白对照(不添加任何物质)	5	82.3
5％甘露醇	5	90.7
			0.1％牛血清白蛋白	5	83.5
空白对照(不添加任何物质)	100	73.6
			10％蔗糖	100	87.3
0.1％吐温20	100	78.2
			空白对照(不添加任何物质)	300	60.6
10％PEG 400+5％蔗糖	300	89.8
			1％PEG 20000	300	90.2

实施例4口蹄疫病毒抗原离子交换色谱纯化

取300mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为1.2g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.8μg/mL。

使用截留分子量为50kDa的板式超滤膜(Sartorius)将细胞上清液一次浓缩到20mL左右，少量多次加入80mL 20mM pH7.0磷酸钠缓冲液稀释，继续浓缩至30mL左右至电导率约5.0mS/cm；超滤时膜流速为10cm/s，压力控制在0.3MPa以下。口蹄疫病毒抗原终浓度为20μg/mL左右。

不添加保护剂的离子交换色谱分离：取10mL浓缩后的上清液进料到预先用氯化钠调至电导7mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH8.0)平衡的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱(GEHealthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，用氯化钠调至电导为50mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH8.0)进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原的紫外吸收峰的洗脱液。

离子交换色谱分离操作如下。

配制色谱分离的平衡液：用氯化钠调至电导7mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH8.0)中分别加入不同浓度的多元羟基化合物；洗脱液：用氯化钠调至电导为50mS/cm的磷酸钠缓冲液(pH8.0)加入与平衡液中相同浓度和种类的多元羟基化合物。将10mL浓缩后的上清液中加入与平衡液和洗脱液相同浓度和种类的多元羟基化合物，溶解后进料到预先用平衡缓冲液平衡的DEAE Sepharose FF离子交换层析柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，用洗脱液进行洗脱，收集吸收峰。层析介质采用0.5M氢氧化钠溶液再生。整个过程操作温度在27℃。

根据如下公式计算灭活口蹄疫病毒的收率：

抗原收率＝(C_前×V_前)/(C_后×V_后)×100％

其中，C_前、C_后分别为色谱分离前后的146S浓度，V_前、V_后分别为色谱分离前上样的样品的体积和洗脱后收集的样品体积。

具体加入的物质及浓度，以及经过离子交换色谱后的抗原收率如下表3所示。

表3

添加剂及浓度(w/v)	抗原收率(％)
		空白对照(不添加任何物质)	56.2
10％蔗糖	72.1
		20％蔗糖	84.0
10％PEG 400+5％蔗糖	89.8
		3％PEG 10000+5％甘油	80.1
0.1％吐温20	40.4
		0.05M精氨酸	27.3

根据离子交换色谱的结果，蔗糖、聚乙二醇、甘油这类多元羟基化合物对146S的收率有显著提高的效果，而表面活性剂和氨基酸没有提高活性抗原收率的效果。

对色谱分离所得的146S洗脱峰进行分析，多羟基化合物对活性抗原收率的提高主要是通过减少了146S在离子交换色谱过程中与色谱填料作用后发生的裂解来实现的。以蔗糖为例，对比添加0，10％，20％(w/v)蔗糖的洗脱峰的尺寸排阻高效液相色谱图结果(图3)，发现分别为146S和12S的吸收峰呈现的规律为：添加蔗糖的含量越高，146S所占的比例越高，12S越少，这也就是意味着发生裂解的146S越少，从而有更高的收率。

实施例5口蹄疫灭活病毒抗原疏水色谱分离

取100mL含口蹄疫病毒的细胞培养液上清，总蛋白浓度为0.47g/L，口蹄疫病毒抗原浓度为2.1μg/mL。

不添加多元羟基化合物的疏水色谱分离：配制色谱分离的A液：0.8M硫酸铵的磷酸钠缓冲液(pH7.2)；B液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)。将100mL细胞培养上清液加入到预先用A液平衡的Butyl Sepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别0～100％B液进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原的紫外吸收峰的洗脱液。

添加多元羟基化合物的疏水色谱分离：配制色谱分离的A液：0.8M硫酸铵的磷酸钠缓冲液(pH7.2)中加入1％PEG 20000或5％蔗糖；B液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中加入1％PEG 20000或5％蔗糖。在上清液中加入1％PEG20000，溶解后进料到预先用A液平衡的ButylSepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别0～100％B液进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原的紫外吸收峰的洗脱液。

添加表面活性剂的疏水色谱分离：配制色谱分离的A液：0.8M硫酸铵的磷酸钠缓冲液(pH7.2)中加入0.1％吐温80；B液：20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中加入0.1％吐温80。在上清液中加入0.1％吐温80，溶解后进料到预先用A液平衡的Butyl Sepharose 4FF疏水色谱柱(GE Healthcare，5cm×1.6cm I.D.)，进料后经继续淋洗后，分别0～100％B液进行梯度洗脱，收集含口蹄疫病毒抗原的紫外吸收峰的洗脱液。

根据如下公式计算灭活口蹄疫病毒的收率：

抗原收率＝(C_前×V_前)/(C_后×V_后)×100％

其中，C_前、C_后分别为色谱分离前后的146S浓度，V_前、V_后分别为色谱分离前上样的样品的体积和洗脱后收集的样品体积。

根据如下公式计算灭活口蹄疫病毒的纯化倍数：

纯化倍数＝(P_前×V_前)/(P_后×V_后)×100％

其中，P_前、P_后分别为色谱分离前后总蛋白的浓度，V_前、V_后分别为色谱分离前上样的样品的体积和洗脱后收集的样品体积。

实验结果：分别检测洗脱峰组分的抗原浓度及总蛋白浓度，最后得到不添加多元羟基化合物的疏水色谱分离过程病毒抗原的收率为87％，纯化倍数为6.8；通过在疏水色谱中添加1％PEG 20000，收率提高为97.3％，纯化倍数提高为7.8；添加5％蔗糖，收率提高为96.0％，纯化倍数为7.2；添加0.1％吐温80的收率为78.5％，纯化倍数为6.9。因此添加多元羟基化合物具有提高疏水色谱中灭活口蹄疫病毒抗原收率的效果，而其它物质如表面活性剂没有明显作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (7)

1.一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化的方法，其特征在于，在纯化过程中加入多元羟基化合物，且不含有表面活性剂；

所述多元羟基化合物选自糖类、多元醇或聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物；

所述糖类选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、乳糖或鼠李糖中的任意一种或至少两种的混合物；

所述多元醇选自甘油、山梨醇、甘露醇或肌醇中的任意一种或至少两种的混合物；

所述聚乙二醇选自分子量为400～20000Da的聚乙二醇中的任意一种或至少两种的混合物；

所述糖类加入后的质量/体积浓度为5％～30％；

所述多元醇加入后的质量/体积浓度为5％～30％；

所述聚乙二醇加入后的质量/体积浓度为1％～10％；

所述纯化的操作温度为4℃～37℃；

所述纯化的方法为色谱或膜分离。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述糖类加入后的质量/体积浓度为10％～20％；

所述多元醇加入后的质量/体积浓度为10％～20％；

所述聚乙二醇加入后的质量/体积浓度为1％～5％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化的操作温度为4℃～25℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱选自离子交换色谱、疏水作用色谱、亲和色谱或凝胶过滤色谱中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在色谱分离时，所述多元羟基化合物加入至原料液、淋洗液或洗脱液的任意一种或至少两种的组合中，再进行色谱分离。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜分离的截留分子量为5～300kDa。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在膜分离时，所述多元羟基化合物加入至原料液中，再进行膜分离操作。

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