CN109106948B - 一种口蹄疫抗原保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疫苗生产领域，具体而言，涉及一种口蹄疫抗原保护剂及其应用。所述保护剂由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂5％～20％，蛋白质二硫键还原剂0.08‰～1.1‰，氨基酸类共溶剂1.5％～4.5％，蛋白质类保护剂0.5％～3％；所述糖类还原剂包括木糖醇、乳糖、果糖的一种或多种；所述蛋白质二硫键还原剂包括DTT和/或TCEP。所述保护剂可保护口蹄疫抗原完整性、抑制其有效成分146S降解、保证其免疫原性，适合口蹄疫抗原长期保存。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗生产领域，具体而言，涉及一种口蹄疫抗原保护剂及其应用。
背景技术
口蹄疫(Foot and Mouth Disease，英文简称FMD)，是一种由口蹄疫病毒(Footand Mouth Disease Virus,FMDV)引起的烈性传染病，易感动物种类繁多(如牛、猪、羊、等)，其特征为受感染的偶蹄类动物口、足等部位皮肤会出现水泡，可导致部分动物死亡，造成巨大的经济损失。由于口蹄疫病原变异性强(有7个血清型，型间不能发生交叉保护)、感染性强、传播速度快、危害面积广，可造成巨大得经济损失和社会影响，该病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物传染病之一。在我国口蹄疫分类为一类疫病。这都充分显示了国内外对口蹄疫的关注程度。
最早关于口蹄疫病毒疫苗是法国Vallée、Carré等人于1926年发明的，灭活疫苗(O型)系用口蹄疫病毒接种仓鼠肾细胞系(BHK-21)培养，收获培养物经二乙烯亚胺(BEI)灭活后，加矿物油佐剂混合乳化制成。外观是呈乳白色或淡粉红色乳剂。
随着科学技术的进步，对疫苗的质量要求也越来越高。目前口蹄疫苗存在免疫保护力不稳定，免疫后检测不到抗体或产生抗体的水平低，或者免疫期较短，其主要原因是由于口蹄疫疫苗中的有效免疫成分146S未得到充分的保护，现有的疫苗制备工艺多为传统方法，没有合适的保护剂保证抗原的完整性及免疫原性。这一现状对我国口蹄疫疫情的控制及口蹄疫疫苗产业的发展产生了不利的影响。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种口蹄疫抗原保护剂，所述的保护剂可保护口蹄疫抗原完整性、抑制其有效成分146S降解、保证其免疫原性，适合口蹄疫抗原长期保存。
本发明的第二目的在于提供一种含有口蹄疫抗原的组合物，所述组合物有口蹄疫抗原和上述保护剂组成，可长期稳定的保存口蹄疫抗原，所述保护剂成分不干扰Lowry法对总氮的测定结果，不影响对疫苗纯度的评估，国家标准和GMP标准。
本发明的第三目的在于提供一种制备口蹄疫疫苗的方法，该方法设计合理，操作简便，使用安全高效。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种口蹄疫抗原保护剂，所述保护剂由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂5％～20％，蛋白质二硫键还原剂0.08‰～1.1‰，氨基酸类共溶剂1.5％～4.5％，蛋白质类保护剂0.5％～3％；
所述糖类还原剂包括木糖醇、乳糖、果糖的一种或多种；
所述蛋白质二硫键还原剂包括DTT和/或TCEP。
一种含有口蹄疫抗原的组合物，所述组合物包括上述的保护剂。
一种制备口蹄疫疫苗的方法，将上述提及的口蹄疫抗原与上述的保护剂混合。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种使用安全高效的口蹄疫保护剂，可保护口蹄疫抗原、保护抗原完整性、抑制146S降解、保证其免疫原性。并通过37°耐老化实验、45°加速老化实验来验证保护剂的具有良好的保护力。对我国口蹄疫疫情的控制及口蹄疫疫苗产业的发展具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中的不同保护剂中的口蹄疫抗原在37℃老化14天的液相图谱；
图2为本发明一个实施例中的不同保护剂中的口蹄疫抗原在45℃加速老化9h的液相图谱；
图3为本发明一个实施例中的加入保护剂的口蹄疫抗原在45℃加速老化9h后的电镜结果图；
图4为本发明一个实施例中的未加入保护剂的口蹄疫抗原在45℃加速老化9h后的电镜结果图。
具体实施方式
一种口蹄疫抗原保护剂，所述保护剂由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂5％～20％，蛋白质二硫键还原剂0.08‰～1.1‰，氨基酸类共溶剂1.5％～4.5％，蛋白质类保护剂0.5％～3％；
所述糖类还原剂包括木糖醇、乳糖、果糖的一种或多种；
所述蛋白质二硫键还原剂包括DTT和/或TCEP。
DTT即二硫苏糖醇，英文名称为DL-Dithiothreitol，分子量154.25。在一些实施方式中，所述DTT在所述保护剂中的质量体积百分比为0.03‰～0.38‰。
TCEP即三(2-羧乙基)膦，英文名称为Tris(2-carboxyethyl)phosphine，分子量286.7。在一些实施方式中，所述TCEP在所述保护剂中的质量体积百分比为0.05‰～0.72‰。
在疫苗质量检测中需测定总氮含量，用于评价抗原纯度。如保护剂总氮较高，或者保护剂的试剂干扰总氮测定，势必会影响对疫苗质量的客观评价。本发明保护剂成分不干扰总氮的测定结果，不影响对疫苗纯度的评估，国家标准和GMP标准。
本发明提供的口蹄疫抗原保护剂设计合理，十分适合口蹄疫抗原的长效保护。
糖类还原剂优选为多羟基糖，进一步优选为木糖醇、乳糖、果糖的一种或多种。所述糖类除作为还原剂外，还具有共溶的效果，可以在待保护的蛋白质分子表面形成保护壳，起到稳定的作用。多羟基的糖可以在待保护的病毒衣壳蛋白表面形成水化膜，起到稳定的作用，且不同的糖类对抗原的保护能力是不同的。
在一些实施方式中，所述保护剂还可以由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂9％～15％，蛋白质二硫键还原剂0.16‰～0.5‰，氨基酸类共溶剂2％～4％，蛋白质类保护剂0.5％～2％。在一些实施方式中，所述氨基酸类共溶剂包括半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述蛋白质类保护剂包括白蛋白和/或血清蛋白。
蛋白质类保护剂可维持待保护蛋白质的稳定性。不用抗原可选用的蛋白质类保护剂不尽相同，需根据不同的抗原做相应的实验和检测。
在一些实施方式中，所述保护剂还可以由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂18％(木糖醇6％、乳糖6％、果糖6％)，蛋白质二硫键还原剂0.7‰(DTT 0.4‰、TCEP 0.3‰)，氨基酸类共溶剂4％(半胱氨酸1％、甘氨酸2％、精氨酸1％)，蛋白质类保护剂1％(白蛋白0.8％、血清蛋白0.2％)；糖类还原剂5％(木糖醇2％、乳糖2％、果糖1％)，蛋白质二硫键还原剂1.1‰(DTT 0.5‰、TCEP 0.6‰)，氨基酸类共溶剂4.5％(半胱氨酸2％、甘氨酸1.5％、精氨酸1％)，蛋白质类保护剂1.5％(白蛋白0.5％、血清蛋白1％)；糖类还原剂20％(木糖醇12％、乳糖8％)，蛋白质二硫键还原剂0.08‰(DTT 0.03‰、TCEP 0.05‰)，氨基酸类共溶剂1.5％(半胱氨酸0.5％、甘氨酸1.0％)，蛋白质类保护剂2.5％(白蛋白1.2％、血清蛋白1.3％)；糖类还原剂9％(木糖醇4％、果糖5％)，蛋白质二硫键还原剂0.16‰(DTT0.16‰)，氨基酸类共溶剂2％(甘氨酸1.2％、精氨酸0.8％)，蛋白质类保护剂3％(血清蛋白3％)；糖类还原剂12％(乳糖8％、果糖4％)，蛋白质二硫键还原剂0.5‰(TCEP 0.5‰)，氨基酸类共溶剂4％(半胱氨酸1.8％、精氨酸2.2％)，蛋白质类保护剂2％(白蛋白2％)；糖类还原剂15％(木糖醇4％、乳糖5％、果糖6％)，蛋白质二硫键还原剂0.25‰(DTT 0.12‰、TCEP0.13‰)，氨基酸类共溶剂3％(半胱氨酸1％、甘氨酸1％、精氨酸1％)，蛋白质类保护剂0.5％(白蛋白0.3％、血清蛋白0.2％)等等。
在一些实施方式中，所述保护剂的成分还包括无机平衡盐；优选地，所述无机平衡盐包括：60～100mM HEPES、70～100mM EDTA、20～40mM KCl、10～20mM MgCl2的一种或多种。
在一些实施例中，所述HEPES的浓度还可以为70mM、80mM、90mM、95mM等；EDTA的浓度还可以为75mM、80mM、90mM、95mM等；KCl的浓度还可以为25mM、30mM、35mM等；MgCl2的浓度还可以为12mM、15mM、18mM等；以上成分在其相应的浓度范围内结果基本一致。
在一些实施方式中，所述保护剂的成分还包括0.5～1.0mM脲素。
脲素可增强离子强度，使其带电荷数增加，有利于长期保存。在一些实施例中，所述脲素的浓度还可以为0.6mM、0.8mM、0.9mM等(此范围内结果基本一致)。
在一些实施方式中，所述保护剂的pH为7.2～7.9。
在一些实施例中，所述pH还可以为7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8等(此范围内结果基本一致)。
本发明的另一方面在于提供一种含有口蹄疫抗原的组合物，所述组合物包括上述的保护剂。
在一些实施方式中，所述口蹄疫抗原包括灭活抗原和/或未灭活抗原。
在一些实施方式中，在所述组合物中，所述口蹄疫抗原的有效成分的浓度为1～200μg/mL。
优选地，使用超滤浓缩管将所述口蹄疫抗原溶液进行置换，保证抗原在所述的保护剂中进行保存，4℃至少可存放18个月。
本发明的另一方面在于提供一种制备口蹄疫疫苗的方法，将上述提及的口蹄疫抗原与上述的保护剂混合，然后调整pH，除菌后即得。
在一些实施例中，所述疫苗中，还包括佐剂，所述佐剂在所述混合时加入。
优选地，所述佐剂包括ISA 206或ISA201VG油佐剂。
在一些实施方式中，所述口蹄疫抗原保护剂可应用于猪瘟、蓝耳、伪狂犬全病毒灭活苗及亚单位疫苗中的有效抗原保存。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本申请涉及的化学试剂见表1。
表1所用化学试剂
| 厂家 | 纯度 | |
| HEPES | sigma | 分析纯 |
| KCl | sigma | 分析纯 |
| 还原性物质 | sigma | 分析纯 |
| EDTA | sigma | 分析纯 |
| MgCl<sub>2</sub> | sigma | 分析纯 |
| NaOH | 北京化工 | 分析纯 |
实施例1
将60mM HEPES、100mM EDTA、20mM KCl、20mM MgCl2、0.5mM脲素配制成10X母液，称取糖类还原剂20g(木糖醇9g、果糖11g)、蛋白质二硫键还原剂0.008g(DTT 0.003g、TCEP0.005g)、氨基酸类共溶剂4.5g(半胱氨酸2g、甘氨酸1g、精氨酸1.5g)和蛋白质类保护剂0.5g(白蛋白和/或血清蛋白)，将以上组分，加水溶解并定容至100mL，然后调节pH至7.2，用0.22um滤膜除菌过滤后，置于4℃保存。
实施例2
将100mM HEPES、70mM EDTA、40mM KCl、10mM MgCl2、1.0mM脲素配制成10X母液，称取糖类还原剂5g(乳糖2g、果糖3g)、蛋白质二硫键还原剂0.11g(TCEP 0.11g)、氨基酸类共溶剂1.5g(半胱氨酸1g、甘氨酸0.5g)和蛋白质类保护剂3g(白蛋白1g、血清蛋白2g)，将以上组分，加水溶解并定容至100mL，然后调节pH至7.3，用0.22um滤膜除菌过滤后，置于4℃保存。
实施例3
将80mM HEPES、90mM EDTA、30mM KCl、15mM MgCl2、0.7mM脲素配制成10X母液，称取糖类还原剂10g(木糖醇6g、乳糖4g)、蛋白质二硫键还原剂0.04g(DTT 0.04g)、氨基酸类共溶剂2g(甘氨酸0.8g、精氨酸1.2g)和蛋白质类保护剂2g(白蛋白2g)，将以上组分，加水溶解并定容至100mL，然后调节pH至7.4，用0.22um滤膜除菌过滤后，置于4℃保存。
实施例4
将70mM HEPES、80mM EDTA、25mM KCl、18mM MgCl2、0.8mM脲素配制成10X母液，称取糖类还原剂15g(木糖醇6g、乳糖4g、果糖5g)、蛋白质二硫键还原剂0.02g(DTT 0.01g、TCEP 0.01g)、氨基酸类共溶剂4g(半胱氨酸2g、精氨酸2g)和蛋白质类保护剂1g(血清蛋白1g)，将以上组分，加水溶解并定容至100mL，然后调节pH至7.9，用0.22um滤膜除菌过滤后，置于4℃保存。
实施例5
将75mM HEPES、90mM EDTA、32mM KCl、13mM MgCl2、0.6mM脲素配制成10X母液，称取糖类还原剂18g(木糖醇5g、乳糖8g、果糖5g)、蛋白质二硫键还原剂0.06g(DTT 0.03g、TCEP 0.03g)氨基酸类共溶剂3g(半胱氨酸1g、甘氨酸1g、精氨酸1g)和蛋白质类保护剂1.5g(白蛋白0.7g、血清蛋白0.8g)，将以上组分，加水溶解并定容至100mL，然后调节pH至7.7，用0.22um滤膜除菌过滤后，置于4℃保存。
实验例1
37℃老化实验验证一。
对比例的设置，以实施例5为基础设置对比例，具体的：
对比例1：将糖类还原剂替换为相同质量的蔗糖；
对比例2：将蛋白质类保护剂替换为相同质量的蛋白胨。
使用GE 100kD超滤浓缩管，将抗原溶液的缓冲体系置换为外厂保护剂、本品保护剂(实施例5)和对比例中的缓冲体系，无菌过滤后分装于EP管中，经37℃老化，将未加保护剂的口蹄疫146S抗原作为对照，进行老化实验，取样时间为3天、7天、11天、14天。使用WaterS液相检测测定口蹄疫病毒146S含量(见表2)，根据检测结果计算其保护率(见表3)。
表2 37℃老化146S测定结果
表3 37℃老化保护率对比
由表2、3可知，本实施例中的保护剂在37℃放置14天其保护率可达75.71％，未加保护剂的抗原其146S仅保存5.23％，由此可知保护剂效果显著，且明显优于其他厂家。而且，通过对比例可以看出，使用同为糖类还原剂的蔗糖或同为蛋白质类保护剂的蛋白胨做相应的组分替换后，其保护效果明显下降。
37℃老化实验验证二。
从图1中146S液相检测图谱中可知，使用本品保护剂经37℃老化放置14天，其保护率为75.71％，而未加保护剂的对照组，对抗原146S的保护率仅为5.23％，146S损失较大。
实验例2
45℃加速老化实验验证一。
为了进一步验证其保护效果，本发明提高了耐热裂解温度，采用45℃加速样品的老化实验，取样时间为3h、6h、9h。测定口蹄疫病毒146S浓度(见表4)，根据检测结果计算其保护率(见表5)。
表4 45℃加速老化146S测定结果
表5 45℃加速老化保护率对比
由表4、5可知，本实施例中的保护剂在45℃加速老化9h后其保护率可达56.44％，对比未加保护剂的抗原与其他保护剂比较保护效果显著。对比未加保护剂的抗原可知其保护效果显著，且明显优于其他厂家。而且，通过对比例可以看出，使用同为糖类还原剂的蔗糖或同为蛋白质类保护剂的蛋白胨做相应的组分替换后，其保护效果明显下降。
45℃加速老化实验验证二。
从图2中146S液相检测图谱中可以看出，经45℃加速老化试验9h后，可以看出本保护剂的146S剩余含量最多相当于原样的56.4％，而其他厂家保护剂最高的也仅有16.9％。
实验例3
保护剂对毒价的影响。
为了考查保护剂对抗原毒价的影响，我们使用BHK21细胞系对抗原进行了TCID50毒价测定，病毒滴度为10-6、10-7、10-8，每个滴度平行测定8个孔，未加保护剂的抗原设为对照，进行三次平行实验验证影响程度。
表6 TCID50测试结果
| TCID50 | 其他厂家1 | 本品保护剂 | 原始抗原 |
| 平行实验1 | 10<sup>-7.25</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.43</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.33</sup>/0.1ml |
| 平行实验2 | 10<sup>-7.25</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.33</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.25</sup>/0.1ml |
| 平行实验3 | 10<sup>-7.33</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.49</sup>/0.1ml | 10<sup>-7.33</sup>/0.1ml |
由表6可知，对照均值为10-7.30/0.1ml，本品保护剂为10-7.40/0.1ml，本品保护剂的毒价略高，但差异不显著，保护剂对抗原毒价具有一定的保护作用。
实验例4
病毒颗粒完成性检测。
经45℃加速老化9h后，使用电镜观察加入本发明的保护剂和未加保护剂的病毒颗粒。结果见图3和图4。可以明显看出加入保护剂后经45℃老化9h后，在电镜观察的视野里依然后完整病毒颗粒的存在，但是未加保护剂的抗原经45℃加速老化9h后，颗粒完全裂解。证明本保护剂在抗老化性的效果显著。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种含有口蹄疫抗原的组合物，其特征在于，所述组合物包括保护剂，所述保护剂由以下质量体积百分含量的物质组成：糖类还原剂5%~20%，蛋白质二硫键还原剂0.08‰~1.1‰，氨基酸类共溶剂1.5%~4.5%，蛋白质类保护剂0.5%~3%；
所述糖类还原剂由木糖醇、乳糖和果糖组成；
所述蛋白质二硫键还原剂由DTT和TCEP组成；
所述蛋白质类保护剂由白蛋白和血清蛋白组成；
所述氨基酸类共溶剂由半胱氨酸、甘氨酸和精氨酸组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述保护剂的成分还包括无机平衡盐。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述无机平衡盐包括：60~100mM HEPES、70~100mM EDTA、20~40 mM KCl、10~20mM MgCl2的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述保护剂的成分还包括0.5~1.0mM脲素。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述保护剂的pH为7.2~7.9。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述口蹄疫抗原包括灭活抗原和/或未灭活抗原。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，在所述组合物中，所述口蹄疫抗原的有效成分的浓度为1~200μg/mL。
8.一种制备口蹄疫疫苗的方法，其特征在于，将权利要求1~7任一项所述的组合物调整pH，除菌后即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述除菌为经0.22µm无菌滤膜过滤。
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