JP6951527B2 - 精密分子質量を用いた免疫グロブリンのアイソタイピング - Google Patents
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Description
本出願は、2014年4月4日に出願された米国特許仮出願第61/975,524号の恩典を主張し、該仮出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本文書は、質量分析技法を用いて免疫グロブリンの重鎖および軽鎖を検出および定量するための方法に関する。
ヒト免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって一つに結合している、2つの同一の重鎖ポリペプチド(MWがそれぞれ約54キロダルトン)および2つの同一の軽鎖ポリペプチド(分子量がそれぞれ約24キロダルトン)を含む。各軽鎖および各重鎖は、定常領域および可変領域を含む。可変領域は、各鎖のN末端部分に位置し、定常領域は、各鎖のC末端部分に位置する。軽鎖および重鎖の定常領域は、異なるアミノ酸配列を有し、重鎖または軽鎖のアイソタイプを同定するために使用することができる。ヒトには、カッパまたはラムダと呼ばれる軽鎖ポリペプチドの2つの異なるアイソタイプ;ならびにガンマ(IgG)、アルファ(IgA)、ミュー(IgM)、イプシロン(IgE)、およびデルタ(IgD)と呼ばれる重鎖ポリペプチドの異なる5つのアイソタイプがある。
試料中の免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を検出する方法が、本明細書において提供される。該方法は、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料を提供する段階;試料を免疫精製、希釈、および/または濃縮する段階;ならびに試料を質量分析技法に供して、試料のマススペクトルを得る段階を含む。
以下の段階を含む、試料中の免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を検出するための方法:
(a)免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を免疫精製する段階;および
(c)該免疫精製された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階。
[本発明1002]
免疫精製する段階が、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgA抗体、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIgD抗体、抗ヒトIgE抗体、抗ヒトカッパ抗体、抗ヒトラムダ抗体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される抗体の使用を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
抗体が非ヒト抗体である、本発明1001〜1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
非ヒト抗体が、ラクダ抗体、軟骨魚類抗体、ラマ、ヒツジ、ヤギ、またはマウス抗体のうちの少なくとも1つである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
抗体が単一ドメイン抗体フラグメントである、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
単一ドメイン抗体フラグメント(SDAF)が、抗ヒトIgG SDAF、抗ヒトIgA SDAF、抗ヒトIgM SDAF、抗ヒトIgD SDAF、抗ヒトIgE SDAF、抗ヒトカッパSDAF、抗ヒトラムダSDAF、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
単一ドメイン抗体フラグメントが、ラクダ抗体、軟骨魚類抗体、ラマ、マウス抗体、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体に由来する、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
単一ドメイン抗体フラグメントについて段階(c)で生成されたマススペクトルが、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖について段階(c)で生成されたマススペクトルと重複しないように、該単一ドメイン抗体フラグメントが選択される、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
単一ドメイン抗体フラグメントが、段階(c)において単一電荷を有する約12,500〜約15,000m/zのシグナルを生成するように、該単一ドメイン抗体フラグメントが選択される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
免疫グロブリン軽鎖が、段階(c)の前に免疫グロブリン重鎖から切り離される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
免疫グロブリン軽鎖が、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の切断によって切り離される、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ジスルフィド結合が、ジスルフィド結合を還元する能力がある還元剤を使用して切断される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
還元剤が、DTT(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、DTE(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、チオグリコレート、システイン、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硫化物、二硫化物、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)、およびそれらの塩形態からなる群より選択される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
段階(c)の後に、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階をさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
軽鎖が、質量分析技法の間にフラグメント化されない、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
試料が生物学的試料である、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
生物学的試料が、全血試料、血清試料、血漿試料、尿試料、または脳脊髄液試料である、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
生物学的試料が、哺乳類の生物学的試料である、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
哺乳類の生物学的試料がヒトの生物学的試料である、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
質量分析技法が、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)技法を含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
質量分析技法が、マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析(microLC-ESI-Q-TOF MS)技法を含む、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
LC-MS技法が、正イオンモードの使用を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
質量分析技法が、マトリックス支援レーザー吸着イオン化-飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)技法を含む、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料が、単一分析で単一画分として分析される、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
試料中の免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との対形成を決定する段階をさらに含む、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
試料中の1種または複数種の免疫グロブリン重鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を同定する段階をさらに含む、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖の量を同定する段階をさらに含む、本発明1001〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
試料中のMタンパク質を同定する段階をさらに含む、本発明1001〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
試料中のMタンパク質を定量する段階をさらに含む、本発明1001〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
試料中のMタンパク質における免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との対形成を決定する段階をさらに含む、本発明1001〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
カッパ軽鎖とラムダ軽鎖の比が、各鎖に対応する1つまたは複数の多価イオンピークのピーク面積を測定することによって求められる、本発明1001〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖が、多価イオンピークのピーク面積を分子質量に変換することによって定量される、本発明1001〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
以下の段階を含む、試料中の免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を検出するための方法:
(a)免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料を提供する段階;
(b)単一ドメイン抗体フラグメントを利用して該試料を免疫精製する段階;
(c)軽鎖免疫グロブリンを重鎖免疫グロブリンから切り離す段階;
(d)該免疫精製された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階であって、質量分析技法が、(i)液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-質量分析器、(ii)マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析技法、および(iii)マトリックス支援レーザー吸着イオン化-飛行時間型質量分析技法からなる群より選択される、段階;ならびに
(e)試料中の(i)カッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比、(ii)免疫グロブリン軽鎖のアイソタイプ、(iii)免疫グロブリン重鎖のアイソタイプ、(iv)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖のアイソタイプ、ならびに(v)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖の定量的な量、の1つまたは複数を明らかにする段階。
[本発明1037]
以下の段階を含む、試料中の免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を検出するための方法:
(a)免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料を提供する段階;
(b)単一ドメイン抗体フラグメントを利用して該試料を免疫精製する段階;
(c)任意で、軽鎖免疫グロブリンを重鎖免疫グロブリンから切り離す段階であって、1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖が、Mタンパク質に由来する、段階;
(d)該免疫精製された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階であって、質量分析技法が、(i)液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-質量分析器、(ii)マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析技法、および(iii)マトリックス支援レーザー吸着イオン化-飛行時間型質量分析技法からなる群より選択される、段階;ならびに
(e)試料中の(i)Mタンパク質の同一性、(ii)Mタンパク質の量、(iii)Mタンパク質の免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との対形成、ならびに(iv)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、およびMタンパク質の定量的な量、の1つまたは複数を明らかにする段階。
[本発明1038]
以下の段階を含む、対象における障害を診断するための方法:
(a)免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む、対象由来の試料を提供する段階;
(b)該試料を免疫精製する段階;
(c)該免疫精製された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(d)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階;および
(e)該比を参照値と比較する段階。
[本発明1039]
障害が、自己免疫性障害、炎症性障害、感染性障害、および多クローン性高ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
障害が、形質細胞性形質細胞異常増殖症、高ガンマグロブリン血症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、亜急性硬化性全脳炎、ANCA関連血管炎、腫瘍随伴症候群、セリアック病、シェーグレン症候群、関節リウマチ、およびギラン・バレー症候群からなる群より選択される、本発明1038〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
障害が高ガンマグロブリン血症であり、カッパとラムダの比に加えて、異なるモノクローナル軽鎖が、ポリクローナルバックグラウンドを超えて同定される、本発明1038〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
タンパク質電気泳動(PEL)または免疫固定検査の結果を確認するために行われる、本発明1038〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
以下の段階を含む、対象におけるカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の異常な比に関連する障害の処置をモニタリングする方法:
(a)対象由来の最初の試料を提供する段階;
(b)処置の間、処置の後、またはその両方における該対象由来の1つまたは複数の第2の試料を提供する段階;
(c)該試料を免疫精製する段階;
(d)該免疫精製された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(e)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階;ならびに
(f)該最初の試料および該1つまたは複数の第2の試料からの比を比較する段階。
[本発明1044]
以下の段階を含む、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖を定量するための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を免疫精製する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(c)該スペクトルにおけるカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖に対応する多価イオンピークを同定する段階;ならびに
(d)該同定されたピークのピーク面積を分子質量に変換して、該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖を定量する段階。
[本発明1045]
以下の段階を含む、対象における中枢神経系中の炎症応答に関連する障害を診断する方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリンを含む脳脊髄液(CSF)試料を提供する段階;
(b)該CSF試料を質量分析技法に供して、該CSF試料のマススペクトルを得る段階;および
(c)該CSF試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖に対応する質量ピークを同定する段階。
[本発明1046]
免疫グロブリン軽鎖が、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の切断によって切り離される、本発明1045の方法。
[本発明1047]
ジスルフィド結合が、ジスルフィド結合を還元する能力のある還元剤を使用して切断される、本発明1045〜1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
還元剤が、DTT(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、DTE(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、チオグリコレート、システイン、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硫化物、二硫化物、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)、およびそれらの塩形態からなる群より選択される、本発明1045〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
段階(b)の前に、CSF試料が希釈される、本発明1045〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
質量分析技法が、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)技法を含む、本発明1045〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
質量分析技法が、マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析(microLC-ESI-Q-TOF MS)技法を含む、本発明1045〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
LC-MS技法が、正イオンモードの使用を含む、本発明1045〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
障害が、多発性硬化症、視神経脊髄炎、神経サルコイドーシス、亜急性硬化性全脳炎、およびギラン・バレー症候群からなる群より選択される、本発明1045〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
(d)1種または複数種の免疫グロブリンを含む血清試料を提供する段階;
(e)該血清試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(f)該血清試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークを同定する段階;および
(g)(i)該CSF試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークを、(ii)該血清試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークと比較する段階
をさらに含む、本発明1045〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
血清試料を質量分析技法に供する前に、該試料を濃縮する段階をさらに含む、本発明1045〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
血清試料中に存在しない1つまたは複数のピークがCSF試料中に存在することが、中枢神経系中の炎症応答を示す、本発明1045〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
以下の段階を含む、処置に対する応答をモニタリングするための方法:
(a)対象由来の最初のCSF試料を提供する段階;
(b)処置の間、処置の後、またはその両方における、該対象由来の1つまたは複数の第2のCSF試料を提供する段階;
(c)該CSF試料を免疫精製する段階;
(d)該免疫精製されたCSF試料を質量分析技法に供して、該CSF試料のマススペクトルを得る段階;
(e)(i)該最初のCSF試料における質量ピークを、(ii)該1つまたは複数の第2の試料における質量ピークと比較する段階。
[本発明1058]
以下の段階を含む、対象における中枢神経系中の炎症応答と関連する障害を診断する方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリンを含むCSF試料および1種または複数種の免疫グロブリンを含む血清試料を提供する段階;
(b)該CSF試料および該血清試料を質量分析技法に供して、該CSF試料および該血清試料のマススペクトルを得る段階;
(c)該CSF試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークを同定する段階;
(e)該血清試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークを同定する段階;ならびに
(d)(i)該CSF試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークを、(ii)該血清試料中の1種または複数種の軽鎖に対応する質量ピークと比較する段階。
[本発明1059]
以下の段階を含む、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求めるための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;および
(c)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階。
[本発明1060]
段階(b)の前に、免疫グロブリン軽鎖が、免疫グロブリン重鎖から切り離される、本発明1059の方法。
[本発明1061]
免疫グロブリン軽鎖が、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の切断によって切り離される、本発明1059〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
ジスルフィド結合が、ジスルフィド結合を還元する能力のある還元剤を使用して切断される、本発明1059〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
還元剤が、DTT(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、DTE(2,3ジヒドロキシブタン-1,4-ジチオール)、チオグリコレート、システイン、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、硫化物、二硫化物、TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン)、およびそれらの塩形態からなる群より選択される、本発明1059〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
軽鎖が、質量分析技法の間にフラグメント化されない、本発明1059〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
試料が生物学的試料である、本発明1059〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
生物学的試料が、全血試料、血清試料、血漿試料、または尿試料である、本発明1059〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
生物学的試料が、哺乳類の生物学的試料である、本発明1059〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
哺乳類がヒトである、本発明1059〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
試料中の免疫グロブリンが、段階(b)の前に該試料中で濃縮される、本発明1059〜1068のいずれかの方法。
[本発明1070]
質量分析技法が、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)技法を含む、本発明1059〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
質量分析技法が、マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析(microLC-ESI-Q-TOF MS)技法を含む、本発明1059〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
LC-MS技法が、正イオンモードの使用を含む、本発明1059〜1070のいずれかの方法。
[本発明1073]
カッパ軽鎖とラムダ軽鎖の比が、各鎖に対応する1つまたは複数の多価イオンピークのピーク面積を測定することによって求められる、本発明1059〜1071のいずれかの方法。
[本発明1074]
カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖が、多価イオンピークのピーク面積を分子質量に変換することによって定量される、本発明1059〜1072のいずれかの方法。
[本発明1075]
以下の段階を含む、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求めるための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリンが濃縮された試料を提供する段階;
(b)該試料中の免疫グロブリンにおける軽鎖免疫グロブリンを重鎖免疫グロブリンから切り離して、切り離した免疫グロブリン試料を作製する段階;
(c)該試料を、マイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化-四重極飛行時間型質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;および
(d)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階。
[本発明1076]
以下の段階を含む、対象における障害を診断するための方法:
(a)対象由来の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(c)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階;および
(d)該比を参照値と比較する段階。
[本発明1077]
障害が、自己免疫性障害、炎症性障害、感染性障害、および多クローン性高ガンマグロブリン血症からなる群より選択される、本発明1076の方法。
[本発明1078]
障害が、高ガンマグロブリン血症であり、カッパとラムダの比に加えて、異なるモノクローナル軽鎖が、ポリクローナルバックグラウンドを超えて同定され得る、本発明1075〜1076のいずれかの方法。
[本発明1079]
タンパク質電気泳動(PEL)または免疫固定検査の結果を確認するために行われる、本発明1075〜1077のいずれかの方法。
[本発明1080]
以下の段階を含む、対象におけるカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の異常な比に関連する障害の処置をモニタリングする方法:
(a)処置の前における対象の第1の試料を提供する段階;
(b)処置の間または後における該対象の第2の試料を提供する段階;
(c)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(d)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階;ならびに
(e)該第1の試料および該第2の試料からの比を比較する段階。
[本発明1081]
以下の段階を含む、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖を定量するための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(c)該スペクトルにおけるカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖に対応する多価イオンピークを同定する段階;ならびに
(d)該同定されたピークのピーク面積を分子質量に変換して、該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖を定量する段階。
[本発明1082]
以下の段階を含む、対象における高ガンマグロブリン血症を診断するための方法:
(a)対象由来の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;
(c)該試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖の総量を求める段階;ならびに
(d)該試料中の量を参照値と比較する段階であって、参照よりも多い総量が、該対象が高ガンマグロブリン血症を有することを示す、段階。
[本発明1083]
試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖およびラムダ免疫グロブリン軽鎖の総量が、参照値よりも少なくとも2倍多い、本発明1082の方法。
[本発明1084]
以下の段階を含む、試料中の1種または複数種の免疫グロブリン重鎖のアイソタイプを決定するための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン重鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;および
(c)該試料中の免疫グロブリン重鎖の1種または複数種のアイソタイプに対応する質量ピークを同定する段階。
[本発明1085]
以下の段階を含む、試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖のアイソタイプを決定するための方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;および
(c)該試料中の免疫グロブリン軽鎖の1種または複数種のアイソタイプに対応する質量ピークを同定する段階。
[本発明1086]
以下の段階を含む、対象における1種または複数種の重鎖免疫グロブリンアイソタイプに関連する障害を診断する方法:
(a)1種または複数種の免疫グロブリン重鎖を含む試料を提供する段階;
(b)該試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階;および
(c)該試料中の免疫グロブリン重鎖の1種または複数種のアイソタイプに対応する質量ピークを同定する段階。
[本発明1087]
障害が、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症(MGUS)、軽鎖沈着症、アミロイドーシス、多発性骨髄腫、重鎖沈着症、およびPOEMS症候群からなる群より選択される、本発明1086の方法。
特に定義しない限り、本明細書における全ての技術用語および科学用語は、本明細書が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明における使用のための方法および材料は、本明細書に記載されており、当技術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施例は単なる例証であり、限定することを意図してしない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられる。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の図面、ならびに添付の特許請求の範囲から明らかであろう。
ヒト免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は、3つの領域:N末端V領域(カッパについてアミノ酸約107個およびラムダについてアミノ酸110個)、J領域(アミノ酸12個)、およびC末端C領域(アミノ酸106個)からなる。各領域は、軽鎖を無傷の免疫グロブリンの一部または遊離の軽鎖のいずれかとして作製および分泌するB細胞にだけ発現される特異的なセットの遺伝子から翻訳される。B細胞はまた、体細胞超変異過程を介して軽鎖についてのVおよびJ領域遺伝子をランダムに突然変異させ、多数の異なる遺伝子組み合わせ(カッパ単独について約1.3×103個)を生じることができる(例えば、Lefranc, MP. Cold Spring Harb Protoc 2011; 2011:595-603を参照されたい)。軽鎖V領域および軽鎖J領域の遺伝子配列は、ランダムに生じるので、中心極限定理(Mukhopadhyay, N and Chattopadhyay, B. Sequential Anal 2012; 31:265-77)は、発現された軽鎖のレパートリーのアミノ酸配列が、正規分布した分子質量プロファイルを有するはずであると予測している。
・IgA、2つのサブクラス、平均分子質量=37,090Da
・IgG、4つのサブクラス、平均分子質量=37,308Da
・IgM、1つのクラス、分子質量=49,307Da
である。
・IgAはO-結合型およびN-結合型グリコシル化の両方を有する、
・IgGはAps297でのN-結合型グリコシル化だけを有する、
・IgMは5つのN-結合型グリコシル化部位を有する
である。
分析用の試料は、組織試料(例えば、脂肪、肝臓、腎臓、心臓、筋肉、骨、もしくは皮膚組織)または生体液試料(例えば、血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液、または中枢髄液(central spinal fluid))のような任意の生物学的試料であり得る。生物学的試料は、哺乳類、例えばヒト、イヌ、ネコ、霊長類、齧歯類、ブタ、ヒツジ、ウシ、およびウマを含むがそれらに限定されない、免疫グロブリンを有する対象由来のものであり得る。一部の態様では、生物学的試料は、外因性モノクローナル免疫グロブリンを含む。また、試料は、公知の組成の混合物または対照試料のような人工試薬であり得る。
試料を調製した後、1種または複数種の免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖を有する切り離した試料等の免疫グロブリン試料を、直接または高速液体クロマトグラフィーカラム(HPLC)での分離後のいずれかに質量分析(MS)技法に供することができる。一部の態様では、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)を使用してイオンのマススペクトルを分析することができる。例えば、方法は、試料中の重鎖または軽鎖に起因する多価イオン(例えば、+1イオン、+2イオン、+3イオン、+4イオン、+5イオン、+6イオン、+7イオン、+8イオン、+9イオン、+10イオン、+11イオン、+12イオン、+13イオン、+14イオン、+15イオン、+16イオン、+17イオン、+18イオン、+19イオン、+20イオン、+21イオン、および+22イオン)を同定するために使用することができる。一部の態様では、+11荷電イオンが同定され、さらなる分析のために使用される。一部の態様では、試料は、質量分析技法の間にフラグメント化されない。LC-MSは、液体クロマトグラフィーの物理的分離能を質量分析の質量分析能と組み合わせる分析技法であり、複合混合物中の化学物質の検出および潜在的同定に適している。任意のLC-MS機器、例えばABSciex 5600質量分析計を使用することができる。一部の態様では、マイクロフローLC-MSを利用することができる。任意の適切なマイクロフロー機器、例えばEksigent Ekspert 200 microLCを使用することができる。試料中の1種または複数種の重鎖または軽鎖に対応する1つまたは複数のピークについてイオンマススペクトルを分析することができる。例えば、カッパおよびラムダ軽鎖のそれぞれについて1つまたは複数のイオンピーク、例えば+11イオンピークを調べて、試料中の各鎖の比を求めることができる。一部の態様では、比は、選択されたイオンピークのピーク面積によって求められる。
本明細書提供の質量分析に基づく方法を使用して、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求めることができる。一部の態様では、1種または複数種の免疫グロブリンを有する試料(例えば生物学的試料)を質量分析アッセイに供することができる。試料を前処理して、試料中に存在する免疫グロブリンを単離または濃縮することができ、場合により、免疫グロブリン軽鎖を、質量分析の前に免疫グロブリン重鎖から切り離すことができる。次に、アッセイから得られたスペクトルを使用して、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求めることができる。一部の態様では、カッパおよびラムダ軽鎖の相対存在量は、1つまたは複数の同定されたピークのピーク面積を分子質量に変換することによって求めることができる。
血清および免疫グロブリン試薬:血清は、臨床検査室から得られた廃棄試料から収集した。正常なドナーからの精製IgGカッパおよびIgGラムダをBethyl Laboratories(Montgomery, TX)から購入した。
本発明者らは、生物学的試料中のカッパおよびラムダ軽鎖を同定および定量するために使用することができる異なるポリクローナルカッパおよびラムダ軽鎖分子質量プロファイルを発見した。図4に、メロンゲル精製されDTT還元された正常プール血清2μLの注入を、microLC-ESI-Q-TOF MSにより上記方法を用いて分析したものから得られたトータルイオンクロマトグラムを示す。強調された領域は、軽鎖がLCカラムから溶離し始める5.0〜6.0分の保持時間ウインドウを表す。図5に、この1分のウインドウにわたり収集されたスペクトルを合計することによって得られたマススペクトルを、強調された垂直線の隣に示された予想されるポリクローナルカッパ軽鎖の荷電状態とともに示す。図5に、予想されるポリクローナルカッパおよびラムダ軽鎖についての+11荷電状態の拡大図も示す。図6に、カッパおよびラムダのポリクローナルな分子質量プロファイルを示している、分子質量に変換後の、デコンボリューションされた図5のマススペクトルを示す。図6内の挿入図に、実験的に観測された分子質量プロファイルと優れた一致を示す、遺伝子配列データから計算された正規分布型分子質量プロファイルを示す。カッパポリクローナル軽鎖について計算された平均分子質量は、23,433Daであり、一方でラムダ軽鎖についての平均分子質量は、22,819Daであった。これは、言い換えると、遺伝子配列データを使用してカッパ軽鎖とラムダ軽鎖との間の計算された差よりも19Da(3%)低い614Daの差になる。
2つの分子質量プロファイルが確かにカッパおよびラムダ軽鎖アイソタイプを表していたことを確認するために、正常プール血清から得られた市販の精製IgGカッパ調製物および精製IgGラムダ調製物を、上記方法を用いてmicroLC-ESI-Q-TOF MSにより分析した。図7に、正常プール血清(上)、IgGカッパが精製された正常プール血清(中央)、およびIgGラムダが精製された正常プール血清(下)についてのデコンボリューション後の分子質量プロファイルを比較した結果を示す。本図は、IgGカッパが精製された正常プール血清中にラムダのポリクローナルな分子質量プロファイルが不在であること、およびIgGラムダが精製された正常プール血清中にカッパのポリクローナルな分子質量プロファイルが不在であることをはっきりと示している。さらに、以前に記載されたトップダウンMSを使用して、IgGカッパが精製された血清試料のアイソタイプおよびIgGラムダが精製された血清試料のアイソタイプを確認した(Barnidge. DR et al. J Proteome Res 2014)。これらの観測は、血清中のポリクローナルカッパ軽鎖がおよそ23,200Daから23,800Daの間に分子質量プロファイルを有し、血清中のポリクローナルラムダ軽鎖がおよそ22,500Daから23,200Daの間に分子質量プロファイルを有するという結果を裏付けている。
4種の他の哺乳類からの血清で追加的な実験を行って、カッパ/ラムダの発現比の差を評価した。図8に、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマ由来のプール血清試料についての結果を示す。これらの分子質量プロファイルは、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマが、ラムダの質量範囲に入るポリクローナルな免疫グロブリン軽鎖分子質量プロファイルを有することを示している。トップダウンMSをヒツジ血清試料に行って、観測された分子質量プロファイルが実際にラムダアイソタイプであったことを確認した(データは示さず)。ラムダ軽鎖が奇蹄類および偶蹄類において支配的なアイソタイプであるという観測は、以前に公表された観測と一致する(Arun, SS et al. Zentralbl Veterinarmed A 1996; 43:573-6; Sun Y, et al. J Anim Sci Biotechnol 2012; 3:18;およびButler, JE et al Dev Comp Immunol 2009; 33:321-33)。
上記方法を用いて、様々な障害を有する患者からの血清試料を調査した。具体的には、多くの場合に多クローン性高ガンマグロブリン血症または高ガンマグロブリン血症と呼ばれる、高レベルの総血清免疫グロブリンを有する患者の血清の軽鎖プロファイルを検査した。図9に、正常な対照血清(下の線)と比較した高ガンマグロブリン血症を有する患者から採取された血清から観測された+11荷電状態のカッパおよびラムダ軽鎖イオン(上の線)を示す。免疫グロブリン軽鎖の溶離時間からの全てのスペクトルを合計することによってマススペクトルを取得した(データは示さず)。比較すると、高ガンマグロブリン血症を有する患者からの血清中の軽鎖の全体的な存在量が、正常対照からの血清と比較して約2倍高いと見て取れる。加えて、高ガンマグロブリン血症の患者からのスペクトルは、ポリクローナルバックグラウンドを超えて存在する異なるモノクローナル軽鎖を表し、スペクトルにオリゴクローナルな外観を与えている。
カッパ軽鎖およびIgG重鎖を有する治療用組換えモノクローナル抗体HUMIRA(登録商標)(アダリムマブ)が添加された正常血清を使用する実験も行った。図11に、上記のように行ったLC-MS分析からの軽鎖について観測された応答を示す。図の上に、異なる荷電状態を強調して、多価軽鎖イオンをHUMIRAの多価カッパ軽鎖イオンと共に示す。図11の下に、m/zスペクトル中の多価イオンをダルトン(Da)の単位でそれらの測定精密分子質量に変換したときに見出される分子質量を示す。本結果は、正常血清に0.01g/dL(100mg/L)添加されたHUMIRAからのカッパ軽鎖が、分子質量23,407Daでポリクローナルバックグラウンドを超えて同定できることを実証している。この分子質量は、HUMIRAのカッパ軽鎖の質量と一致する。
公知のラムダモノクローナル遊離軽鎖を有する患者であり、またカッパ軽鎖およびIgG重鎖を有する治療用組換えモノクローナル抗体REMICADE(登録商標)(インフリキシマブ)で処置もされている患者からの血清を使用する実験も行った。図12に、上記のように行ったLC-MS分析から軽鎖について観測された応答を示す。図の上に、内因性モノクローナルラムダ軽鎖およびREMICADEからのカッパ軽鎖からの多価軽鎖イオンを示す。図12の下に、m/zスペクトルの中の多価イオンをダルトン(Da)の単位でそれらの測定精密分子質量に変換したときに見出される分子質量を示す。本結果は、内因性モノクローナルラムダ軽鎖(22,606Da)および投与されたREMICADEからのカッパ軽鎖(23,433Da)が、ポリクローナルバックグラウンドを超えて明らかに目に見えることを実証している。加えて、内因性ラムダ軽鎖は、ラムダの分子質量分布内に位置し、一方でRemicadeからのカッパ軽鎖は、正確な分子質量(24,433Da)でカッパの分子質量分布内にある。
カッパ軽鎖およびIgG重鎖を有する治療用組換えモノクローナル抗体HUMIRA(登録商標)(アダリムマブ)が添加された正常血清を使用して実験を行った。図13に、上記のように行ったLC-MS分析から重鎖について観測された応答を示す。図の上に、重鎖多価イオンをHUMIRA重鎖の多価イオンと共に、それらの異なる荷電状態を強調して示す。図13の下に、m/zスペクトルにおける多価イオンをそれらの測定精密分子質量にダルトン(Da)単位で変換したときに見出された分子質量を示す。本結果は、正常血清に0.5g/dL(5g/L)添加されたHUMIRAからのIgG重鎖が、ポリクローナルバックグラウンドを超えて、グリコシル化を有するHUMIRA重鎖の質量に対応する分子質量50,636Daで同定できることを実証している。非グリコシル化形態も47,140Daに観測される。本方法は、モノクローナル免疫グロブリンに関連するグリコフォームがポリクローナルバックグラウンドを超えて観測される限り、ポリクローナルバックグラウンドを超えたモノクローナル免疫グロブリンを同定することに焦点を合わせており、本方法は、分子質量により重鎖をアイソタイピングすることができる。
本明細書提供の方法を用いてHIV感染患者からの血清試料を分析し、それによりオリゴクローナルな免疫応答が実証された(図15)。この種のクローンの分布は、現行のゲルに基づく免疫グロブリンの特徴づけによるものでは不可能である。
CSFおよび血清試料。Clinical Immunology LaboratoryのOCBアッセイから廃棄試料を収集した。
方法。日常的な臨床PEL/IFE検査により以前に分析された血清試料556個をMADLI-TOF MS(Microflex LT, Bruker Daltonics)により評価した。分析前に、Capture Select(商標)(Hu)LC-カッパおよびLC-ラムダ親和性樹脂(Life Technologies)を用いて血清から無傷の免疫グロブリンを単離し、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP-HCl, Thermo Scientific)で還元した。ドライドドロプレット法およびマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸を使用して、精製した試料をMALDI-TOF分析用に調製した。正イオンモードでレーザー500ショットを合計して質量分析を行った。
異なる免疫グロブリンアイソタイプに対して親和性を有する単一ドメイン抗体フラグメントから溶離したタンパク質を分析することによってマススペクトルを生成した。簡潔には、健康な成人の血清試料43個から各アイソタイプについてアイソタイプ特異的なm/z分布を引き出すために使用されるマススペクトルを生成した。試料を1×PBSで10倍希釈した(患者試料100μL+1×PBS 900μL)。各単一ドメイン抗体フラグメント(IgG、IgA、IgM、カッパおよびラムダ定常領域をターゲティングする)10μLをアガロースビーズ(50%ビーズ+50% 1×PBS)と結合させたものを希釈済み試料200μLに添加し、RTで30分間インキュベートした。上清をビーズから除去した。次にビーズを1×PBS 200μL中で2回、次に水200μL中で2回洗浄した。次に50mM TCEPを有する5%酢酸80μLをビーズに添加し、RTで5分間インキュベートした。次に、マトリックス0.6μL(α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸)をスポットした96ウェルMALDIプレート上の各ウェルに上清0.6μLをスポットした。続いて、さらなるマトリックス0.6μLを試料の上にスポットする。MALDI-TOF質量分析計を使用して正イオンモードでレーザー500ショットを合計して質量分析を行う。質量/電荷(m/z)範囲9,000〜32,000m/zを取得した。次に、各SDAFについて生成したマススペクトルを重ね合わせ、軽鎖および重鎖レパートリーによって占有されている特異的m/z領域を有する異なるピークの存在により、Mタンパク質を検出およびアイソタイピングした。
本発明がその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例証目的であって、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。他の局面、利点、および改変は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (18)
- 以下の段階を含む、試料中の免疫グロブリン軽鎖の総量を検出するための方法:
(a)免疫グロブリン、対形成した免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖、またはそれらの混合物を含む生物学的試料を提供する段階;
(b)該試料を免疫精製する段階であって、該免疫精製が、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgA抗体、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIgD抗体、抗ヒトIgE抗体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される抗体の使用を含む、段階;
(c)免疫グロブリン軽鎖を免疫グロブリン重鎖から切り離す切り離し段階に、免疫精製された試料を供する段階;
(d)切り離された試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階であって、該マススペクトルが、試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に対応する1つまたは複数のピークを含み、該1つまたは複数のピークが、試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリン軽鎖の総量を定量化する、段階;ならびに
(e)試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖の総量を参照値と比較する段階。 - 参照よりも高い総量が、対象が多クローン性高ガンマグロブリン血症を有することを示す、請求項1記載の方法。
- 試料中の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖および免疫グロブリンラムダ軽鎖の総量が、参照値よりも少なくとも2倍多い、請求項1または2記載の方法。
- 段階(c)の後に、試料中のカッパ免疫グロブリン軽鎖とラムダ免疫グロブリン軽鎖の比を求める段階をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 免疫精製する段階が、抗ヒトカッパ抗体、抗ヒトラムダ抗体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される抗体の使用をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が非ヒト抗体である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 非ヒト抗体が、ラクダ抗体、軟骨魚類抗体、ラマ、ヒツジ、ヤギ、またはマウス抗体のうちの少なくとも1つである、請求項6記載の方法。
- 抗体が単一ドメイン抗体フラグメントである、請求項7記載の方法。
- 単一ドメイン抗体フラグメントが、ラクダ抗体、軟骨魚類抗体、ラマ、マウス抗体、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体に由来する、請求項8記載の方法。
- 単一ドメイン抗体フラグメントについて段階(d)で生成されたマススペクトルが、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖について段階(d)で生成されたマススペクトルと重複しないように、該単一ドメイン抗体フラグメントが選択される、請求項9記載の方法。
- 単一ドメイン抗体フラグメントが、段階(d)において単一電荷を有する約12,500〜約15,000m/zのシグナルを生成するように、該単一ドメイン抗体フラグメントが選択される、請求項10記載の方法。
- 免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を含む試料が、単一分析で単一画分として分析される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 試料中の免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖との対形成を決定する段階をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 試料中の1種または複数種の免疫グロブリン重鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 試料中の1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖をアイソタイピングする段階をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 1種または複数種の免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖を同定する段階をさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、試料中の免疫グロブリン軽鎖の総量の検出を含む、対象における高ガンマグロブリン血症の処置をモニタリングするための方法:
(a)処置前の対象からの第1の生物学的試料および処置中のまたは処置後の第2の生物学的試料を提供する段階であって、試料がともに、免疫グロブリン、対形成した免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖、またはそれらの混合物を含む、段階;
(b)各試料を免疫精製する段階であって、該免疫精製が、抗ヒトIgG抗体、抗ヒトIgA抗体、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIgD抗体、抗ヒトIgE抗体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される抗体の使用を含む、段階;
(c)免疫グロブリン軽鎖を免疫グロブリン重鎖から切り離す切り離し段階に、免疫精製された各試料を供する段階;
(d)切り離された各試料を質量分析技法に供して、該試料のマススペクトルを得る段階であって、該マススペクトルが、試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖に対応する1つまたは複数のピークを含み、該1つまたは複数のピークが、試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリン軽鎖の総量を定量化する、段階;ならびに
(e)第2の試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖の総量を、第1の試料中の1種または複数種の無傷の免疫グロブリンカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖の総量と比較する段階。
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