JPS63139199A - 抗ヒトＩｇＥモノクロ−ナル抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒトＩｇＥに対して特異的に反応する抗ヒ
トＩｇＥモノクローナル抗体に関する。

また、本発明は」−記抗体を用いるヒトＩｇＥの免疫化
学的測定法及びそのためのキットに関するものである。

〔従来の技術〕

免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は石板ら〔ＬＩｍｍｕｎｏ
ｌｏＢｚ、　９７．７５（１９６６））により１９６６
年に発見されて以来、その生物学的意義及び免疫化学的
性状が急速に明らがκされてきた。特にＩｇＥが、アレ
ルギー疾患における重要な指標となることから、血中Ｉ
ｇＥ量の測定は臨床検査上非常に重要な項目である。現
在まで、このＩｇＥの測定に使用する抗体としては、ヒ
トＩｇＥを用いて動物を免疫して得た抗血清を使用して
きた。しかし、この抗血清は、元来、問題とする抗原以
外の抗原に対する抗体を比較的大量に含むものであり、
特異的な抗体の含量は必ずしも高くなく、目的以外の抗
原との交叉反応性も大きい。しかも、目的の抗原に対す
る抗体であっても、それぞれ特異性の異なる多くの抗体
の混合物（ポリクローナル抗体）であり、均一な抗体分
子から成る抗血清を得ることは不可能である。また、そ
の供給源を動物の血清とすることから抗血清を大量に調
製するのが事実上不可能である。

一方、細胞融合技術（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５
−４９７（１９７５）　）が紹介されて以来、この技術
を用いて種々の抗原に対するモノクローナル抗体が作製
されてきた。この技術を用いることにより、前述のよう
な問題点が解消され、目的の抗原に対して特異性の高い
単一の抗体を大量に調製することが可能となった。ヒト
の免疫グロブリンに対するモノクローナル抗体も作成さ
れ報告されている〔東ドイツ特許１１に２３０８’８４
．隘２３０Ｂ７８．隔２３０８７９等〕。

一般に、ＩｇＥは重鎮（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）から
成り、重鎮はＩｇＥとしての特徴を表現するε鎖である
。軽鎖は、に及びλの２種類の型が存在し、従ってＩｇ
Ｅはその軽鎖によって２つの型（ＩｇＥ／に）、（Ｉｇ
Ｅ／λ）に分類することができる。そして、ヒトＩｇＥ
に対するモノクローナル抗体も知られているが（上記文
献）ＩｇＥの軽鎖による差異を認識できるモノクローナ
ル抗体は知られていない。

ＩｇＥはアレルギー疾患における重要な指標となること
から、血中［ｇＥ？ｆｆ１度の測定は臨床検査上非常に
重要な項目である。現在まで、このヒトＩｇＥの免疫学
的測定に使用する抗体としては、ヒトＩｇＥで動物を免
疫して得た抗血清を用いてきた。しかし、この抗血清は
、ポリクローナル抗体が有する前記のごとき欠点を有し
、特に、不溶性担体に結合させて試料中の抗原と反応さ
せ、これを固相に捕捉する為の抗体として用いる場合、
この交叉反応性が問題となる。モノクローナル抗体を用
いることによって、このような欠点を解消することが可
能となり、目的の抗原に対して高い特異性をもつ測定法
が確立されている。モノクローナル抗体を不溶性担体に
結合して作製した同相を用いることでヒトＩｇＥのみを
試料中がら捕捉することが可能で、これを例えばパーオ
キシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥ抗体で検出測定することに
よりＩｇＥを測定することは知られている（Ｍｅｔｈ。

ハ又戸悼よ、７０．４１９（１９８０）、米国特許Ｎｏ
、４５３９２９２特開昭６０−１０８７５５等〕。

しかしながら、このような方法によっては、Ｌ鎖がに型
であるＩｇＥ（に型ＩｇＥ）を測定しているのか又はＬ
鎖がλ型であるＩｇＥ（λ型ＩｇＥ）を測定しているの
か、あるいはこれらの両者を測定しているのか明らかで
なかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、に型１ｇＢ及びλ型ＩｇＥに対する反
応性が明確にされているモノクローナル抗体、並びにこ
の様なモノクローナル抗体を使用してに型１ｇＢ及びλ
型ＩｇＥを判別測定することができる免疫化学的測定方
法及びそのためのキットを提供しようとするものである
。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者等は、前記の特徴を有するモノクローナル抗体
を造成すべく、細胞融合技術を用いて融合細胞を得、こ
れをスクリーニングすることによって、上記特徴を有す
るモノクローナル抗体を産生ずる融合細胞を選択するこ
とに成功し、この発明を完成した。

従ってこの発明は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に
対して特異的に反応することを特徴とする抗ヒＩ−１ｇ
　Ｅモノクローナル抗体；ヒト免疫グロブリンＥ（Ｉｇ
Ｅ）の免疫化学的測定法であって、（１）ヒｌ−１ｇＢ
に対して特異的に反応する第１の抗ヒトＩｇＥ抗体を固
定化した固体担体とヒトＩｇＥを含有すると予想される
測定対象試料とを接触せしめる段階、（２）前記段階（
１）と同一の段階又は異る段階として、前記固体担体を
、前記第１の抗ヒト■ｇＥ抗体と結合するＩｇＥの抗原
決定基と異る抗原決定基に結合する標識された第２の抗
ヒトＩｇＥ抗体と接触せしめる段階（これら第１の抗ヒ
トＩｇＥ抗体及び第２の抗ヒｌ−１ｇ　Ｅ抗体の内生な
くとも一方はモノクローナル抗体である）、及びに、（
３）前記固体担体に固定された標識、又は固定されなか
った標識を測定する段階を含んで成る方法；並びに、ヒ
ト免疫グロブリンＥ（ＴｇＢ）に対して特異的に反応す
る抗ヒＩ−ｒ　ｇ　Ｅモノクローナル抗体、又は固体担
体に固定化された前記モノクローナル抗体を含んで成る
ヒトＩｇＥ測定用キットを提供する。

〔具体的な説明〕

１、　モノクローナル抗体の製造 この発明に係るモノクローナル抗体の製造は、以下の通
りである。まず、■動物をヒトＩｇＥで免疫することに
より抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍細胞とを
融合させることによりハイブリドーマを得、そして■前
記の特徴を有する抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを選択する。そして■このバイプ
リドーマを培養して、■培養物から目的とする抗ヒトＩ
ｇＥモノクローナル抗体を得る。なお、上記の一般的方
法それ自体は公知であり、例えば、特公昭５Ｂ−４５４
０７、特開昭５９−１２８３９７号各公報及びＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　３９２８５〜３
０８（１９８０）等に従って行うことができる。

（１）抗原 本発明のモノクローナル抗体を産生ずる細胞を調製する
ための免疫原としてはヒトＩｇＥを含有する任意の材料
を使用することができ、例えばヒトＩｇＥミエローマＩ
［［Ｊ’？、Ｉ　ｇ　Ｅミエローマ細胞（例えばＳＫＯ
−００７細胞）の培養液、後に具体的に記載するように
して遺伝子工学的に製造したヒトＩｇＥ等を使用するこ
とができる。

（２）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞は、動物を抗原で免疫したのち肺細胞を摘
出し公知の方法〔例えば、底置Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅ
ＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、　７３．１４（１９８］）アカデ
ミツクブレス刊を参照のこと〕に従って調製することが
できる。また、試験管内でＢリンパ系細胞を抗原で感作
することによっても調製できる〔特願昭５９−２１２５
７８号「抗体産生細胞の調製法」参照〕。

本発明においては、例えばマウスの腹腔内に前記のよう
な抗原を投与したのち（初回免疫）、１０日後に免疫操
作（追加免疫）を行い、最終免疫から３日後に動物から
肺細胞を摘出後、抗体産生細胞を調製する。

（３）細胞融合 上記で調製した抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合剤の存
在下で融合させ継代培養可能なハイブリドーマを得る工
程である。このような細胞融合操作はＮａｔｕｒｅ（前
記）　、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（前
記）、底置「単クローン抗体−ハイブリドーマとＥＬＩ
Ｓ八」ｐ５０〜６０講談社サイエンティフィク刊等を参
照して行うことができる。本発明の場合は、例えば、上
記抗体産生細胞と腫瘍細胞ｆ１３−Ｘ６３−ＡｇａＵ＋
　（Ｐ、Ｕｌ）［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯ
ＬＯＧＹ、７３．３−４６　（１９８１））との融合を
ＲＰＭＩ−１６４０培地中、約４０％ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）存在下で行う。

（４）ハイブリドーマの選択 所望ハイブリドーマの選択は、まず本発明で用いたＰ３
υ１のような腫瘍細胞である場合、ＨＡＴ培地（ヒボキ
サンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含量するＲ
Ｐｌ’１ｌ−１６４０培地）　５ｃｉｅｎｃｅ、１４５
　＋７０９（１９６４）　）で行う（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、７３゜１６〜１８（１９
８１））。

ついで上記操作で得られたバイプリドーマをさく１２） らに培養し培養上清の分析（抗体の存在の確認）を行う
ことにより所望抗体を産生じているハイブリドーマを選
択する。培養上清の分析は、プラーク法、凝集反応法、
ラジオイムノ・アッセイ法等があるが、簡便なものとし
て通常はＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺ
ＹＭＯＬＯＧ’／、７０　、４１９−４３９（１９８０
）等〕によって行われる。

（５）ハイブリドーマの培養 常法に従ってハイブリドーマを生育培地〔例えばＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地（１０〜２０％ウシ胎児血清（ＦＣ８
含有）〕中で培養するか（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮ
ＺＹＭＯ−ＬＯＧＹ、　７３　、４２−４３（１９８１
））あるいは、ハイブリドーマをこの細胞が増殖可能な
実験動物（マウス、ラット等）の腹腔内に投与し生体内
で培養することにより行う　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
［ＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、？’３　、４３−４４（１９８
１））。

（６）抗体の回収 抗体は、常法に従って生育培地でハイブリドーマの生育
を行った場合は培養上清より、また、実験動物の生体内
でハイブリドーマの増殖を行った場合は動物の腹水より
、常法（例えば硫安分画法）に従って回収することがで
きる。さらに、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ
ィー法、アフイニティ力うムクロマトグラフィー法、あ
るいはこれらを適宜組み合わせることにより高抗体価の
精製標品を得ることができる〔底置ｒＭＯＮＯｃＬＯＮ
ＡＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ］４０５（１９８０）、Ｐｌ
ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ刊〕。

豆り侍異牲Ω薙ル 造成したモノクローナル抗体の特異性の確認はＩｇＥを
固定化した系を用いる前記ＥＬＩＳＡ法に従って行なう
ことができる。交叉反応性の確認には、ＥＬＩＳＡ法を
用いることができる。この場合、固定化した抗原として
、ヒト血弱、ヒト血清ガンマグロブリン分画、ヒトＩｇ
Ｇ、Ｉ　　ｇＭ、ＴｇＡ。

Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパク質（に型およびλ型）
を用いる。

２、モノクローナル−の生 本発明のモノクローナル抗体の性質を、実施例において
具体的なデータとして示す。

この発明のモノクローナル抗体はヒト血漿、ヒトγ　グ
ロブリン画分、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ。

１　ｇ　Ａ　、　　Ｈｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパク（
に型）および（λ型）などのヒトＩｇＥ以外の血清タン
パクとはまったく反応セす、ＩｇＥに対する特異性の高
いものである。

この発明のモノクローナル抗体は、に型ＩｇＥ及びλ型
ＩｇＥの両者に対して反応するもの、及びこれらの内の
いずれか一方とのみ特異的に反応するものを包含する。

このことは、実施例３において詳細に説明する。

本発明のヒト■ｇＥの測定方法においては、種々の免疫
測定法を用いることができる。代表的な例として次の方
式を挙げることができる。

（１）■本発明の測定方法の測定対象であるヒトＩｇＥ
と結合することができる第１の抗体を固体用体に結合せ
しめ、これを測定対象試料液と接触−１しめる。これに
より試料液中の測定対象ヒトＴｇＢが固体担体に結合し
ている抗体と結合して該ヒトＩｇＥが固定化される。■
さらに、前記測定対象ヒｌ−ＩｇＥの前記の抗原決定基
以外の抗原決定基と結合する標識された第２抗体と接触
せしめる。■と■は同一段階として、又は別個の段階と
して行うことができる。これにより標識された第２抗体
が測定対象ヒトＩｇＥの量に依存して固体担体に固定化
される。０次に、固体担体に固定化された標識、又は固
定化されなかった標識をその標識の種類に依存して選ば
れた方法により測定する。

（２）前記（１）の方式の段階■を行った後、■前記の
第２抗体と同様の抗体であるが標識されていないものと
接触せしめ、さらに■この標識されていない第２抗体に
対する抗体（第３抗体）であって標識されているものと
接触せしめ、■次に固体抗体に固定化された標識又は固
定化されなかった標識を測定する。

抗一体 本発明の方法の第１の方式によれば第１抗体及び標識さ
れた第２抗体を用いる。これらは両者と（Ｉ６） も本発明のモノクローナル抗体であることができ、ある
いは一方がモノクローナル抗体で他方がポリクローナル
抗体であることができる。

このポリクローナル抗体は公知の常法に従って調製する
ことができる。例えば、ヒトＩｇＥを含有する材料を免
疫原として実験動物（マウス、ラット、ウサギ等）に注
射して生体内でその抗原に対する抗体を産生させたのち
採血し、この血液中の血球・フィブリンを除いて血清を
得、さらに必要であればＤＥＡＥセルロースカラムクロ
マトグラフィー等の常法に従って精製することにより、
ポリクローナル抗体を得ることができる。

本発明の第２の方式によれば、前記の第１抗体及び第２
抗体のほがκ、第２抗体に対する抗体（第３抗体）であ
って標識されているものを使用する。この第３抗体とし
ては、例えば第２抗体としてウサギ抗体を使用する場合
には、ヤギ抗ウサギ抗体を使用することができる。これ
は市販品を用いることができる。

上記のような測定において、モノクローナル抗体として
、に型ＩｇＦ、及びλ型ＩｇＥの両者に対して反応する
ことができる抗ヒト−ＩｇＥを使用することによりに型
ＩｇＥ及びλ型ｔｇＥの合計量を測定することができ、
他方に型ＩｇＥのみと特異的に反応する抗ヒトＩｇＥモ
ノクローナル抗体を使用することにより試料中のに型Ｉ
ｇＥのみを特異的に測定することができ、同様にしてλ
型ＩｇＥのみと特異的に反応する抗ヒトＩｇＥモノクロ
ーナル抗体を使用することにより試料中のλ型ＩｇＥの
みを特異的に測定することができる。

また、上記３種類の抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の
内、２種類を用いる２つの測定を行うか、又は３種類を
用いて３つの測定を行い、これらの結果を比較すること
により、試料中に存在するＩｇＥがに型であるか、λ型
であるか、又はこれらの混合物であるかを判定すること
ができる。

、ｉ　びその　　　法 本発明においては、第２抗体、又は第３抗体のいずれか
を標識して使用する。・この標識としては、免疫化学的
測定法において常用されている任意の標識を使用するこ
とができ、例えば放射性同位元素、例えば＋３１　■、
　　１３３１　、１４ｃ　、　　：ｌＨ等（ラジオイム
ノアッセイ；ＲＩＡ）；酵素、例えばパーオキシダーゼ
（例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ）、アルカリホス
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等（エンザイムイム
ノアソセイ；ＥＩＡ）；螢光物質、例えばフルオレソセ
インイソシアネート、ローダミン等（フルオロイムノア
ッセイ；ＦＩＡ）等を使用することができる。これらの
標識を抗体等の蛋白質に付加する一般的方法はすでに知
られており（例えば、Ｊ、　１ｌｉｓｔｏ。

Ｃｈｅｗ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、２２　、１０８４（
１９７４）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｏｒｙ、　
６　、４３（１９６３）　、　１ｂｉｄ、　！、８７Ｈ
１９７１）　、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７８　、２３５（１９７５）　、
および底置ｒＦ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　ＭｅｔｈｏｄｓＪアカデミツク・プレス刊等を参照
のこと〕、それらの方法を本発明において使用すること
ができる。

また、これらの標識の検出方法としては、これらそれぞ
れの標識について常用されている検出方法を用いること
ができる。

例えば、標識として酵素を用いる場合、その基質として
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼに対しては過酸化
水素、アルカリホスファターゼに対してはパラニトロフ
ェノール・リン酸やフェノール・リン酸、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼに対してはオルトニトロフェノール−β−
Ｄ−Ｘガラクトシドが考えられる。

皿体担体 本発明においては、第１の抗体を固体担体に固定化して
使用する。このような固体担体として、免疫化学的測定
法において常用されている任意の材質及び形状の固体担
体を使用することができる。

材質としては例えばポリスチレン、ポリカーボネート、
アミノアルキルシリルガラス、シリコンゴム等があり、
形状としてはマイクロプレート、チューブ、キュヘット
、ビーズ、スティック、ロッド、ディスク等がある。

ｍ昼（ハ）友鼾 本発明においては、前記の各種の材料の他に種々の試薬
が使用される。例えば、第１抗体を固体担体にコートす
るためにコーティング緩衝液が使用され、この緩衝液と
しては、例えば炭酸緩衝液（ｐＨ９，７〜１０．０）　
、ＰＢＳ　（−）等を使用することができるが、これに
限定されない。また、分析サンプル中のヒトＩｇＦ、の
濃度を測定可能な範囲内にするために稀釈用緩衝液が使
用され、この緩衝液としてウシ血清アルブミンを含有す
る場合があるＰＢＳ　（−）　、生理食塩水、トリス緩
衝液等を使用することができる。さらに、測定実施の各
反応段階において固体担体を洗浄するために洗浄液が使
用され、このために例えばＰＢＳ　（−）−Ｔｗｅｅｎ
　（ＰＢＳ　（）にＴｗｅｅｎ　２０を０．０５％濃度
に溶解したもの〕を使用することができる。さらに、標
識として酵素を使用する場合、使用する酵素の種類に応
して基質溶液が使用される。この基質として例えば前記
したものを使用することができる。基質溶液を調製する
だめの緩衝液としては、標識として使用する酵素の種類
により異るが、例えば０．１Ｍクエン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、等を使用することができる。

揮１ｙ運線施 第１抗体を固体担体に固定化するためには公知の方法を
用いることができる。例えば、第１抗体を前記のコーテ
ィング緩衝液に０．１〜１００μｇ／ｍ１の濃度に溶解
し、これを固体担体に適用し、そして０℃〜３７℃にて
０．５〜１６時間インキュベートする。次にコーティン
グ溶液を除去し前記の洗浄液で数回洗浄する。

測定に当っては、必要に応じて測定用サンプルを前記の
稀釈用緩衝液により稀釈する。本発明の方法の測定感度
は１０　Ｉ　Ｕ　−１００１Ｕ／ｍ＃であるから、サン
プル中のヒトＩｇＥ濃度が１０〜１００１Ｕ／ｒｒｌと
なるように稀釈するのが好ましく、サンプル中のヒトＩ
ｇＥ？ａＫ度が予測できない場合には複数段階の稀釈液
を調製し、これらを使用するのが好ましい。

次に、必要に応じて上記のように稀釈されたサンプルと
第１抗体が固定化されている固体担体と接触せしめ、イ
ンキュベートする（第１段階）。

このインキュベーションは０℃〜３７°Ｃにて３０〜１
２０分間行うのが好ましい。次にサンプルを除去し、前
記洗浄用液により固体担体を数回洗浄することにより固
体担体に非特異的に付着しているサンプルを除去する。

次に標識された第２抗体の溶液を前記洗浄された固体担
体と接触せしめることにより、第１段階において固定化
されたヒトＩｇＥと第２抗体とを特異的に結合せしめる
。固体担体と接触せしめる第２抗体の溶液中の第２抗体
の量が固体担体に固定化されたヒｌ−ＩｇＥの量に比べ
て過剰となることを条件として、第２抗体溶液中の第２
抗体の濃度及び該溶液の使用量は任意に選択することが
できる。第２抗体溶液中の第２抗体の濃度は好ましくは
１〜１０１　Ｕ／ｒ＋１である。

上記の方法に代えて、第１段階と第２段階とを同一段階
として実施することができる。この態様においては必要
に応じて稀釈されている場合があるサンプル溶液と上記
第２抗体溶液とを混合して固体担体に適用するか、又は
これらの溶液のそれぞれを同時に固体担体に適用するこ
とにより行うことができる。この場合、０℃〜３７°Ｃ
にて３０〜１２０分間インキユヘートするのが好ましい
。

次に、抗原に結合していない第２抗体等を除去するため
、前記の洗浄用液によって固体担体を洗浄する。

次に、固体担体上に固定化された標識を定性的又は定量
的に測定する。この測定方法は標識の種類によって異り
、常法に従って行うことができる。

例えば、標識が放射性同位元素である場合、液体シンチ
レーションカウンター、オートガンマ−カウンター等を
用いて放射能を測定する。また、標識が螢光物質である
場合、螢光量を分光光度計を用いて測定する。さらに、
標識が酵素である場合、その酵素の基質溶液を前記固体
担体と接触せしめる。例えば、標識として西洋ワサビパ
ーオキシダーゼを用いる場合、基質としての５ｍＭ過酸
化水素及び発色剤としての２，２′−アジノビス（３−
エチルヘンジチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ
と略す）２．５ｍＭを含む０．１　Ｍクエン酸緩衝液を
用いるのが好ましい。

次に、例えば室温で５〜１５分間イ分間インキュナート
とにより酵素反応と発色を行い、反応を停止した後発色
の程度を常法に従って測定する。

測定された標識活性から抗原濃度を知るには、常法に従
って予じめ標準抗原と最終段階での標識活性との関係か
ら検量線を作成しておき、この検量線と被検液の吸光度
とを照合すればよい。

なお、前記の標識された第２抗体の代りに、標識されて
いない第２抗体及び標識された第３抗体を用いることも
できる。

泄４Ｕ肪［ヱ」□ 本発明の第１の態様のキットは前記第１抗体としての抗
ヒトＩｇＥ抗体調製物を含んで成り、第２の態様のキッ
トは前記第１の抗体を固定化した固体支持体を含んで成
る。第２の態様のキットは第１抗体が固定化された固定
担体を含むのに対して、第１の態様のキットは固定化さ
れていない第１抗体を含み、第１抗体の固体支持体への
固定化はキットの使用者によって行われる。

これらのキットはさらに第２抗体としてのラヘルされて
いる場合がある抗ヒｌＩｇＥ抗体を含むことができるが
、このようなポリクローナル抗体は市販されており、容
易に調達できるから、必ずしも本発明のキットに含める
必要はない。

これらのキットはさらに、第３抗体を含むことができる
。しかしながら第３抗体は市販品を使用することができ
るため、必ずしも本発明のキットに含める必要はない。

また、第１の態様のキットには固体担体を含めることが
できるが、これも常用の市販品を使用することができる
から、本発明のキットに含める必要がない。

前記第１抗体く第１の態様の場合）、第２抗体、第３抗
体は、固体標品であってもよく、すくに使用することが
できる溶液の形であってもよく又、測定に際して適当に
稀釈して使用する濃厚溶液の形であってもよい。キット
が、これらを溶液の形で含む場合、この溶液には測定に
悪影響を与えない防腐剤を加えることができる。

この発明のキットは、上記のものを含んで成るが、測定
の便宜のために前に記載した他の試薬、例えば稀釈用溶
液、コーティング緩衝液、洗浄用溶液、標識が酵素であ
る場合には酵素基質及び発色試薬等を含むことができる
。しかしながらこれらは、測定者において常法に従って
容易に調製することができ、又は入手することができる
ものである。従ってこれらを含まないキットも本発明の
範囲内のものである。

〔発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体は、ヒｌ−１ｇ　Ｅと特異
的に反応し、他の血清成分とは反応しないので、ヒトＩ
ｇ、Ｅ測定用として臨床検査、診断に、使用することが
できる。さらには、ＩｇＥの軽鎖による特異を認識でき
るので、軽鎖の型の違うヒトＩｇＥの測定に使用するこ
とができる。

実瀞１エ　ハイ１親」畳ゴ連グ肛盟 （１）免疫化細胞の調製 Ｂａ１ｂ／Ｃマウスに、ヒトＩｇＥミエローマ血清（約
２０ｍｇ／ｍｎのＩＣＥを含む）より得たＩ　ｇＥＩ　
０８ｇをフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジユハン
ト（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と供に腹腔
内投与し、初回免疫後１００日目追加免疫として、１゜
ｐｇ　Ｉ　ｇＥをＦｒｅｕｎｄの１ｎｃｏｌＩｌｐｌｅ
ｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔと供に投与した。

最終免疫終了後３日目にマウスより牌細胞を無菌的に摘
出し、この細胞をほくしてＩＩＰＭＩ−１６４０培地に
懸濁したのち、ナイロンメソシュで濾過することにより
マウス牌細胞懸濁液（２Ｘ１０６個／ｍ７りを調製した
。

一方、上記細胞と融合させるマウス腫瘍細胞Ｐ３Ｕ１（
７０−社）の懸濁液（ＲＰＭＩ　−１６４０培地）を常
法に従って調製した。

（２）細胞融合 上記で調製したマウス牌細胞懸濁液とＰ３旧細胞懸濁液
とを、牌細胞とＰ、＋０１細胞との細胞数の比が１０：
ｌの割合になるように混合したのち遠心し、上清を除去
した。ついで遠心管底部の細胞に約４０％Ｐ　Ｅ　０４
０００含有ＰＢＳ　（−）溶液１ｍｌをゆっくり滴下し
た。これを４分間、３７℃で静置したのら、ＲＰＭＩ−
１６４０（１０％ＦＣ３含）を添加するごとによりＰＥ
Ｇを稀釈した。ついで遠心して上清を除去したのち、最
終的にＰ、１１１細胞の濃度が１．０Ｘ１０５個／　ｍ
　ＩｔになるようにＲＰ旧−１６４０（１０％ＦＣ３含
）で稀釈後、９６ウエルのプレートに１００μｌ／ウエ
ルの割合で分注した。なお、このプレートには予めフィ
ーダー細胞として３週齢以内のＢａ　１１　ｂ／ｃマウ
スの胸腺細胞を５Ｘ１０’個／ウェルの割合で１００μ
７！／ウエルずつ分注しておいた。

（３）ハイブリドーマの選択 上記融合操作の翌日から４日間毎日各ウェルの培地の半
量（１００μ７りずつをＨＡＴ培地に交換し、さらに、
１日おきにＨＡＴ培地により培地の交換を行いながら１
０日間培養を行った。なお、上記ＨＡＴ培地は、ＲＰ旧
−１６４０培地に１００μＭヒポキサンチン、０．１μ
Ｍアミノプテリン、１．６μＭチミジン、１０％ＦｃＳ
、５　ｘ　Ｉ　Ｌ５Ｍ２−メルカプトエタノール、２ｍ
Ｍグルタミン、　１００ユニツト／ｍＩ２ペニシリン、
及び０．１ｍｇ／ｍ１ストレプトマイシンを添加したも
のである。

また、ＰＢＳ　（−）は、塩化ナトリウム８．０ｇ、リ
ン酸二水素カリウム（無水）０．２ｇ、リン酸−水素ナ
トリウム（無水）　１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ
を混合し１０００ｍ＃にしたものである（ｐｌ＋７．４
）。

ついで培養上清の分析を以下の手順で行った。

（ｉ）分析用プレートの調製 ９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ社）の各ウェルごとに、
ＩｇＥミエローマ血清８０００倍稀釈液（含まれるＩｇ
Ｅは約２．５　ｐ　ｇ　／ｍｊ＋となる）５０．１！ず
つを注入し、室温で２時間静置１ＰＢｓ　（−）−Ｔｗ
ｅｅｎ　　（前記ＰＢＳ　（−）にＴｗｅｅｎ　２０を
０．０５％になるように添加したもの）で３回洗浄した
のち１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３００μｌを加
え室温２時間放置し、次いでＰ　Ｂ　Ｓ　（−）　−Ｔ
ｉｖｅｅｎで３回洗浄し分析用プレートとした。一方、
ＩｇＥの代りにヒト血漿稀釈液を同様にプレートに固定
し分析用対照プレートとじた。

（１１）上清の分析 コロニーの出現したウェルの上清をとり、上記の分析用
プレートの分析用ウェル及び対照用ウェルに５０μｌ／
ウエル添加した。２時間放置後、ＰＢＳ　（−）−Ｔ騨
ｅｅｎで３回洗浄したのちパーオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウス免疫グロブリン（カペル社）５０μｌ／ウエル添
加し、そして２時間インキュベートを行った。Ｐ　Ｂ　
Ｓ　（−）　−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄したのち、酵素活
性測定のため基質として０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，２）に＾ＢＴＳ（２，２’−アジノビル（３−エチ
ルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸）２．５ｍＭと
過酸化水素水５ｍＭとを溶解したものを使用直前に調製
し、これを１００μｌ／ウエルの割合で注入後室温で５
〜１５分間反応を行った。ついで反応を停止（２ｍＭア
ジ化ナトリウムを１００μβ／ウエルで添加）したのち
タイターチック・マルチスキャンＩｌ（フロー社）でＯ
Ｄ　ａ。５０ｍを測定した。

この結果、ヒＩ−ＩｇＥに特異的に反応する抗体を含む
ウェルは３０００ウエル中３０ウエルであった。

次いで、この３０種のウェルを再度９６ウエルプレート
に細胞３個／ウェルでまいて、出現するコロニーの抗体
の反応性を調べ、１２ケのハイブリドーマを選択した。

これらについて、限界稀釈法にてクローニングして、５
ケのハイブリドーマを選択した。

（４）ハイブリドーマの培養および抗体の回収得られた
５種類のハイブリドーマを各々ＲＰ旧−１６４０（１０
％ＦＣ３含）培地中、３７℃、５％炭酸ガスの存在下、
炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養上清から
硫安分画法により抗体を回収した。なお、これらの抗体
の特徴づけを行った結果を第１表に示す。

実薯貫主　背薯１犯η九定 本発明で得られたハイブリドーマ由来のモノクローナル
抗体についてヒト血清成分に対する特異性を調べた。方
法は、実施例１と同様のＥＬｌＳＡ法によった。すなわ
ち、ヒト粗ＩｇＥ、ヒト血漿、ヒトガンマグロブリン画
分、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ。

Ｉ　ｇ　Ａ　、、Ｒｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパク（に
型およびλ型）を９６ウエルプレートに固定化した。次
いで１％ＢＳＡ溶液でブロックして作成した分析用プレ
ートの各ウェルに本発明のモノクローナル抗体を入れ室
温で２時間反応させた。その後は実施例１と同様にして
分析を行った。そのときの結果を第２表に示す。

以下余白 第一」Ｌ□表 ＋：反応したちの；−：反応しないもの（）内のに、λ
は、使用した抗原としての免疫グロブリンの軽鎖のタイ
プを示す。

ｍ−↓　モノクローナル−の　　伊 各モノクローナル抗体の特徴付けを行なうため各モノク
ローナル抗体のＩｇＥ認識部位の異同を３周べた。

（１）抗体の１２５Ｉ−標識 Ｎａ”５１０．５ｍ　Ｃ１（５μ４！　）、（アマジャ
ム）に、０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　５μｌ
を添加し、これに、抗体２５Ｂ４５μｆｆ（２，９μｇ
／ｎｕ）と、クロラミンＴ　（１ｍｇ／ｒｒｌ　）　　
１０μβを加え１分間室温で反応させた後、ＮａｚＳ２
０：＋（１ｍｇ／ｍｊＪ　　１０１２を加え、１分間反
応させた。

０．２％ＢＳＡ１ｒｌ！を添加して全量を５ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ２５　（ｌ　Ｘ２０ｃｍ）カラムにかけ１２５Ｉ
−標識２５Ｂ　４．　（３，５ＸＩＯ’　ｃｐｍ　／　
２．８　ｍｌ）を得た。

（２）競合ラジオイムノアッセイ １２５Ｉ−標識した２５Ｂ４を６０　、　ＯＯＯｃｐｍ
　／　５０　＃　ｊ！に調製し、非標識抗体（７Ｄ５．
１０Ｂ４．１３Ｃ７゜２５Ａ　３．２５Ｂ　４）と種々
の量比（１対１，５，１０゜５０及び１００）で混合し
、２５μｇ／ｍ７！のＩｇＥを含むミエローマ血清を固
定化した９６ウエルプレートに入れ２時間反応を行った
。ついで、ＰＢＳ　（−）−Ｔ騨ｅｅｎで５回洗浄後Ｔ
カウンターにて各ウェルの残存放射能を測定した。

この結果は第１図に示す。

縦軸はウェル表面に固定したＩｇＥに結合した放射能Ｂ
と反応に使用した全放射能Ｔの比（Ｂ／Ｔ）であり、横
軸は１２５Ｔ　−２５８４と非標識の各抗体との量比で
ある。

その結果、この５つの抗体は２つのグループに分けられ
ることがわかった。すなわち、２５Ｂ４と競合する２５
Ａ３（グループＡとする。）並びに、２５Ｂ４と競合し
ない７Ｄ５．１０Ｅ４及び】３Ｃ７（グループＢとする
。）に分けられる。そしてこれらの２つのグループは、
互いにＩｇＥのｖ２？ＪＡ部位が異なるものである。

フ【方り層ルー」ユ　モノクローナＪしｒ体の８周１夏
１０日前に予めプリスタン（２、６、１０，１４−テト
ラメチルペンタデカン）０．５ｒｒｌを腹腔に注入して
おいたＢａ１ｂ／ｃマウス（７−９週令、雄性）に、本
発明で得たハイプリドーマ各々を１０７個をＰＢＳ　（
−）０．５ｍｎに！！１．濁し腹腔投与した。

１０日から２週間程度でマウス腹水を回収した。

１匹のマウスから約５ｍｎの腹水が回収できた。

得られた腹水に最終濃度が５０％飽和になるように硫酸
アンモニウムを加え抗体を沈殿させた。

抗体がＩｇＭである７Ｄ５　、ｌ０Ｅ４．１３Ｃ７。

２５Ａ３は、この硫酸アンモニウム沈殿をＰＢＳ（＝）
に溶解し、ＰＢＳ　（−）に対して透析した。

ついで５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−３００（２，５Ｘ　１
００ｃＩ１１）にかけ４．５ｒｌ！／分画で分離し、各
分画について、ＯＤ　、２８０ｎｍ測定及びマウス抗体
の検出を行なった。

そのときのクロマトグラムを第２図（Ａ）に示す。

−・−はＯＤ　、２８０ｎｍを示し、−〇−は抗ヒトＩ
ｇＥマウス抗体の指標であるＯ　Ｄ　、４５０ｎｍを示
す。

第２図（Ａ）に示すごとく両分４０から５０付近のピー
クにモノクローナル抗体を回収することができた。なお
、マウス抗体の検出はＥＬＩＳＡ法で行った。すなわち
、９６ウエルプレートに２．５μｇ／ｍβのＩｇＥを含
むミエローマ血清を固定化し、これを１％ＢＳＡでブロ
ック処理後洗浄した。この分析用プレートに各両分の１
０００倍稀釈液を添加し、２時間反応を行なった。これ
を洗浄後、ホースラディツシュパーオキシダーゼ結合抗
マウス免疫グロブリンウサギ血清を添加して２時間反応
させた。その後ＰＢＳ　（−）−Ｔ圓ｅｅｎでよく洗浄
し、ＡＢＴＳ　、　ＩＩ□０□から成る発色液で発色さ
せＯＤ４０５ｎｍを測定した。このＯＤ値をもって抗ヒ
ト■ｇＥマウス抗体の検出とした。また、抗体がＩｇＧ
２ｂである２５Ｂ４については、硫酸アンモニウム沈殿
を２０　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１（ｃ４緩衝液（ｐｌ＋　
７．９　＞に溶解し、同緩衝液に対して透析した。この
透析物をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　　−Ｄ　Ｂ５
２カラム（φ２．５Ｘ１４ｃ＋ｉ）にかけ、同緩衝液で
洗浄後ＯｍＭから５００ｍＭ　ＮａＣＪの直線型濃度勾
配をかけて溶出した。以上の結果を第２図（Ｂ）に示す
。

同図中−・−１および一〇〜は（Ａ）の場合と同様ＯＤ
２８０ｎｍ　、および抗ヒトＩｇＥマウス抗体をそれぞ
れ示し、破線（画分４０から１２０まで）は、溶出用Ｎ
ａ１ｌの濃度勾配を示す。第２図（Ｂ）に示すごとく両
分７０付近のピークに抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体
を回収することができた。

実施桝−盈　Ｕの　なるＩ　Ｅの切− ａ）血清ＩｇＥ 軽鎖がに型およびλ型の２種類のＩｇＥを含む標準１ｇ
Ｂとしてヘキスト社のｒＥｎｚｙｇｎｏｓｔ　ＩｇＥ　
Ｊキット中の標準ＩｇＥを用いた。

ｂ）ＩｇＥの重鎖（ε鎖） ＩｇＥの重鎮であるε鎖については、参考例１に示す組
換えＤＮＡ技術を用いて調製した。

Ｃ）軽鎖がに型であるＴｇＢの調製 軽鎖がに型のＩｇＥについても、組換えＤＮＡ技術を用
いて調製した。参考例２の方法によった。

即ちヒト細胞からクローニングしたＩｇＥ重鎮遺伝子（
上記）をマウスミエローマ細胞に導入し、発現させた。

ＩｇＥ重鎮がその形質転換細胞内で生産されていること
を確認した後、ヒト抗体のに型軽鎖遺伝子をさらにこの
形質転換細胞に導入して、先の重鎮（ε鎖）とに鎖が結
合した完全な抗体として発現させ、培地中に分泌させた
。この細胞を大量に培養し、その培養上清からに型軽鎖
から成るＩｇＥを調製し精製して標準ＩｇＥとして用い
た。

ｄ）軽鎖がλ型であるヒトＩｇＥの調製軽鎖がλ型であ
るＩｇＥについてはヒトＩｇＥミエローマ由来細胞株Ｓ
ＫＯ−００７（Ｕ　−２６６＾Ｒ１）（ＡＴＣＣＮａ　
ＣＲＬ　８０３３　）の培養上清から調製した。

ＳＫＯ−００７細胞を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ
　−１６４０培地中で大量に培養し、その培養上清を遠
心分離によって集め精製してλ型軽鎖のＩｇＥの標準抗
原として用いた。

本発明の抗体の軽鎖の異なるＩｇＥの認識について調べ
た。

本発明の抗体（２０μｇ／ｍｌｌ　）を９６ウエルプレ
ートに実施例１と同様にしてコートした後、１％ＢＳＡ
で処理して分析用プレートを作製した。

これに、前記１ｇＢサンプル（に型軽鎖のＩｇＥ、λ型
軽鎖のＩｇＥ、ε鎖、ヘキス１〜社血清ＩｇＥ）を添加
して２時間反応させた。プレートを洗浄後ホースラディ
ツシュパーオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥヤギ血清（カ
ペル社）を添加し、更に２時間反応させた後、プレート
をよく洗浄し、前記実施例と同様に発色させ、そのＯＤ
４０５ｎｍを測定した。

ｉ）血清ＩｇＥに対する反応性 に型及びλ型の軽鎖のＩｇＥいずれも含む血清ＩｇＥを
本発明の抗体と反応させた。第３図に示ずごと＜２５Ａ
３．２５Ｂ４．１０Ｅ４．７Ｄ５いずれの抗体も反応し
た。なお、同図は、ＩｇＥ量（横軸）に対して、ＥＬＩ
Ｓ＾における発色（ＯＤ　４０５ｎｍ）をプロットした
ものである。

ｉｉ　）に型軽鎖■ｇＥに対する反応性参考例２の方法
より作製したに型軽鎖のＩｇＥと本発明の抗体との反応
性を見た場合も、２５Ａ３゜２５Ｂ４，１ＯＥ４．及び
７Ｄ５のいずれも反応した（第４図）。

ｉｉｉ　）　λ型軽鎖遺伝子に対する反応性前記のよう
にλ型軽鎖１　ｇ　Ｅ　（ＳＫＯ−００７培養上清）と
本発明各抗体との反応性を見た場合では、第５図に示す
ように、１０Ｅ４．及び７Ｄ５はいずれも反応している
が、２５Ａ３．及び２５Ｂ４は、λ型軽鎖のＩｇＥとは
反応せず、前記ｉｉ）項に示ずごとくに型軽鎖ＩｇＥに
対して特異的に反応するものである。

ｉｖ）ＩｇＥの重鎮（ε鎖）に対する反応性参考例１の
方法により、Ａ３細胞（ε遺伝子による形質転換細胞）
の細胞溶解液として調製したε鎖と本発明の各抗体との
反応性を調べた（第６図）。１０Ｅ４．及び７Ｄ５はい
ずれもε鎖と反応し、ＩｇＥ重鎮特異的なものであるこ
とが示されたが、２５Ａ３．及び２５Ｂ４はε鎖とは反
応せず、前記ｉｉ）項に示すごとくその軽鎖がに型であ
るＩｇＥのみと反応するものであることがわかった。

以上のように、本発明の抗体は、ＩｇＥのε鎖に特異性
を示す（従ってに型及びλ型いずれにも反応する）抗体
１０Ｅ４．及び７Ｄ５等と、軽鎖がに型のＩｇＥに対し
てのみ特異性を示す抗体２５Ａ３．及び２５Ｂ４等とに
分けられる。これは前記実施例３のグループ分けに対応
するものである。

大嵐炎−ｔ　ヒトＩｇＥ（７）議定 ■）分析用プレートの調製 ９６ウエルのプレート　（ヌンク社）の各ウェルごとに
コーティング緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＨＣＯｓ　　。

５０　ｍ　Ｍ　ＮａｚＣＯｓ　　、ｐＨ９，７〜１０）
に溶解した抗体（７Ｄ５．１０Ｂ４．２５Ａ３．２５Ｂ
４．）（２０，ｃｒｇ／ｍｊ！　）を５０μｌずつ各ウ
ェルに分注し、室温で２時間放置後ＰＢＳ　（）−Ｔｗ
ｅｅｎで３回洗浄を行った。

ついでＰＢＳ　（−）［１％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）含有）を加え２時間放置した後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（−
）　−Ｔｗｅｅｎでさらに洗浄を行うことにより分析用
プレートを調製した。

ここで、ＰＢＳ　（）−Ｔｗｅｅｎは、前記ＰＢＳ（−
）にＴｗｅｅｎ　２０　（０，５ｍｎ　／　＃）を添加
したものである。

２）標準抗原（ヒトＩｇＥ）の調製 軽鎖が各々に（カンパ）型、又はλ　（ラムダ）型であ
るヒトＩｇＥを前記実施例と同じ方法で調製した。

３）キ」二ＬＬ旦１１町む 軽鎖の異なるそれぞれのヒトＩｇＥ標準抗原を用い以下
のような手順で本発明のし）ＩｇＥ測定法の為の標準曲
線を作成した。なお、に型ＩｇＥおよびλ型ＩｇＥのい
ずれも、８０１Ｕ／ｍ＃から２倍段階稀釈して用いた。

まず、上記１の分析用プレートの調製の方法に従って、
９６ウエルプレートに７Ｄ５．１０Ｅ４．２５Ａ３　、
又は２５Ｂ４を固相化し、これに各ＩｇＥ標準抗原を、
０．２％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で稀釈した溶液５０
μｌずつを注入した。そして、２時間室温で放置後ＰＢ
Ｓ　−Ｔｉ１ｅｅｎ２０で３回洗浄を行った。次いで、
ホースラディツシュパーオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＥ
ヤギ血清（カペル社）を０．２％ＢＳＡ　−ＰＢＳで１
５０倍に稀釈したものを５０μβずつ各ウェルに注入し
た。２時間室温で放置後、ＰＢＳ　−Ｔｉ４ｅｅｎ２０
で５回洗浄を行った。ついで、０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，２）にＡＢＴＳ　（２、２’−アジノビス（
３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸）を２
．５　ｍ　Ｍになるように溶解し、過酸化水素を５ｍＭ
になるように添加したものを各ウェルに１００μｌずつ
注入した。２０分間反応後、２ｍＭＮａｆＪ＋　　１０
０　ＩＩ　ｊｌ！を各ウェルに加え反応停止したのち、
吸光度（ＯＤ４０５ｎｍ　）を測定した。この時得られ
た標準曲線を第４図及び第５図に示す。

ｉ）に型軽鎖から成るヒトＩｇＥの測定参考例の方法に
より作製したに型軽鎖から成るヒトＩｇＥについて、本
発明の方法により測定した場合、第４図に示すごとく、
いずれのモノクローナル抗体を用いた場合でも検量線が
得られた。

に型軽鎖から成るＩｇＥを含むサンプルの測定が可能で
あった。

ｉｉ）に型及びλ型軽鎖から成るヒトＩｇＥの測定 前記のごと（５ＫＯ−００７細胞培養上清から調製した
λ型軽鎖から成るヒトＩｇＥについて本発明の方法によ
り測定した場合、第５図に示すごとく、７Ｄ５．及び１
０Ｅ４は反応し検量線を与えたが、２５八３．及び２５
Ｂ４はまったく反応しなかった。

従って、７Ｄ５．及び１０Ｅ４はに型の場合と同様λ型
軽鎖から成るヒトＩｇＥを含むサンプルを測定した場合
、に、λの両型のＩｇＥの総量として測定できるのに対
し、２５Ａ３．及び２５Ｂ４では、に型軽鎖から成るＩ
ｇＥにだけしか反応しないことから、に、λ両型のＩｇ
Ｅが存在するサンプルでもに型軽鎖のＩｇＥだけを測定
できる。

ヌ■１舛−コ。

次の要素からなるキットを作成した。

キットＡ （ａ）　抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体から成る第１
の抗体５０μｇ：凍結乾燥物／１プレート分。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）（ｂ
）上記ヒトＩｇＥの第２の抗原決定基と結合することが
できる抗体１．５　ｍｇを１．５噌の西洋ワサビパーオ
キシダーゼで標識した抗体１０μｌを凍結乾燥したもの
／１プレート分（使用時に０．２％ＢＳＡ／ＰＢＳ　（
−）で溶解し、４ｍＡとする）。

（ｃ）前記第１モノクローナル抗体を固定化することが
できる９６Ｆヌンク一イムノプレート１枚。

（ｄ）標準品として精製されたヒトＩｇＥ１■／ｍ＃（
１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−））　１００μｌの凍結乾
燥物（ヒトＩｇＥ０．１■）　〔使用時この全量を１ｍ
ｌの水で溶解しく１００μｇ／＋１りこの液を０．２％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−）で稀釈して標準液とする〕。

その他の試薬（場合によってはキラ１へに含める）（ｅ
）第１モノクローナル抗体プレートへの固定化液：　０
．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｉ　　、　５０　ｍＭ　Ｎａｚ
ＣＯ＋（ｐ）１９．７〜１０．０）　５　ｍｌ！　。

（ｆ）第２抗体の稀釈液及びサンプル稀釈液：０．２％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（）２０ｍｎの凍結乾燥物（使用時
に蒸留水２０ｍ１で溶かして使用）。

（ｇ）発色基質：　１０ｍｇＡＢＴＳ　（粉末）／１ブ
レート分 （ｈ）発色基質溶解液：　　（ｐＨ４，２）　　１０ｍ
＃の凍結乾燥物（使用時に１０ｍｊ！の蒸留水で溶かし
使用する）。

（＋）反応停止液：２ｍＭアジ化すトリウム液１０ｍ＃
０ （ｊ）ブロッキング液：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−）３
０ｍ＃を凍結乾燥したもの（使用時に蒸留水３０ｒｒ＋
７！で溶かして使用）。

（ｋ）洗浄液：０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ
　（−）１４０ｍ　７！。

注）１１□０゜：現地調達。

キットＢ （ａ）抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体から成る第１抗
体（１０μｇ／ｍβコーティング緩衝液）を５０μβづ
つ９６Ｆヌンク−イムノプレートの各ウェルに分注し、
室温で２時間反応させた後、洗浄液で３回洗浄し、１％
ＢＡＳ含有ＰＢＳ　（−）３００μｌ／ウエルで分注し
て、室温で２時間反応させた後、再度洗浄液で３回洗浄
したもの。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）（ｂ
）キットＡの（ｂ）　と同様。

（ｃ）キットＡの（ｄ）　と同様。

（ｄ）キットＡの（ｅ）と同様。

（ｅ）キットＡの（ｆ）　と同様。

（ｆ）キットＡの（ｇ）　と同様。

（ｇ）キットへの（ｈ）と同様。

（ｈ）キットＡの（ｉ）と同様。

（ｉ）キラｌ−Ａの（ｊ）と同様。

（ｊ）キットＡの（ｋ）と同様。

注）１１□０□：現地調達 ヒト精液１ｍｎに２％２−メルカプトエタノール（２−
ＭＥ）　、０．ＯＩＭ　　ｌ−リス塩酸緩衝液（以下Ｔ
ｒｉｓ−１１（Ｊ！　）　ｐＨ８，０、０，１Ｍ　Ｎａ
（Ｊ！　、０．ＯＩＭＩＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳ
よりなる溶液１４ｒｒｌを加え５０°Ｃで３０分間保温
した。ついでこの溶液に最終濃度が０．２　ｍ’　ｇ　
／μβとなるようにプロテアーゼＫ（ベーリンガー・マ
ンハイム社）を加え、２時間反応後、水飽和エタノール
を添加したのちさらにフェノールを添加した。ついで遠
心操作により水相を回収したのち、２．５倍容のエタノ
ールを加え生ずる沈殿（遺伝子）を得た。そしてこの沈
殿を０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｊ２　　（ｐＨ８，
０）　、１　ｍＭＥＤＴＡ溶液１ｍＩ溶液１溶Ｉ！た（
３３０μｇ　／　ｍｎ　）。

ついで上記遺伝子５０μｇを制限酵素ＢａＩＩＩＨＩ（
タカラ）〔以下制限酵素は下線を付しＢａｍ旧のような
記載とする。〕　８０ユニットで消化した。

ついで１０−４０％シヨ糖密度勾配遠心（日立ＲＰＳ２
７−２．２７ｋｒｐｍ、　２４時間）を行って遺伝子断
片のサイズ分画を行った。得られた両分の一部をアガロ
ースゲル電気泳動に付し約３　ｋｂｐの断片を含む両分
（１，７６μｇ　／ｒｒｌ　）（以下Ｆ　Ｂａｍ旧断片
」とする。）を回収した。なおこの両分はヒトε１遺伝
子断片を含むものである（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎ
ａｌ、上、６５５（１９８２）　）。

２、゛　　云　ライフ゛う１−のｇ、′プラスミドｐＢ
Ｒ３２２（微工研条寄第２３５号；但しＥ、コリに１２
Ｃ６００（ｐＢＲ３２２）として寄託〕　３μｇをＢａ
ｍ　ＩＩＩで消化後、アルカリ性ホスファターゼ（タカ
ラ）を用い６５℃、３０分間処理を行った。ついでフェ
ノール抽出２回、エーテル抽出５回を行い常法に従って
クローニングヘクターを調製した。

このクローニングヘクターと上記Ｂａｍ　Ｈ１断片とを
（モル比１　：　１）Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ）を
用いて連結し組換えＤＮＡを得た。ついでこの組換えＤ
ＮＡを用い大腸菌に１２Ｃ６００（微工研条寄第１１５
号）の形質転換をクシュナー法（ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９７８，１７（１９７８）　）に
従って行った。

そして２．５　Ｘ　１０５ＣＦＵ／μｇＤＮＡのライブ
ラリーを得た。

３．１０−ブのＬす 上記Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌをもとに下記で示
される２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを固相合成法（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
　、　　８　．５４９Ｈ１９８０））　　により調製し
た。なお、このフラグメントはヒトε、、遺伝子の３′
−非翻訳領域に対応するものである。

５　　’　　−ＴＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧ
ＣＴＧ−３’４、　ε１゛　云　のスクリーニング 上記ヌクレオチドをプローブとしてε、遺伝子のスクリ
ーニングを下記の方法に従って行った。

上記プローブ２０ピコモルをｒ　−”Ｐ、ＡＴＰ（ＮＥ
Ｎ社）９０μＣｉとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ヘ
ーリンガー・マンハイム社）とを用いて″′Ｐ標識し３
　Ｘ　１０’ｃｐｍ／　２０ピコモルの標識化合物を得
た。そしてこれを用いコロニーハイブリダイゼーション
を行い所望の形質転換体を得た。ついでこの形質転換体
からプラスミドを調製したのち、制限酵素切断パターン
の確認およびマキサム・ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５　、４９９−５６
０（１９８０）　）による塩基配列の決定を行ったとこ
ろ前記Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌと一致しており
、本プラスミドはヒトε１遺伝子を含んでいることが確
認できた。ここで得られたプラスミドをｐＯ３ＤＥ２３
４　（第７−（ａ）図〕と称する。同図中斜線部分が６
１遺伝子であり、Ｃ旧〜ＣＨ４は定常領域のドメインを
示すもの　　　・ ５ＫＯ−００７（Ｕ−２６６ＡＰＩ）　　（＾ＴＣＣ隘
ＣＩＩＬ８０３３　）　１０　”個からＴ９Ｍａｎｉａ
ｔｉＳらの方法〔底置ｒ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ　Ｊ−へルａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　
）に従って細胞ＤＮＡ約１ｍｇを得た。

２、′　　云　ライフ゛−１−の工、′−上記細胞ＤＮ
Ａ２０．ｌｊｇを５ａｆｆｌ（タカラ）２４ユニツト、
恥ｏＲＩ□（タカラ）１８ユニツトで消化したのち０．
４％アガロースゲル電気泳動（４０Ｖ、１．５時間）を
行った。そしてＢｋｂ付近のゲル回収後、電気溶出によ
り３．４μｇＤＮＡ／ｍｌｌの細胞ＤＮＡを回収した。

一方、プラスミドｐｔｌｃ１３　　（ファルマシア社）
１０μｇをＥｃｏＲＩおよびＳａｊ！Ｉで消化したのち
、セファロースＣＬ−６Ｂカラムを用いて長い方のＤＮ
Ａ断片（３，４μｇ／ｍ１）を回収した。ライで前記と
同様にこの断片と上記細胞ＤＮＡとを結合して組換えＤ
ＮＡとし、これを用い大腸菌に１２Ｃ６００の形質転換
を行い、形質転換体（８Ｘ１０４ＣＦＵ／μｇＤＮＡ）
を得た。

３、　プローブの８．′ ２０μｇの前記プラスミドｐＯ５ｒｌＥ２３４をＢａｍ
ＨＩ（タカラ）およびｈｌＩＩ　にソポンジーン）で消
化したのち６％ポリアクリルアミ「ゲル電気泳動（１０
０Ｖ　、　２時間）を行い常法に従ってＤＮＡ断片（約
１μｇ）を回収した。ついで二ツクトランスレーション
キット（ＢＲＬ社）を用いこの断片を３２ｐ［識化して
プローブを調製した（３Ｘ１０７ｃｐｍ　／μｇＤＮＡ
）。

４、　　ＶＤＪ’　　云　のスクリーニング約２５００
個の形質転換体のコロニーより上記プローブを用いてハ
イブリダイゼーションを行いポジティブなりローンを得
た。そして前記と同様にプラスミドを調製したのち制限
酵素切断パターンの確認および塩基配列の決定を行い（
これらの結果は前記Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌｓ
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、頚、　３８３４（１９Ｂ２）、１ｂｉｄ　、頚
、　６６６１　（１９Ｂ２）とよく一致していた。）目
的とするＶＤＪ遺伝子が存在することを確認した。そし
てこのＶＤＪ遺伝子を含むプラスミドを以下ｐＦ２０８
　（第８図）と称する。

同図中、ＣおよびＬＶは下記を意味する。

Ｃ；定常領域（Ｃε１）の一部 ＬＶ；リーダー（シグナル）配列領域および可変領域 Ｃ０Ｈ８゛″゛云の プラスミドｐＯ５ＩＩ２２３４１μｇおよびプラスミド
ｐＵｃ１３　（ファルマシア社）１μｇ各々をＢａｍ１
（Ｉで消化したのち、モル比ｌ：ｌでこれらを混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて処理した。そしてε。

遺伝子の方向がｐＵｃ１３の有するＡａｃＺ遺伝子と同
一方向にあるプラスミドｐＯ５ＤＥ１２３４Ｕ　　（第
７図（ｂ）〕を得た。

次にｐＯ３ＤＥ１２３４Ｕ　ｌ　０８ｇ　、　ｐＦ２０
１３１０μｇ各々をＥｃｏＲＩおよび５ａＩｌＩで消化
したのち、０．６％アガロースゲル電気泳動（６０ｖ、
２時間）により各々のプラスミドよりＤＮＡ断片を回収
した。

ｐＯ５ＤＥ１２３４＋１からはε、遺伝子（３μｇ）を
、ｐＦ２０８からはＶＤＪ遺伝子（５μｇ）を回収した
。ついでこれら遺伝子断片をモル比１：１で常法に従っ
て連結した（断片Ａ）。

２・　　−え　　５Ｖ３ｎｅｏ−ｅ　、　　の１１１ｐ
ＳＶ３−ｎｅｏ　（Ｊ、ＭＯＬ、ａｐｐｉ、　Ｇｅｎｅ
ｔ、上、　３２７（１９８２）　；ポール・バーブ氏よ
り人手可能〕３μｇをＥｃｏＲ１で消化したのちアルカ
リ性ホスファターゼで処理（６５℃９６０分間）を行っ
た。ついでフェノ−る抽出、エーテル抽出を行ってＤＮ
Ａ断片（断片Ｂ）を回収した。そして常法に従って断片
ＡをＥｃｏＲＩ処理した断片と断片Ｂとを結合し組換え
ＤＮＡを得た。そしてこれを用い常法に従い宿主菌（Ｅ
、ｃｏｌｉ、に１２Ｃ６００）の形質転換を行ったのち
、前記プローブを用いてコロニーパイプリダイゼーショ
ン法でポジティブな形質転換体１２個を得た。

そしてこの形質転換体からプラスミドを調製したのち、
ＢａｍＨＩ　、　Ｉ’！ｃｏＲＴ　、　１ＩｉｎｄｌＩ
ＩおよびＰｓｔｌによる切断パターンを検討した。そし
てプラスミドベクターｐＳＶ３−ｎｅｏにあるＳＶ４０
のＴ抗原遺伝子に対して逆方向に抗体遺伝子がクローニ
ングされているプラスミド４個を得た。そしてこれを遺
伝子発現用の組換え体とした。以下これをプラスミドｐ
ＳＶ３−ｎｅｏ−Ｃ１（第９図）と称する。このプラス
ミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　／　ｐＳＶ３−ｎｅｏ−ε
鵞は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８
９０４号（ＦＥＲＭ　Ｐ８９０４）として寄託されてい
る。

同図中、ＳＶ４０−Ｔａｇは、５Ｖ４０Ｔ抗原遺伝子を
示し、５Ｖ４０−ｏｒｉは、ＳＶ４０複製開始点を示し
、Ｎｅｏｒはネオマイシン耐性（ゲンタマイシン、ネオ
マイシンおよびナカマイシンに’に４４Ｄする構造を有
するアミノグリコシド系抗生物質に耐性）遺伝子を示し
、ＬＶ、Ｃは各々リーダーおよび可変領域、定常領域（
ε、）を示す。

３、　　　７　　　云　　　　　のれ　　１１上記プラ
スミドｐＳＶ３−ｎｅｏ−ε＋　　２０　＃−ｇをエタ
ノール沈殿に付し、７０％エタノールで洗浄後５００μ
ｌの水に溶解した。

ついでこれに２５０　ｍ　Ｍ　ＣａＣｊ！　ｚ　　５０
０　／Ｉ　ｊ２を添加したのち、２８０ｍＭ　Ｎａ（１
、５０’ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅ
　ｔｈｙ　ｌｐｉ　ｐｅｒａｚ　１ｎｅ−Ｎ　’　−２
−ｅ　ｔｈａｎｅｓｕ　ｌ　ｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　シ
グマ社）　　１．５　ｍ　Ｍ　ＮａＪＰＯ４（ｐＨ７，
０５）の混合溶液１．Ｑｒ１２を５分以内に１００μβ
ずつ連続添加しリン酸−カルシウム−ＤＮＡの微細沈殿
を得た（以下「微細沈殿」）一方、宿主としてＰ３Ｕ１
細胞（マウス１ｌｆｆｉ瘍細胞；フロー社）］、５Ｘ１
０６個を遠心洗浄後、ｐｅｌｌｅｔとした。これに上記
微細沈殿を添加後５分間攪拌したのち３０分間静置した
。ついでこれに完全培地（１？ＰＭ１−１６４０培地（
１０％牛脂児血清含））１０ｍ＃を添加したのち、９６
ウエルプレート（ヌンク社）に０．１２ｍ１／ウエルの
割合で分注したのち一夜室温で放置した。そして放Ｎ後
ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＯＧ４１Ｂ（ギブコ社）　２０００
μｇ　／ｍｌを０．１２ｍ／　／ウェルの割合で添加し
炭酸ガスインキュベーターに放置した。

１５日後に９６ウエル中からｌウェルの良好な増殖を示
す形質転換体Ａ−３を得た。

４、Ｈｔ″゛　　公子　　のＵ ９６ウエルのイムノプレート０　（ヌンク社）に５００
倍稀釈したヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（カベル社）５０μＩ
ｌ／ウエルの割合で固定化した。ついでこれをＰＢＳ（
−）−Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄（以下洗浄にはこれを用
いる）後、ＩｇＥを含む試料（５０μＩｌ／ウエル）と
２時間反応を行った。

反応終了後、ボースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＰ
Ｏ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（カペル社）の１０００
倍稀釈液５０μｌ／ウェルを添加し２時間反応を行った
。反応終了後、洗浄し、０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ４，２）、八ＢＴＳ　（２，５ｍＭ）　、Ｈｚ（ｈ５
ｍＭよりなる基質溶ｉ　１００μ７！／ウエルを添加し
５〜１５分間室温で反応を行った。２ｍＭＮａＮ、。

を１００μｌ／ウエルの割合で添加して反応を停止させ
たのちＯＤ４０５ｎｍをタイターチック・マルチスキャ
ン０　（フロー社）で測定し、ＩｇＥ、ＨＣ鎮の検出を
行った（以上ｒＥＬＩｓＡ法」）。

なお、ここで用いた試料としてはＡ−３培養上清原液及
び１０倍濃縮液、Ａ−３細胞溶解液（Ｃｅｌｌ　Ｉｙｓ
ａｔｅ；セル・ライゼイト）を用いた。なお、Ａ−３細
胞溶解液は以下のようにして調整した。Ａ−３細胞を、
Ｇ４１Ｂ　８００．１４　ｇ　／　ｍ　Ｉｔ含有完全培
地で培養し、２．６Ｘ１０’個の細胞を回収した。

ＰＢＳ　（−）を用いてこの細胞を２Ｘ１０７細胞／ｍ
ｊ２？１１度に調製した。ついで、ＰＢＳ（−）中２％
（Ｖ／Ｖ）ノニデソト（Ｎｐ−４０）を先の細胞懸濁液
の１７３量添加（最終濃度ＮＰ−４００，５％）し、攪
拌後、不溶物を遠心除去した。そして可溶部分はＰＢＳ
（−）に対して透析した。透析物はその後凍結乾燥し、
水を添加して４ｍｎの溶液とした。この細胞溶解液およ
び培養上清のＩｇＥを測定したところ、培養上清中には
ＩｇＥが認められず、Ａ−３はＨＣ鎖を細胞外に分泌し
ていなかった。一方、Ａ−３細胞溶解液についてば、標
準ＩｇＥタンパクを基準にした場合、（６，４μｇ　Ｉ
　ｇＢ／１０６細胞個）相当量の存在を認めた。このこ
とから、Ａ−３細胞中で、ｐＳν３−ｎｅｏ−ε１が発
現しε鎖を合成しているものの細胞外には分泌されてい
ないことが確認された。

貴１」（−圀 抗緑膿菌ヒト型モノクローナル抗体のＬ鎖遺伝子を調製
し、これを遺伝子工学的手法によって分泌発現させた。

特開昭６１−９１１３４号公報に開示された方法に従っ
て緑膿菌Ｆ４に対するモノクローナル抗体産生細胞Ｇ３
−Ｇ３−１（ｒ□７に）を得た。

Ｇ３−１細胞ｌＸｌ０’個を１０ｒｒｌの緩衝液中（０
，５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）、　１００μｇ／ｍ
ｊ！プロテアーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社）、０
．５％ザルコシルで５０℃にて３時間処理した後、等量
の水飽和フェノールを加えた。ついで遠心（８０００Ｘ
　ｇ、　　Ｉ　０分間）により水相を分離し、これを５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！　）　（
ｐｌ＋８．０＞　、１０ｍＭ　ＲＤＴＡ　、１０ｍＭ　
ＮａＣＲに対して透析した。これに加熱処理したりボヌ
クレアーゼＡ（ベーリンガーマンハイム社）を終濃度が
１００μｇ／ｍ７！になるように加え、３７℃で３時間
処理したのち、再度上記と同様にフェノール抽出、透析
を行って７１２μｇ／ｍｌｌの染色体ＤＮＡ（Ｇ３−］
−ＤＮＡ）を得た。

一建と」」「店Ｊ支町 上記Ｇ３−ｌＤＮＡ１０μｇを、制限酸素ＥｃｏＲＬ又
はＢａｍ１１１　　にソポンジーン社）のいずれかを用
いて３７℃で２時間消化を行った。消化後、０．８％ア
ガロースゲル電気泳動を行いＤＮＡ断片を分離した。つ
いでここで得られたりルを０．２５Ｎ　）ＩＣ！で１５
分間、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ７１，５Ｍ　ＮａＣｊ！で
３０分間、０．５　ＮＴｒｉｓ−１ｉｃｋ！　（ｐＨ７
，４）−１，５Ｍ　ＮａＣｊ！で３０分間処理した。つ
いで２０ｘＳＳｃ（０，３Ｍクエン酸ナトリウム、３Ｍ
ＮａＣｊりを用い、ニトロセルロースフィルター（Ｓ＆
Ｓ社）へＤＮＡをトランスファーした。

一方、染色体ＤＮＡ上のヒトに鎖の定常領域（Ｃに）を
コードするコード領域については、塩基配列および制限
酵素ＥｃｏＲＴで消化した場合、約２．５ｋｂの断片に
Ｃにコード領域が含まれていることが知られている［Ｃ
ｅ１ｌ　、　２２．１９７−２０７（１９８０）　）。

従って、このＣにコード領域を含むＥｃｏＲＩ消化ＤＮ
Ａ断片を得、２．５　ｋｂ断片０．５μｇをプローブと
して使用するためにニックトランスレーションキラ）（
ＢＲＬ社）で３２ｐ標識化した。

そして、これと上記フィルターとのサザンハイブリダイ
ゼーションを行った。このときの結果を第１０図に示す
。同図中、数値は、塩基対の長さを示し、ＥｃｏＲＩお
よび動態Ｉは、この制限酵素を用いて消化したことを意
味する。この結果よりＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨｒで消化
したＤＮＡ遺伝子については各々、約２．５　ｋｂｐお
よび８．５　ｋｂｐにバンドが確認できた。なお、ＶＪ
再構成していない場合の染色体ＤＮＡはＢａｍＨＩ消化
によれば約１０ｋｂｐにバンドを与えることが知られて
いる（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５７　　、１５１６−１
５２２（１９８２）　）この方法によってヒトＣにＤＮ
Ａ断片を含む。従って、Ｂａｍｔｌ　Ｉ処理により得ら
れた８、　５　ｋｂｐのＤＮＡ断片は再構成されたＶＪ
−コード領域を含むＬ鎖コード領域を含有するＤＮＡ断
片であることが確認された。

（３）゛　　公子ライフ゛ラリ−の８周１１Ｇ３−ＩＤ
ＮＡ２０μｇを回Ｉで消化したのち、１０−４０％シヨ
糖密度勾配遠心（日立１？Ｐｓ４０Ｔ３５ｋｒｐｍ、１
４時間）によりザイズ分画を行った。ついでアガロース
ゲル電気泳動およびＤＮＡドソトハイフ゛リダイゼーシ
ョンによって目的とするＤＮＡ画分（ハｍ１１１消化し
た７〜９ｋｂ断片）を回収した（４μｇ／ｍｌ）。

他方、プラスミドｐＵｃ１３　（ファルマシア社から市
販されている）をＢａｍＨＩで消化し、アルカリ性ホス
ファターゼで処理して線状プラスミドを調製した。

次に、これと、上記ＤＮＡ画分との反応をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造）を用い、４℃、−晩行い、得られた組
換えＤＮＡを用いて大腸菌に１２Ｃ６００の形質転換を
行って０３−１遺伝子ライブラリー（２Ｘ　１０５Ｃ１
’ｌＪ／μｇＤＮＡ）を作成した。

（４）Ｌｆ　ＤＮＡ１７）スクリーニング形質転換され
た上記大腸菌５ｘｉｏ’個をコロニーハイブリダイゼー
ション法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ）に従って、前記
の３２ｐ標識化ヒトＣに遺伝子をプローブとして用いて
、■、鎖をコードするＤＮＡ断片が挿入されたプラスミ
ドを選択し、このプラスミドをｐＧ３１ＶＫと命名した
。

（５）１、　　　占ｌズの乍 上記プラスミドｐＧ３１ＶＫをＥｃｏＲＩ　、　Ｂａｍ
１ｌ　ＴおよびＨｉｎｄｎ［にソボンジーン社）で、消
化し、切断パターンの解析を行った。また、可変領域（
ＶＪ）を含むｌ１ｉｎｄｌｌＩ断片（約２．９ｋｂ）を
プラスミドｐＵｃ１３　（ファルマシア社）のＨｉｎｄ
［［サイトへクローニングした（以下ここで得られたプ
ラスミドはｐＧ３１ＶＫ−Ｈ２とする）　、　ｐＧ３１
ＶＫ−１（２をＳａｔ　Ｉ　、Ｐｓｔｌｌ又はＮｃｏｌ
にソポンジーン社）で消化し、制限酵素切断地図を作成
した。そのときの結果を第１１図に示す。この図中、Ｖ
Ｊば可変領域をコードするコード領域を示し、Ｃには定
常領域をコードするコード領域を示す。最上段の数値は
ＤＮＡ断片の長さを示す。

この図から明らかな様に、このＤＮＡ断片は完全なＶＪ
コード領域およびＣにコード領域を含んで成る。

μＩＬＩ削唱灸定 ｐＧ３１ＶＫ−Ｈ２をＰｓｔｌで消化して得られる断片
を、プラスミド９０Ｃ１３のＰｓｔ１部位ヘリクローニ
ングした。このリクローニングで得られるプラスミドの
Ｂａｍ１ｌ　Ｉおよびｔ１ｉｎｄｌｌ＋部位、またｐＧ
３１ＶＫ−１１２（７）Ｎｃｏ１部位を″′Ｐ標識した
のち、マキサム・ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　１１ｎｚｙｍｏｌｏｇＶ　６５４９９−５６０　（１
９８０））により、塩基配列の決定を行った。

（７）データーの” 塩基配列決定の結果を第１２図に示す。第１２−１図及
び１２−２図はＶＪ−コード領域及びその近傍の塩基配
列を示す。この配列は５′非コード領域、リーダー配列
（して示す）、■−コード領域（■で示す）、Ｊ−コー
ド領域（Ｊで示す）、及びそれに続く３′非コード領域
を含む。

塩基配列下段の一文字のアルファベントは、アミノ酸の
略号であって下記を意味する。

Ｎ：Ａｓｎ　　　、Ｓ：５ｅｒ Ｄ　：　Ａｓｐ　　　　Ｅ　：　ＧｌｕＣ：Ｃｙｓ　　
　　Ｐ：Ｐｒ。

Ｌ：Ｌｅｕ　　　　　　Ｈ：Ｈｉｓ Ｇ：Ｇ］ｙ　　　　Ｙ：Ｔｙｒ Ｖ　：　Ｖａｌ　　　　Ｍ、：　Ｍｅｔｌ：Ｉ］ｅ　　
　　Ａ：Ａｌａ Ｋ：ＬｙＳ　　　Ｑ：Ｇｌｎ Ｒ：Ａｒｇ　　　　Ｗ：Ｔｒｐ Ｆ：Ｐｈｅ また、アミノ酸配列中、二重下線を付された部分は、抗
原の結合に必要とされる領域である。

ヒト免疫グロブリンに鎖のＶＷ４域は、大きく４つのサ
ブグループに分類されている〔たとえば、日本生化学余
線、生化学データブックＩＩｐ１０２２　）。

そして、本発明により決定された領域は、サブグループ
■に属することが示唆される。なお、塩基配列第１２図
において上に示した塩基階で、８２１位のＳｅｔは、本
来のサブグループ■ではＰｈｅであること以外は全てサ
ブグループ■と同一である。

そして塩基配列の下のアルファベット中口で囲んでいる
ものは、サブグループ■に特徴的なアミノ酸である。

ｐＳＶ２−ｇｐｔ　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ
、ｓｃｉ、、ＵＳ＾、７Ｂ、２０７２（１９８１）　：
ポールバーブ氏より入手〕をＢａｍＨＩで消化した断片
と、ｐＧ３１ＶＫをＢａｍ１ｌＩで消化した断片とを常
法に従って連結し、Ｌ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＧ３
１ＶＫ−ｇｐｔ　（第１３図）を得た。そしてこのプラ
スミドは０項と同様な方法でＬ鎖遺伝子が入っているこ
とを確認した。このプラスミドを含有する大腸菌ニジエ
リシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　１ａｃｏｌｉ）
／ｐＧ３１ＶＫ−ｇｐｔは工業技術院微生物工業波４１
Ｒ研究所に微工研菌寄第８９０５号（ｌ？ＥＲＭ　Ｐ−
８９０５）として寄託されている。

Ｈεｒ′およびＬに言゛′の。

２、形質転換体の調製 前記プラスミドｐＧ３１ＶＫ−ｇｐｔのＤＮＡ４０．１
７ｇをエタノール沈殿後、７０％エタノールで洗浄し、
Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ液１００　ｐ　１２に溶解した。こ
れに５００ｍ　Ｍ　ＣａＣ１ｚ　１００　ＩＩ　１を添
加し、２８０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ、５０　ｍＭ！（ＥＰＥＳ
　、　１．５　ｍＭＮａ、ＩＰＯｎ　（ｐｌ（７，０５
）を含む液２００μβを、攪拌しながら徐々に添加した
。

所用時間は３分間とした。その後３７℃１０分間静置し
、ＤＮＡ−Ｃａ−リン酸沈殿を形成した。一方、宿主と
してのＡ３（Ｐ３旧のｐＳＶ３−ｎｅｏ−ｔ　、形質転
換細胞）ＩＸＩＯ７細胞をＩ？ＰＭ　ｌ−１６４０培地
で洗浄した後ペレットとし、これに、ＤＮＡ−Ｃａ−リ
ン酸液を添加しゆっくり攪拌した。３７℃、３０分間時
々ゆるく振りながら放置し、ＤＮＡを細胞中に取り込ま
せた。１０％生胎児血清を含むＲＰ？１Ｉ−１６４０培
地（完全培地）１０ｍ＃を添加し、さらにＧｅｎｅｔｉ
ｃｉｎ　０Ｇ４１８　（ギプコ社）　　５００μｇ’／
ｍＡ’を含む完全培地に懸濁し、９６ウ工ルプレート８
枚ニＯ，１ｍｊ！／ウェルでまいた。２日後、ミコフェ
ノール酸２０μｇ／ｍ７！、キサンチン２５０μｇ／ｍ
Ｉ！を含む完全培地を０．１ｍｌ／ウェル添加し、選択
した。約２週間後に１ケのウェルで増殖する形質転換細
胞を得た（８Ｂｌ）。この８Ｂ１はＧｅｎｅｔｉｃｉｎ
　０Ｇ４１８１０００　μｇ　／ｍｐ、、ミコフェノー
ル酸２０μｇ／ｍＩｌキサンチン２５０μｓ／ｍｚの存
在下で良好な増殖（平均倍加時間１５〜２５時間）を示
した。

３、　　Ｈ鎖及びＬ鎖遺伝子の発現の確認実施例１及び
２において述べた８Ｂ１培養上清について、ＩｇＥ−Ｅ
ＬＩＳ八およびに−ＩＥＬＩＳへにかけたところ、いず
れにも反応し陽性を認められた。上清中の抗体の産生量
はに鎖として０．５μｇ　／　ｍ　１、ＩｇＥとして０
．３μｇ／ｍｊ２であった。Ａ３では、ε鎖は細胞外に
分泌されていなかったが、８Ｂ１では、に鎖を伴った形
でε鎖も細胞外へ分泌され、ヒトＩｇＥ抗体の分泌生産
する方法が確立された。

なお、ここで得られた８Ｂ１細胞の培養上清を常法（Ｄ
Ｅ’ＡＥセルロースカラムクロマトグラフィー、アフィ
ニティカラムクロマトグラフイー、ゲル濾過等）に従っ
て精製したのち、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に
かけた結果、本発明のヒト型抗体はＨ２Ｌ２タイプのヒ
ト型モノクローナル抗体であることが示唆された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩｇＥに対する１１１５■−標準２５Ｂ４と
各抗体との競合ラジオイムノアッセイの結果を示す。 第２図（Ａ）は、１０Ｅ４（ＩｇＭ）精製のたＤＥ５２
イオン交換ク交換クロマムダラム。 第３図は、各抗体を固定したプレートにおけるヘキスト
社標準ＩｇＥ血清の反応性を調べるためのＥＬＩＳＡの
結果を示す。 第４図はに型軽鎖のＩｇＥに対する各抗体の反応性を調
べるためのＥＬＩＳＡ法の結果を示す。 第５図は、同様にλ型軽鎖のＩｇＥに対する各抗体の反
応性を調べるためのＥＬＩＳＡの結果を示す。 第６図は各抗体のＩｇＥの重鎮を調べるべくＥＬＩＳＡ
を行ったときの結果を示す。 第７図（、ａ）および（ｂ）は、各々プラスミドｐＯ３
ＤＥ２３４およびｐＯ５ＤＥ１２３４Ｕの構造を示す。 第８図は、プラスミドｐＦ２０８の構造を示す。 第９図は、プラスミドｐＳＶ３−ｎｅｏ−ε１の構造を
示す。 第１０図は、サザンハイプリダイゼーションのオートラ
ジオダラム結果を示す。 第１１図は、プラスミドｐＧ３１ＶにおよびＬ鎖ＤＮＡ
遺伝子の制限酵素切断地図を示す。 第１２−１図及び第１２−２図は、Ｌ鎖可変領域の塩基
配列を示す。 第１３図は、プラスミドｐＧ３１Ｖに−ｇｐｔの構造を
示す。 Ｂ／Ｔ 第１図 −・−２８０ｎｍ −〇−４Ｑ５ｎｍ 第２１１　（Ａ） −・−２８０ｎｍ −ｏ−４０５ηｍ −−−−−−−　ＮａＣ１ 第２図（Ｂ） ４０５ηｍ ＩｇＥ（ＩＵ／ｍ１） ４０５ηｍ ＩｇＥ（ＩＵ／ｒ＋ｄ） 第５図 ４０５ηｍ １２．５　　２５　　５０　　１００　　２００ＩｇＥ
（ＩＵ／ｍｌ） 第６図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対して特異的に
   反応することを特徴とする抗ヒトＩｇＥモノクローナル
   抗体。 ２、軽鎖（Ｌ鎖）がκ型であるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ
   型であるヒトＩｇＥの両者に対して反応することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗
   体。 ３、Ｌ鎖がκ型であるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ型である
   ヒトＩｇＥの内いずれか一方のみに対して反応すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のモノクロー
   ナル抗体。 ４、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の免疫化学的測定
   法であって、 （１）ヒトＩｇＥに対して特異的に反応する第１の抗ヒ
   トＩｇＥ抗体を固定化した固体担体とヒトＩｇＥを含有
   すると予想される測定対象試料とを接触せしめる段階； （２）前記段階（１）と同一の段階又は異る段階として
   、前記固体担体を、前記第１の抗ヒトＩｇＥ抗体と結合
   するＩｇＥの抗原決定基と異る抗原決定基に結合する標
   識された第２の抗ヒトＩｇＥ抗体と接触せしめる段階（
   これら第１の抗ヒトＩｇＥ抗体及び第２の抗ヒトＩｇＥ
   抗体の内少なくとも一方はモノクローナル抗体である）
   ；並びに、 （３）前記固体担体に固定された標識、又は固定されな
   かった標識を測定する段階； を含んで成る方法。 ５、前記第１の抗ヒトＩｇＥ抗体として、軽鎖（Ｌ鎖）
   がκ型であるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒトＩｇ
   Ｅの両者に対して反応することができる抗ヒトＩｇＥモ
   ノクローナル抗体を使用し、全ヒトＩｇＥを測定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、前記第１の抗ヒトＩｇＥ抗体として、Ｌ鎖がκ型で
   あるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒトＩｇＥの内い
   ずれか一方のみと反応することができる抗ヒトＩｇＥモ
   ノクローナル抗体を使用し、該モノクローナル抗体と反
   応する型のＩｇＥのみを分別測定することを特徴とする
   特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ７、前記第１の抗ヒトＩｇＥ抗体として、Ｌ鎖がκ型で
   あるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒトＩｇＥの両者
   と反応する抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体を用いて試
   料を分析し、さらに前記第１の抗ヒトＩｇＥ抗体として
   Ｌ鎖がκ型であるヒトＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒト
   ＩｇＥの内いずれか一方のみと反応する抗ヒトＩｇＥモ
   ノクローナル抗体を用いて試料を分析し、これらの結果
   を比較して試料中に存在するヒトＩｇＥがκ型のＬ鎖を
   有するかλ型のＬ鎖を有するかを判別測定することを特
   徴とする、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ８、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対して特異的に
   反応する抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、又は固体担
   体に固定化された前記モノクローナル抗体を含んで成る
   ヒトＩｇＥ測定用キット。 ９、前記モノクローナル抗体が、Ｌ鎖がκ型であるヒト
   ＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒトＩｇＥの両者と反応す
   る抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体である特許請求の範
   囲第８項に記載のキット。 １０、前記モノクローナル抗体が、Ｌ鎖がκ型であるヒ
   トＩｇＥ及びＬ鎖がλ型であるヒトＩｇＥの内いずれか
   一方のみと反応する抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体で
   ある特許請求の範囲第８項に記載のキット。 １１、標識された抗ヒトＩｇＥポリクローナル抗体をさ
   らに含んで成る特許請求の範囲第８項〜第１０項のいず
   れか１項に記載のキット。